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方法文章

共培养实验用于量化Vibrio fischeri分离株之间的竞争相互作用

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DOI：

10.3791/59759

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2019年7月22日

 , 
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

本文内容

摘要

细菌编码了多种参与种间竞争的机制。本文介绍一种基于培养的方法，用于表征细菌分离株之间的竞争相互作用，以及这些相互作用如何影响混合种群的空间结构。

摘要

本文描述了一种基于培养的共孵育实验方法，用于检测和表征两种细菌群体之间的竞争性相互作用。该方法利用稳定的质粒，使每个细菌群体分别携带不同的抗生素抗性标记和荧光蛋白，从而实现对两个群体的选择性筛选和可视化区分。本文详细介绍了竞争性Vibrio fischeri菌株的制备与共孵育过程、荧光显微镜成像以及定量数据分析。该方法操作简便、结果快速，可用于判断一个细菌群体是否杀死或抑制另一群体的生长，并可确定竞争作用是通过可扩散分子介导，还是需要细胞间的直接接触。由于每个细菌群体表达不同的荧光蛋白，该实验能够在混合菌落中实现竞争群体的空间分辨。尽管本文所述方法使用共生细菌V. fischeri并在针对该物种优化的条件下进行，但该实验方案可适用于大多数可培养的细菌分离株。

引言

本文描述了一种基于培养的方法，用于确定两种细菌分离株是否具有竞争性相互作用的能力。在研究混合种群时，评估细菌分离株之间相互作用的程度至关重要，特别是判断这些分离株是否通过干扰机制直接竞争。干扰竞争是指一个种群直接抑制另一个竞争种群的生长或将其杀死的相互作用1。明确这类相互作用非常重要，因为它们可能对微生物群落的结构和功能产生深远影响2,3。

已在来自各种环境（包括与宿主相关和自由生活的细菌）的细菌基因组中广泛发现微生物竞争的机制4,5,6,7,8,9。已有多种竞争策略被描述10,11，包括可扩散机制，如杀菌性化学物质1,12和分泌的抗菌肽13，以及依赖接触的机制，后者需要细胞间直接接触，将抑制性效应分子传递至靶细胞9,14,15,16,17,18。

尽管基于培养的共培养方法在微生物学中被广泛使用5,8,19，但本文详细阐述了如何利用该检测方法来表征竞争机制，并提供了将该实验方案适应用于其他细菌种类的建议。此外，本方法还描述了多种数据分析和结果展示的方法，以回答有关竞争相互作用性质的不同科学问题。尽管此处描述的技术此前已被用于鉴定共分离的Vibrio fischeri共生菌株之间种内竞争背后的种间杀伤机制19，但该方法同样适用于多种细菌种类，包括环境分离株和人类病原菌，并可用于评估依赖于细胞接触和可扩散因子的竞争机制。实验方案中的步骤可能需要针对其他细菌种类进行优化。鉴于越来越多的模式系统正在将其研究范围从同基因型生物扩展到包含不同基因型的研究10,16,20,21，本方法将为致力于探究竞争如何影响多菌株或多物种系统的科研人员提供重要资源。

