用于量化Vibrio Fischeri分离物之间竞争交互的联合孵化测定

摘要

细菌编码各种机制,参与细菌间竞争。在这里,我们提出了一个基于培养的协议,用于描述细菌分离物之间的竞争相互作用,以及它们如何影响混合种群的空间结构。

摘要

本手稿描述了一种基于培养的共生测定,用于检测和描述两种细菌群体之间的竞争相互作用。该方法采用稳定的质粒,使每个种群分别具有不同的抗生素抗性能力和荧光蛋白,用于选择和视觉鉴别。在这里,我们描述了竞争维布里奥菲舍尔菌株的制备和联合孵化、荧光显微镜成像和定量数据分析。这种方法很简单,产生快速的结果,并可用于确定一个种群是杀死还是抑制另一个种群的生长,以及竞争是通过可扩散的分子进行中介的,还是需要直接的细胞-细胞接触。由于每个细菌群体表达不同的荧光蛋白,因此测定允许在混合菌群中对相互竞争的人群进行空间歧视。虽然所述方法使用共生细菌V. 菲舍尔使用针对该物种优化的条件执行,但该协议可以适用于大多数可培养的细菌分离物。

引言

本手稿概述了一种基于培养的方法,用于确定两种细菌分离物是否具有竞争性相互作用。在研究混合种群时,评估细菌分离物相互作用的程度非常重要,特别是分离物是否通过干扰机制直接竞争。干扰竞争是指一个人口直接抑制增长或杀死竞争对手1的相互作用。这些相互作用是重要的识别,因为它们可以有深刻的影响微生物群落的结构和功能2,3。

微生物竞争机制已广泛发现来自不同环境的细菌基因组,包括宿主相关细菌和自由生存细菌4、5、6、7 ^8,9.已经描述了各种竞争策略10,11包括可扩散的机制,如杀菌化学品1,12和分泌抗菌^肽13,以及需要细胞-细胞接触将抑制作用剂转移到目标细胞9、14、15、16、17^{的接触依赖机制,18}.

虽然基于培养的共育物在微生物学5、8、19中常用,但本手稿概述了如何使用测定来描述竞争机制,以及适应与其他细菌物种一起使用的协议。此外,此方法还描述了分析和呈现数据的多种方法,以回答有关竞争交互性质的不同问题。虽然本文所述技术以前曾用于识别共生Vibrio Fischeri^细菌19共生菌株之间特定竞争背后的细菌间杀灭机制,但它们适用于许多细菌物种,包括环境分离物和人类病原体,可用于评估接触依赖性和可扩散的竞争机制。协议中的步骤可能需要优化其他细菌种类。鉴于更多的模型系统正在扩大他们的研究,从同源生物的使用,包括不同的基因型10,16,20,21,这种方法将是一个宝贵的资源寻求了解竞争如何影响多菌株或多物种系统的研究人员。

方案

1. 为联合孵化准备菌株

1. 选择适当的参考菌株,作为联合孵育测定期间细菌竞争的目标。请参阅讨论,了解选择参考应变时的最佳做法以及参考应变将如何影响结果。在此协议中,V.菲舍尔应变 ES114 将作为参考应变。
2. 确定将采用哪些选择和筛选方法来区分共育中的分离物
   1. 通常,使用含有不同抗生素耐药性基因(如卡那霉素或氯霉素)的稳定质粒来转化菌株,以为每个菌株选择,以及编码不同荧光蛋白(例如 GFP 或 RFP)的基因,以便直观地进行区分共栽中的菌株类型。
      注:需要使用稳定的质粒,因为如果菌株在没有选择的情况下失去质粒,那么当量化时,该菌株的数量将被低估,并且不能使用荧光显微镜在视觉上检测。
   2. 标记硬币孵化V. 菲舍尔利菌株差异,使一个菌株包含质粒 pVSV102,它表示绿色荧光蛋白 (GFP) 和抗生素卡那霉素 (Kan^R) 的耐药性,第二个菌株包含质粒pVSV208,它表示红色荧光蛋白(dsRed)和抗生素氯霉素(Cm R)22的耐药性。
      注:其他差分选择可用于区分凝结菌株。有关其他方法,请参阅讨论。
   3. 在联合孵育测定的初始优化过程中包括以下控制,以确保选择是可靠的。在含有抗生素的琼脂板上贴上差异标记的每个菌株板(即,在选为菌株2的介质上的板1,反之亦然)。
3. 在共孵化分析前两天,条纹参考菌株pVSV102,参考应变pVSV208,以及每个竞争对手的pVSV208从-80°C库存到含有适当抗生素的LBS琼脂板上(例如,100μg/mL卡那霉素或2μg/mL)氯霉素),并在24°C孵育过夜。需要选择抗生素,以确保所有细胞在实验开始时都含有质粒。
4. 在测定前一天,用适当的抗生素将每个菌株类型(生物复制)的四个单个菌落挑回至新鲜的LBS琼脂板上,并在24°C孵育过夜。
   注:此步骤可能需要优化其他细菌物种,因为可能需要更长或更短的孵育时间才能获得足够的细胞,具体取决于感兴趣的生物体的生长速率。

