用于量化Vibrio Fischeri分离物之间竞争交互的联合孵化测定

Lauren Speare; Alecia N. Septer

doi:10.3791/59759

方法文章

用于量化Vibrio Fischeri分离物之间竞争交互的联合孵化测定

DOI：

10.3791/59759

⸱

2019年7月22日

Lauren Speare¹ , Alecia N. Septer¹

¹Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细菌编码各种机制,参与细菌间竞争。在这里,我们提出了一个基于培养的协议,用于描述细菌分离物之间的竞争相互作用,以及它们如何影响混合种群的空间结构。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本手稿描述了一种基于培养的共生测定,用于检测和描述两种细菌群体之间的竞争相互作用。该方法采用稳定的质粒,使每个种群分别具有不同的抗生素抗性能力和荧光蛋白,用于选择和视觉鉴别。在这里,我们描述了竞争维布里奥菲舍尔菌株的制备和联合孵化、荧光显微镜成像和定量数据分析。这种方法很简单,产生快速的结果,并可用于确定一个种群是杀死还是抑制另一个种群的生长,以及竞争是通过可扩散的分子进行中介的,还是需要直接的细胞-细胞接触。由于每个细菌群体表达不同的荧光蛋白,因此测定允许在混合菌群中对相互竞争的人群进行空间歧视。虽然所述方法使用共生细菌V. 菲舍尔使用针对该物种优化的条件执行,但该协议可以适用于大多数可培养的细菌分离物。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本手稿概述了一种基于培养的方法,用于确定两种细菌分离物是否具有竞争性相互作用。在研究混合种群时,评估细菌分离物相互作用的程度非常重要,特别是分离物是否通过干扰机制直接竞争。干扰竞争是指一个人口直接抑制增长或杀死竞争对手1的相互作用。这些相互作用是重要的识别,因为它们可以有深刻的影响微生物群落的结构和功能2,3。

微生物竞争机制已广泛发现来自不同环境的细菌基因组,包括宿主相关细菌和自由生存细菌4、5、6、7 ⁸^,⁹.已经描述了各种竞争策略10,11包括可扩散的机制,如杀菌化学品1,12和分泌抗菌

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 为联合孵化准备菌株

选择适当的参考菌株,作为联合孵育测定期间细菌竞争的目标。请参阅讨论,了解选择参考应变时的最佳做法以及参考应变将如何影响结果。在此协议中,V.菲舍尔应变 ES114 将作为参考应变。
确定将采用哪些选择和筛选方法来区分共育中的分离物
1. 通常,使用含有不同抗生素耐药性基因(如卡那霉素或氯霉素)的稳定质粒来转化菌株,以为每个菌株选择,以及编码不同荧光蛋白(例如 GFP 或 RFP)的基因,以便直观地进行区分共栽中的菌株类型。
  注:需要使用稳定的质粒,因为如果菌株在没有选择的情况下失去质粒,那么当量化时,该菌株的数量将被低估,并且不能使用荧光显微镜在视觉上检测。
2. 标记硬币孵化V. 菲舍尔利菌株差异,使一个菌株包含质粒 pVSV102,它表示绿色荧光蛋白 (GFP) 和抗生素卡那霉素 (Kan^R) 的耐药性,第二个菌株包含质粒pVSV208,它表示红色荧光蛋白(dsRed)和抗生素氯霉素(Cm R)22的耐药性。
  注:其他差分选择可用于区分凝结菌株。有关其他方法,请参阅讨论。
3. 在联合孵育测定的初始优化过程中包....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了评估细菌群之间的竞争相互作用,为V.fischeri开发并优化了联合孵育测定方案。该方法利用编码抗生素抗性基因和荧光蛋白的稳定质粒,允许每个菌株的微分选择和视觉鉴别。通过分析从共孵化测定中收集的数据,可以识别相互作用的竞争结果和相互作用的机制。例如,使用V.菲舍尔基分离物进行了以下实验。凝结菌株含有两个稳定的质粒之一:pVSV102表示卡那霉素抗性,GFP+,或pVSV208表示氯霉素抗性,DsRed®。在样本数据中,菌株以1:1的比例混合,在LBS琼脂板上孵育5小时。作为一种控制处理,参考菌株的差分标记版本相互结合。实验处理采用参考应变(带压pVSV102)和竞争对手应变1或竞争对手应变2(波林pVSV208)。进行。如上文所述,每个菌株的培养物都进行了制备和孵化,如图1和图2所示。

在

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上述共育测定为发现细菌间竞争提供了一种强有力的方法。这种方法可以识别V.fischeri分离和描述竞争机制之间的特定^竞争19。虽然所述方法针对海洋细菌V.菲舍尔进行了优化,但可以轻松修改,以适应其他细菌种类,包括临床和环境分离物。需要注意的是,竞争机制通常有条件地受到5、6、23、24、25、26、27的制约。^,^28,因此生长条件(如摇动与站立培养、温度等)和介质类型(如含盐量)的微小差异可以显著影响结果。因此,对于不同的细菌.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢审阅者提供的有用反馈。A.N.S.由戈登和贝蒂·摩尔基金会通过授予GBMF 255.03向生命科学研究基金会提供支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher	05-408-129
10 μL 多通道移液器
100 μL 多通道移液器
300 μL 多通道移液器
10 μL 单通道移液器
20 μL 单通道移液器
200 μL 单通道移液器
1,000 μL 单通道移液器
24 孔板	Fisher	07-200-84	带盖无菌
96 孔板	VWR	10062-900	带盖无菌
计算器
氯霉素	Sigma	C0378	原液（乙醇中 20 mg/mL）;培养基中的终浓度（2 &μ;g/mL LBS）
荧光解剖显微镜，带相机和成像软件
镊子	Fisher	08-880
硫酸卡那霉素	Fisher	BP906-5	原液（100 mg/mL 水溶液，过滤灭菌）;培养基中的最终浓度（1 μg/mL LBS）
硝酸纤维素膜（FS MCE， 25MM， NS）	Fisher	SA1J788H5	0.22 &μ;m 硝酸纤维素膜（100 个/包）
培养皿	Fisher	FB0875713	无菌带盖
分光光度计
半微量比色皿	VWR	97000-586
TipOne 0.1-10 μL 启动系统	USA Scientific	1111-3500	10 架
TipOne 200 μL 启动系统	USA Scientific	1111-500	10 架
TipOne 1000 μL 启动系统	USA Scientific	1111-2520	10 架
Vortex
名称	>Company	目录号	评论
LBS 培养基
1 M Tris 缓冲液（pH ~7.5）			50 mL 1 M 储备缓冲液（62 mL HCl、938 mL 去离子水、121 g Trizma 基础）
琼脂	Technical Fisher	DF0812-17-9	15 g（仅添加用于板）
去离子水			950 mL
氯化钠	Fisher	S640-3	20 g
胰蛋白胨		Fisher BP97265	10 g
酵母提取物	Fisher	BP9727-2	5 g

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbi....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

用于量化Vibrio Fischeri分离物之间竞争交互的联合孵化测定

本文内容

摘要

摘要

引言

方案

结果

讨论

披露

致谢

材料

参考文献

重印与许可

标签

相关文章