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方案

1. 准备共孵育菌株

  1. 选择一个合适的参考菌株，用于共孵育实验中细菌竞争的靶标。有关选择参考菌株的最佳实践及其对实验结果的影响，请参见讨论部分。在本方案中，V. fischeri 菌株 ES114 将作为参考菌株。
  2. 确定在共孵育过程中用于区分分离株的选择和筛选方法
    1. 通常将菌株转化含有不同抗生素抗性基因（例如 卡那霉素或氯霉素）的稳定质粒，以实现对每种菌株的选择，同时引入编码不同荧光蛋白（例如 GFP 或 RFP）的基因，以便在共培养中通过视觉区分菌株类型。
      注意：必须使用稳定质粒，因为如果菌株在无选择压力下丢失质粒，则该菌株的数量在定量时会被低估，且无法通过荧光显微镜检测到。
    2. 对共孵育的 V. fischeri 菌株进行差异化标记，使一个菌株携带表达绿色荧光蛋白（GFP）并具有卡那霉素抗性（KanR）的质粒 pVSV102，另一个菌株携带表达红色荧光蛋白（dsRed）并具有氯霉素抗性（CmR）的质粒 pVSV20822。
      注意：也可使用其他差异化选择方法来区分共孵育菌株。更多方法请参见讨论部分。
    3. 在共孵育实验的初始优化过程中，应包含以下对照，以确保选择系统的可靠性。将每种差异化标记的菌株分别接种于含有应抑制其生长的抗生素的琼脂平板上（即，将菌株1接种于选择菌株2的培养基上，反之亦然）。
  3. 在共孵育实验前两天，从-80 °C保存菌种中划线接种参考菌株 pVSV102、参考菌株 pVSV208 以及各竞争菌株 pVSV208 至含适当抗生素的 LBS 琼脂平板（例如，100 µg/mL 卡那霉素或 2 µg/mL 氯霉素），并在 24 °C 下过夜培养。必须使用抗生素选择，以确保实验开始时所有细胞均含有质粒。
  4. 实验前一天，从每种菌株类型中挑选四个单菌落（生物学重复），在含适当抗生素的新鲜 LBS 琼脂平板上重新划线，并在 24 °C 下过夜培养。
    注意：此步骤可能需要针对其他细菌种类进行优化，因为根据目标生物的生长速率不同，可能需要更长或更短的培养时间以获得足够的细胞数量。

