细菌编码了多种参与种间竞争的机制。本文介绍一种基于培养的方法，用于表征细菌分离株之间的竞争相互作用，以及这些相互作用如何影响混合种群的空间结构。
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本文内容
摘要
摘要
本文描述了一种基于培养的共孵育实验方法，用于检测和表征两种细菌群体之间的竞争性相互作用。该方法利用稳定的质粒，使每个细菌群体分别携带不同的抗生素抗性标记和荧光蛋白，从而实现对两个群体的选择性筛选和可视化区分。本文详细介绍了竞争性Vibrio fischeri菌株的制备与共孵育过程、荧光显微镜成像以及定量数据分析。该方法操作简便、结果快速，可用于判断一个细菌群体是否杀死或抑制另一群体的生长，并可确定竞争作用是通过可扩散分子介导，还是需要细胞间的直接接触。由于每个细菌群体表达不同的荧光蛋白，该实验能够在混合菌落中实现竞争群体的空间分辨。尽管本文所述方法使用共生细菌V. fischeri并在针对该物种优化的条件下进行，但该实验方案可适用于大多数可培养的细菌分离株。
引言
本文描述了一种基于培养的方法，用于确定两种细菌分离株是否具有竞争性相互作用的能力。在研究混合种群时，评估细菌分离株之间相互作用的程度至关重要，特别是判断这些分离株是否通过干扰机制直接竞争。干扰竞争是指一个种群直接抑制另一个竞争种群的生长或将其杀死的相互作用1。明确这类相互作用非常重要，因为它们可能对微生物群落的结构和功能产生深远影响2,3。
已在来自各种环境（包括与宿主相关和自由生活的细菌）的细菌基因组中广泛发现微生物竞争的机制4,5,6,7,8,9。已有多种竞争策略被描述10,11，包括可扩散机制，如杀菌性化学物质1,
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方案
1. 准备共孵育菌株
- 选择一个合适的参考菌株，用于共孵育实验中细菌竞争的靶标。有关选择参考菌株的最佳实践及其对实验结果的影响，请参见讨论部分。在本方案中，V. fischeri 菌株 ES114 将作为参考菌株。
- 确定在共孵育过程中用于区分分离株的选择和筛选方法
- 通常将菌株转化含有不同抗生素抗性基因（例如 卡那霉素或氯霉素）的稳定质粒，以实现对每种菌株的选择，同时引入编码不同荧光蛋白（例如 GFP 或 RFP）的基因，以便在共培养中通过视觉区分菌株类型。
注意：必须使用稳定质粒，因为如果菌株在无选择压力下丢失质粒，则该菌株的数量在定量时会被低估，且无法通过荧光显微镜检测到。 - 对共孵育的 V. fischeri 菌株进行差异化标记，使一个菌株携带表达绿色荧光蛋白（GFP）并具有卡那霉素抗性（KanR）的质粒 pVSV102，另一个菌株携带表达红色荧光蛋白（dsRed）并具有氯霉素抗性（CmR）的质粒 pVSV20822。
注意：也可使用其他差异化选择方法来区分共孵育菌株。更多方法请参见讨论部分。
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- 通常将菌株转化含有不同抗生素抗性基因（例如 卡那霉素或氯霉素）的稳定质粒，以实现对每种菌株的选择，同时引入编码不同荧光蛋白（例如 GFP 或 RFP）的基因，以便在共培养中通过视觉区分菌株类型。
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结果
为了评估细菌种群之间的竞争性相互作用，针对V. fischeri建立并优化了一种共培养实验方案。该方法利用编码抗生素抗性基因和荧光蛋白的稳定质粒，从而实现对不同菌株的选择性筛选和可视化区分。通过分析共培养实验所获得的数据，可以确定相互作用的竞争结果及其作用机制。例如，以下实验使用了V. fischeri分离株进行。共培养的菌株携带两种稳定质粒之一：pVSV102（表达卡那霉素抗性及GFP+）或pVSV208（表达氯霉素抗性及DsRed+）。在示例数据中，菌株以1:1的比例混合，并在LBS琼脂平板上共培养5小时。作为对照处理，将标记不同的参考菌株彼此之间进行共培养。实验处理则将携带pVSV102的参考菌株分别与竞争菌株1或竞争菌株2（携带pVSV208）进行共培养。各菌株的培养物按上述方法制备并进行共培养，如图1和图2所示。
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讨论
上述共孵育实验为发现细菌间的竞争提供了一种强有力的方法。该方法已成功用于鉴定V. fischeri分离株之间的种内竞争，并表征其竞争机制19。尽管本实验流程最初是为海洋细菌V. fischeri优化设计的，但其可轻松修改以适用于其他细菌种类，包括临床和环境分离株。需要注意的是，细菌的竞争机制通常受到条件依赖性调控5,6,23,24,25,26,27,28，因此培养条件的微小差异（例如振荡培养与静置培养、温度等）以及培养基类型（.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢审稿人提供的有益反馈。A.N.S. 的研究得到了戈登与贝蒂·摩尔基金会通过向生命科学研究基金会提供的资助 GBMF 255.03 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μL 多通道移液器 | |||
| 100 μL 多通道移液器 | |||
| 300 μL 多通道移液器 | |||
| 10 μL 单通道移液器 | |||
| 20 μL 单通道移液器 | |||
| 200 μL 单通道移液器 | |||
| 1,000 μL 单通道移液器 | |||
| 24 孔板 | Fisher | 07-200-84 | 带盖无菌 |
| 96 孔板 | VWR | 10062-900 | 带盖无菌 |
| 计算器 | |||
| 氯霉素 | Sigma | C0378 | 储备液（20 mg/mL，溶于乙醇）；培养基中终浓度（2 μg/mL LBS） |
| 带相机和成像软件的荧光解剖显微镜 | |||
| 镊子 | Fisher | 08-880 | |
| 硫酸卡那霉素 | Fisher | BP906-5 | 储备液（100 mg/mL，溶于水，过滤除菌）；培养基中终浓度（1 μg/mL LBS） |
| 硝酸纤维素膜（FS MCE，25MM，NS） | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm 硝酸纤维素膜（每包 100 片） |
| 培养皿 | Fisher | FB0875713 | 带盖无菌 |
| 分光光度计 | |||
| 半微量比色皿 | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1–10 μL 起始系统 | USA Scientific | 1111-3500 | 10 个架子 |
| TipOne 200 μL 起始系统 | USA Scientific | 1111-500 | 10 个架子 |
| TipOne 1000 μL 起始系统 | USA Scientific | 1111-2520 | 10 个架子 |
| 涡旋振荡器 | |||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| LBS 培养基 | |||
| 1 M Tris 缓冲液（pH ~7.5） | 50 mL 1 M 储备缓冲液（62 mL 盐酸，938 mL 去离子水，121 g Trizma Base） | ||
| 琼脂（技术级） | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g（仅用于制板） |
| 去离子水 | 950 mL | ||
| 氯化钠 | Fisher | S640-3 | 20 g |
| 胰蛋白胨 | Fisher | BP97265 | 10 g |
| 酵母提取物 | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
参考文献
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbi....
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