2. 共同孵育细菌菌株

  1. 孵育前各细菌菌株的准备（图 1A）
    1. 使用无菌牙签从琼脂平板上刮取菌体（量约为一粒米大小），并将菌体重悬于含有 1 mL LBS 肉汤的 1.5 mL 微量离心管中。通过将菌团压向管壁并用力反复吹打，使其充分分散。
    2. 盖紧管盖，涡旋震荡 1–2 秒。若仍可见菌团，继续涡旋或反复吹打，直至样品在视觉上均匀一致。
    3. 对所有样品重复步骤 2.1.1–2.1.2。
  2. 测定并记录所有样品在 600 nm 处的光密度（OD600）。样品可能需要用 LBS 肉汤最多稀释十倍，以获得准确的 OD 值。将每个样品调整至目标 OD600。通常将菌株标准化至 OD600 ~1.0，相当于 V. fischeri 的菌液浓度约为 ~106 细菌/mL。
    注意：由于接种菌液密度会根据竞争机制影响共孵育结果，不同细菌种类可能需要对此步骤进行优化。参见讨论部分了解优化建议。
  3. 共孵育菌株（图 1B、C）
    1. 将参照菌株与竞争菌株按 1:1（v/v）比例混合，分别取 100 μL 已标准化至 OD 1.0 的两种菌液，加入已标记的 1.5 mL 离心管中。作为对照，将参照菌株与其带有不同标记的同源菌株混合（参照菌株 pVSV102 + 参照菌株 pVSV208）。该对照对于后续的统计分析至关重要，用于判断竞争菌株的存在是否影响参照菌株的生长。混合后涡旋震荡 1–2 秒。
      注意：此步骤可能需要优化，因为起始比例会显著影响实验结果，可能需要调整。参见讨论部分了解优化建议。
    2. 对每个生物学重复执行步骤 2.3.1。完成此步骤后，应共获得八个混合菌液管：四个为带有不同标记的参照菌株混合管（对照组），四个为带有不同标记的参照菌株与竞争菌株混合管（实验组）。
    3. 将每个对照组和实验组混合液各取 10 μL 点样至含 LBS 琼脂的培养皿上；这些点样区域将在孵育后用于荧光显微镜观察。
    4. 将点样液在实验台上静置，待其完全干燥，液体完全被琼脂吸收后，于 24 °C 培养 24 小时。对于使用 pVSV102 和 pVSV208 标记的 V. fischeri 菌株，至少需要 15 小时的培养时间，才能达到足够高的细胞密度，以便在群体水平上通过荧光解剖显微镜观察到 GFP 和 RFP 信号。本实验采用 24 小时孵育以进行混合点样的成像。
      注意：应使用湿度适中的培养皿。若琼脂过湿，共孵育点样液将无法被吸收；避免使用当天制备的平板。若琼脂过干，琼脂表面可能出现小波纹或裂纹，导致共孵育点样区域形状不规则。
    5. 使用与步骤 2.3.3 相同的菌液悬浮液，将每个对照组和实验组混合液各取 10 μL 点样至 24 孔板中，每孔含 1 mL LBS 琼脂。与步骤 2.3.3 相同，确保 24 孔板中的琼脂湿度适宜。待点样液完全干燥后，于 24 °C 培养 5 小时。这些点样区域将用于实验结束时定量各菌株的菌落形成单位（CFUs）。
      注意：将菌液点样至独立孔中，便于在终点时更易重悬。也可采用方形无菌滤纸片作为更经济的替代方法，代替 24 孔板。将无菌滤纸片置于琼脂平板上，将各实验混合液 10 μL 点样至滤纸片上。共孵育结束后，将滤纸片转移至 1.5 mL 离心管中，通过涡旋或反复吹打重悬共孵育点样区域。5 小时的孵育时间足以检测 V. fischeri 分离株之间的种间杀伤作用19，但对于其他菌种或竞争机制，共孵育时间可能需要更短或更长。详见讨论部分。
  4. 起始接种液的系列稀释
    1. 为对起始共孵育混合液进行系列稀释，将 96 孔板旋转 90°，使其呈现八列十二行的布局。每行第一列加入未稀释的混合液，随后在该行其余孔中进行七次十倍系列稀释（图 2A）。
    2. 为每行标记菌株编号、重复编号和时间（起始接种液 = T0）。标记含有适当抗生素的 LBS 琼脂平板，用于点样稀释系列。务必明确每种抗生素平板所筛选的菌株。
    3. 使用多通道移液器，向每孔中加入 180 μL LBS 肉汤，第一列留空，用于加入未稀释的共孵育混合液。
      注意：若研究的细菌生长速度极快，或需频繁进行大规模实验（系列稀释耗时较长），研究人员可选择使用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬共孵育点样液并进行系列稀释。在此类情况下使用 PBS 可防止在稀释过程中细菌过度生长。然而，无论实验规模或持续时间如何，必须在所有实验中保持所用溶液的一致性（例如，始终使用 PBS 或 LBS）。
    4. 使用 200 μL 单通道移液器，将 100 μL 共孵育混合液从离心管转移至第一列孔中。弃去枪头，并对所有共孵育混合液重复此操作。
    5. 使用多通道移液器，从第 1 列向第 2 列转移 20 μL，并通过反复吹打混匀。弃去枪头，依次对每一列重复此操作，最终使每行形成初始共孵育混合液的十倍系列稀释。
      注意：每次稀释时吹打次数应保持一致。例如，每次稀释均按压移液器手柄五次，以确保整个稀释系列的一致性。
    6. 使用装有八个枪头的多通道移液器，从稀释系列的每一孔（即一行八孔）中吸取 5 μL，点样至筛选参照菌株的 LBS 琼脂平板（添加卡那霉素）。重复此操作，将稀释液点样至筛选竞争菌株的平板（添加氯霉素）（图 2B）。点样后待其完全干燥，再放入培养箱中。
      注意：同一组枪头可用于将一个重复的稀释系列点样至筛选参照菌株和竞争菌株的平板，但在不同重复之间必须更换枪头。避免枪头末端接触 LBS 琼脂平板表面，以免形成凹陷，类似菌落，影响平板计数结果。若枪头接触平板，应予以记录，并在菌落计数时排除该凹陷。
  5. 获取终末时间点（T final）测量值
    1. 24 孔板中的共孵育点样液在 24 °C 培养 5 小时后，向每孔加入 1 mL LBS 肉汤，并通过反复吹打将共孵育点样液完全重悬，确保所有细胞均被悬浮。所有重复组的重悬操作力度应保持一致。例如，每个样品均按压移液器手柄八次，以确保完全重悬。
    2. 待每个共孵育点样液重悬后，准备 96 孔板用于系列稀释，并准备含适当抗生素的 LBS 琼脂平板，用于点样稀释液，方法同步骤 2.4.1。
    3. 执行步骤 2.4.2–2.4.6，完成终末时间点的系列稀释。
      注意：在共孵育实验的初始优化过程中，应包含一项重要对照。在共孵育结束时，将混合菌株点样至同时含有两种抗生素的培养基上。除非发生以下两种情况之一，否则任一菌株均不应生长：1）发生自发突变；2）菌株间交换了可筛选标记。

3. 使用荧光显微镜观察共孵育过程

  1. 使用配备绿色和红色荧光检测功能的体视显微镜，对步骤 2.3.3 和 2.3.4 中 LBS 琼脂培养皿上的共培养位点进行成像，该荧光信号对应于稳定质粒上表达的荧光蛋白。
  2. 首先对对照共培养位点（参考菌株 pVSV102 + 参考菌株 pVSV208）进行成像。
    1. 调节放大倍数，使位点清晰对焦。
    2. 使用适当的激发光源和滤光片观察 GFP，调整曝光时间，使仅共培养位点的荧光可被检测到，而培养基的背景荧光尽可能低或不可见。
    3. 更换激发光源和滤光片以观察 RFP，调整曝光时间以最小化培养基产生的背景荧光。
  3. 对实验处理组中的每个共培养位点，使用步骤 3.2.2 中确定的 GFP 滤光片和曝光时间，对参考菌株进行成像。
  4. 使用 RFP 滤光片对竞争菌株进行成像，调整曝光时间，使荧光信号仅来自共培养位点，且培养基的背景荧光最小。保存两张图像，并以两个菌株编号、重复编号以及成像时的培养时间（例如 24 h）命名文件。对所有重复样本重复此步骤。
    注意：共培养时间可能需要根据不同的质粒或细菌种类进行调整。优化建议详见讨论部分。

4. 数据分析

  1. 计算每个对照组和实验组在每个时间点（T起始和T终末）的菌落形成单位（CFU）
    1. 当系列稀释平板上出现可见菌落时（例如，费氏弧菌（V. fischeri）在24 °C下培养24小时），确定可进行单菌落计数且菌落未融合成大片多菌落聚集体的稀释倍数（图2B）。对每个重复样本，计数并记录特定稀释度下的单菌落数量。该数值代表该重复样本的CFU数。
    2. 使用以下公式将稀释度对应的CFU换算为共培养体系中各菌株的总CFU：
      [ CFU ÷ (稀释倍数 × 稀释液点样体积) ] × 未稀释样品体积 = 总CFU
      示例：T0：[(6 CFU) ÷ (10^-6 × 0.005 mL)] × [0.01 mL] = 实验开始时混合点样中菌株1的总CFU为1.2E7
      T5：[(4 CFU) ÷ (10^-3 × 0.005 mL)] × [1.0 mL] = 共培养5小时后混合点样中菌株1的总CFU为8.0E5
      各菌株在各时间点的CFU值为原始数据，可用于多种不同分析和统计检验（见下文第4.2节）。
  2. 进行以下数据转换，以判断竞争菌株是否通过以下方式胜过参照菌株：(i) 判断参照菌株在竞争菌株存在下比例是否下降，或 (ii) 计算对数相对竞争指数（RCI）。这些分析将原始数据转换为比值，有助于判断相互作用的竞争结果，但无法确定竞争机制（即杀菌作用 vs 生长抑制）。
    1. 计算共培养期间各时间点每种菌株的比例
      1. 将CFU数据转换为处理组中各菌株所占比例。对于T0时的参照菌株（RS），用T0时参照菌株的总CFU除以参照菌株与竞争菌株（CS）在T0时总CFU之和：
        RST0 CFU ÷ (RST0 CFU + CST0 CFU) = T0时参照菌株的比例。
        采用相同计算方法确定T0时竞争菌株的比例：
        CST0 CFU ÷ (RST0 CFU + CST0 CFU) = T0时竞争 菌株的比例
        对实验组和对照组（不同标记的参照菌株共培养）的每个时间点和重复样本重复此过程。
      2. 以堆叠柱状图形式绘制T0和T5时各菌株类型的平均比例（图 3A）。
      3. 确认是否达到了预期的起始菌株比例。对于初始混合比例为1:1的共培养体系，T0时每种菌株类型应约占总体的~0.5，且通过Student’s t检验无统计学差异（P > 0.05）。若T0时某一菌株比例显著高于另一菌株，则需重复实验，直至达到1:1的起始比例。
      4. 判断5小时后竞争菌株是否在群体中占显著更高比例。对实验组在T0和T5时各菌株比例进行Student’s t检验。若T5时竞争菌株比例与参照菌株相比有显著差异（P < 0.05），则表明可能发生了菌株竞争。继续进行步骤4.2.1.5。
      5. 为判断竞争菌株的存在是否在5小时后降低了参照菌株的比例，对对照组中参照菌株比例与实验组中参照菌株比例（参照菌株 vs 竞争菌株）进行Student’s t检验。
        注：若实验组中参照菌株比例显著低于对照组（P < 0.05），则表明竞争菌株在5小时后显著降低了参照菌株的比例，并胜过了参照菌株。
    2. 计算每种处理（包括对照组）的对数RCI值
      注：相对竞争指数（RCI）是一个单一数值，用于比较菌株类型终末比例与起始比例的差异。RCI值经对数转换，使得对数RCI值大于零表示竞争菌株（CS）胜过参照菌株（RS），对数RCI值小于零表示参照菌株胜过竞争菌株，对数RCI值等于零表示无菌株被胜过。
      1. 使用以下公式计算每种对照组和实验组的对数RCI值：
        Log [(CST5 CFU ÷ RST5 CFU) ÷ (CST0 CFU ÷ RST0 CFU)] = 对数RCI
      2. 使用横向分布的箱线图（box & whiskers plot）绘制对数RCI值（图3B）。
      3. 通过Student’s t检验将每种处理的对数RCI值（包括对照组）与一组相同重复数且所有值均为零的数据集进行比较，判断每种处理是否显著不同于零。若实验组的对数RCI值在统计学上显著大于零（P < 0.05），则表明竞争菌株胜过了参照菌株。
        注：对照组应与零无显著差异（P > 0.05），因为不同标记的参照菌株为同源菌株。
      4. 进行Student’s t检验，判断实验组的对数RCI值是否显著高于对照组（P < 0.05）。若实验组的对数RCI值在统计学上显著高于对照组，则表明竞争菌株胜过了参照菌株。
  3. 进行以下统计分析，以确定竞争菌株胜过参照菌株的机制：(i) 分析原始总CFU数据，或 (ii) 检查参照菌株的回收率百分比。这些分析相较于第4.2节的分析可能更复杂，但可识别竞争菌株是通过生长优势、抑制参照菌株生长，还是主动清除参照菌株来胜过后者。
    1. 分析原始总CFU数据
      1. 使用交错散点图绘制两种菌株的原始总CFU数据，其中重复样本以单个数据点表示（图4A）。数据采用对数刻度显示，并添加一条水平线表示两种菌株在T0时的平均CFU。
      2. 为判断竞争菌株的存在是否对参照菌株产生负面影响，对T5时对照组和实验组的参照菌株CFU进行Student’s t检验。若实验组中参照菌株CFU在统计学上显著低于对照组（P < 0.05），则表明竞争菌株的存在显著影响了参照菌株。
      3. 为判断竞争菌株的存在是否抑制了参照菌株的生长或清除了参照菌株，对对照组和实验组在T0和T5时的参照菌株CFU进行Student’s t检验。
        注：在无竞争菌株存在时，对照组中参照菌株在T0与T5之间的CFU应显著增加。分析实验组时，若T5时参照菌株CFU与T0相比无统计学差异（P > 0.05），则表明竞争菌株抑制了参照菌株的生长；若T5时参照菌株CFU显著低于T0（P < 0.05），则表明竞争菌株杀死了参照菌株。
    2. 计算参照菌株的回收率百分比
      1. 使用以下公式将参照菌株（RS）的总CFU数据转换为回收率百分比数据：
      2. (RST5 CFU ÷ RST0 CFU) × 100 = 参照菌株的%回收率
      3. 使用分离柱状图显示参照菌株的回收率百分比，每根柱代表对照组或实验组（图4B）。在y = 100处添加一条虚线，表示参照菌株100%回收（即从0小时到5小时参照菌株CFU无增减）。
      4. 为判断竞争菌株是否对参照菌株产生负面影响，对对照组与实验组中参照菌株的回收率百分比进行Student’s t检验。若实验组回收率百分比显著低于对照组（P < 0.05），则表明竞争菌株对参照菌株产生了负面影响。
      5. 为判断竞争菌株是否抑制了参照菌株的生长或清除了参照菌株，将实验组中参照菌株的回收率百分比与一组相同重复数且所有值均为100的数据集进行Student’s t检验。
        注：若实验组与100无统计学差异（P > 0.05），则表明竞争菌株抑制了参照菌株的生长；若实验组中参照菌株回收率百分比显著低于100（P < 0.05），则表明竞争菌株杀死了参照菌株。
    3. 解释荧光显微镜图像
      1. 获取荧光显微镜图像后，判断共培养点样中每种菌株是否可见。对于对照共培养（参照菌株pVSV102 + 参照菌株pVSV208），同一共培养点样中应同时可见GFP和RFP信号。若非如此，需重新设置实验，确保菌株正确标记并在无抗生素平板上共培养。
      2. 检查每个实验共培养点样的可能结果。
        注：若竞争菌株可见而参照菌株未被检测到，表明竞争菌株可能杀死了参照菌株或抑制了其生长。若两种菌株均存在且均匀混合（共培养点样中GFP和RFP信号遍布），表明竞争菌株未与参照菌株竞争，两者共存。若两种菌株均存在但空间分离（共培养点样中存在GFP或RFP微菌落），表明参照菌株与竞争菌株可能存在竞争性相互作用，可能需要调整参照菌株或初始共培养比例。详见讨论部分。

5. 确定相互作用是否依赖于细胞接触

注意：如果发现某一菌株杀死或抑制参考菌株，则该相互作用可能是可扩散的或依赖于细胞间接触的。为确定该相互作用是否依赖于细胞-细胞接触，可按照上述步骤1-2所述进行共培养实验，但需进行以下修改。

  1. 执行步骤 1.1–2.2。
  2. 菌株标准化后，使用孔径为 0.22 μm 的硝酸纤维素滤膜将菌株进行物理分离。该孔径允许抗菌物质和小分子扩散，但可阻止 V. fischeri 细胞之间的直接接触。
    注意：如果相互作用依赖于细胞间接触，则通过滤膜将参照菌株与竞争菌株分离应会消除杀伤或抑制表型，参照菌株的菌落形成单位（CFU）不应减少。如果相互作用不依赖于细胞间接触，而是通过可扩散物质介导的，则分离菌株不应阻止竞争菌株对参照菌株的杀伤作用。
    1. 取 5 μL 参照菌株液滴加至一张滤膜中心，另取 5 μL 竞争菌株液滴加至另一张滤膜中心。将含有参照菌株的滤膜放置于 LBS 琼脂平板表面，再将含有竞争菌株的滤膜直接叠放在含参照菌株的滤膜上方。
      注意：将两种菌株均点样于滤膜而非将下层菌株直接点于琼脂表面，以便更方便地将两层滤膜精确叠放在一起。
    2. 若担心菌株未完全对齐叠放，可减少点加到滤膜上的参照菌株接种量体积。这将确保参照菌株的点样区域更小，完全位于竞争菌株之上或之下。交替设置上下层菌株位置，以消除琼脂培养基中营养物质扩散差异的影响。
    3. 为验证滤膜允许小分子扩散，应设置对照实验：将参照菌株点于一张滤膜上，将该菌株敏感的抗生素（氯霉素）点于另一张滤膜上。将两张滤膜直接叠放后置于 LBS 琼脂平板上。抗生素应能透过滤膜扩散并杀死参照菌株。
  3. 将带滤膜的平板在 24 °C 下培养 5 小时。培养期间不得倒置平板，以免滤膜移位。
  4. 根据步骤 2.4 对起始接种物进行系列稀释。
  5. 进行终末时间点（T final）测定
    1. 使用无菌镊子将每组滤膜转移至含有 5 mL LBS 肉汤的 50 mL Falcon 管中。确保滤膜在管内彼此分离，以便每种菌株能够充分重悬。
    2. 通过反复吹吸使菌株从滤膜上重悬，直至滤膜上无可见细胞残留。使用镊子翻转滤膜以清除两面的细胞物质。每次处理不同样品间需用乙醇对镊子进行灭菌。
    3. 根据步骤 2.5 对终末时间点进行系列稀释。计算终末时间点总 CFU 时，需将“未稀释样品总体积”从 1 mL 调整为 5 mL。

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结果

为了评估细菌种群之间的竞争性相互作用，针对V. fischeri建立并优化了一种共培养实验方案。该方法利用编码抗生素抗性基因和荧光蛋白的稳定质粒，从而实现对不同菌株的选择性筛选和可视化区分。通过分析共培养实验所获得的数据，可以确定相互作用的竞争结果及其作用机制。例如，以下实验使用了V. fischeri分离株进行。共培养的菌株携带两种稳定质粒之一：pVSV102（表达卡那霉素抗性及GFP+）或pVSV208（表达氯霉素抗性及DsRed+）。在示例数据中，菌株以1:1的比例混合，并在LBS琼脂平板上共培养5小时。作为对照处理，将标记不同的参考菌株彼此之间进行共培养。实验处理则将携带pVSV102的参考菌株分别与竞争菌株1或竞争菌株2（携带pVSV208）进行共培养。各菌株的培养物按上述方法制备并进行共培养，如图1和图2所示。

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讨论

上述共孵育实验为发现细菌间的竞争提供了一种强有力的方法。该方法已成功用于鉴定V. fischeri分离株之间的种内竞争，并表征其竞争机制19。尽管本实验流程最初是为海洋细菌V. fischeri优化设计的，但其可轻松修改以适用于其他细菌种类，包括临床和环境分离株。需要注意的是，细菌的竞争机制通常受到条件依赖性调控5,6,23,24,25,26,27,28，因此培养条件的微小差异（例如振荡培养与静置培养、温度等）以及培养基类型（...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢审稿人提供的有益反馈。A.N.S. 的研究得到了戈登与贝蒂·摩尔基金会通过向生命科学研究基金会提供的资助 GBMF 255.03 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Fisher05-408-129
10 μL 多通道移液器
100 μL 多通道移液器
300 μL 多通道移液器
10 μL 单通道移液器
20 μL 单通道移液器
200 μL 单通道移液器
1,000 μL 单通道移液器
24 孔板Fisher07-200-84带盖无菌
96 孔板VWR10062-900带盖无菌
计算器
氯霉素SigmaC0378储备液（20 mg/mL，溶于乙醇）；培养基中终浓度（2 μg/mL LBS）
带相机和成像软件的荧光解剖显微镜
镊子Fisher08-880
硫酸卡那霉素FisherBP906-5储备液（100 mg/mL，溶于水，过滤除菌）；培养基中终浓度（1 μg/mL LBS）
硝酸纤维素膜（FS MCE，25MM，NS）FisherSA1J788H50.22 μm 硝酸纤维素膜（每包 100 片）
培养皿FisherFB0875713带盖无菌
分光光度计
半微量比色皿VWR97000-586
TipOne 0.1–10 μL 起始系统USA Scientific1111-350010 个架子
TipOne 200 μL 起始系统USA Scientific1111-50010 个架子
TipOne 1000 μL 起始系统USA Scientific1111-252010 个架子
涡旋振荡器
名称公司目录编号备注
LBS 培养基
1 M Tris 缓冲液（pH ~7.5）50 mL 1 M 储备缓冲液（62 mL 盐酸，938 mL 去离子水，121 g Trizma Base）
琼脂（技术级）FisherDF0812-17-915 g（仅用于制板）
去离子水950 mL
氯化钠FisherS640-320 g
胰蛋白胨FisherBP9726510 g
酵母提取物FisherBP9727-25 g

参考文献

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