2. 金孵化菌菌株

1. 培养每种细菌菌株(图1A)
   1. 使用无菌牙签,从琼脂板上刮取细胞(相当于一粒米的大小),并在含有 1 mL LBS 汤的 1.5 mL 微离心管中重新悬浮细胞。将细胞团压入管侧,用力上下移液,从而分解细胞团块。
   2. 盖住管子和涡流1-2s。如果细胞团群仍然可见,则继续上下旋转或移液器,直到样品在视觉上均匀。
   3. 对所有样品重复步骤 2.1.1-2.1.2。
2. 测量并记录所有样品的光学密度为600nm(OD_600)。使用 LBS 肉汤可能需要将样品稀释至 10 倍,以获得准确的 OD 测量。将每个样本规范化为所需的 OD₆₀₀。菌株通常归化为OD₆₀₀ ±1.0,这转化为+10⁶细菌/mL的V.菲舍尔。
   注:此步骤可能需要优化不同的细菌种类,因为接种细胞密度会影响联合孵育结果,具体取决于竞争机制。请参阅讨论以进行优化。
3. 凝结菌株(图1B,C)
   1. 将参考应变和竞争对手应变以 1:1 的比例 (v/v) 混合,将每个菌株的 100 mL(归化为 OD 1.0)添加到标记的 1.5 mL 离心管中。作为控制,将参考应变与自身微分标记版本(参考应变 pVSV102 + 参考应变 pVSV208)混合。以后的统计分析需要这种控制,以确定竞争对手应变的存在是否影响参考应变的生长。涡旋混合应变培养1-2s。
      注:此步骤可能需要优化,因为启动比可能会显著影响结果,并且可能需要进行调整。请参阅讨论以进行优化。
   2. 对每个生物复制重复步骤 2.3.1。完成此步骤后,应总共存在 8 个混合应变管:4 个带有微分标记参考菌株(控制)的生物复制,以及四个带有微分标记参考和竞争对手菌株的生物复制(实验)。
   3. 将每个对照和实验混合物的10 mL点到含有LBS琼脂的Petri板上;这些培养点将在孵育后用于荧光显微镜。
   4. 让斑点在长凳上完全干燥,直到所有液体被吸收到琼脂中,并在24°C下孵育Petri板24小时。使用pVSV102和pVSV208标记的V.fischeri菌株至少需要15小时,才能生长到足够高的细胞密度,分别在总体水平上使用荧光解剖显微镜可视化GFP和RFP。在这里,我们使用24小时孵育成像混合点。
      注:重要的是使用不太潮湿或太干燥的盘子。如果板太湿,共孵化点不会被吸收到琼脂板;避免使用当天浇注的盘子。如果板太干燥,琼脂表面可能会形成小波或裂缝,使共孵化点形状不规则。
   5. 使用步骤 2.3.3 中的相同细菌悬浮液,将每个对照和实验混合物的 10 mL 点入 24 孔板中,每孔含有 1 mL LBS 琼脂。与步骤 2.3.3 一样,确保 24 孔板中的琼脂具有适当的水分。让斑点完全干燥,并在24°C孵育5小时。这些培养点将用于在实验结束时量化每个菌株的菌群形成单位(CCFUs)。
      注:发现细菌悬浮液在单个井中生长,可在结束时间点更容易重新悬浮。此步骤可以使用方形无菌滤片完成,作为使用 24 孔板的更经济的方法。方形无菌滤片可以放置在琼脂板上,每个实验混合物的10 mL可以被发现在这些过滤器上,而不是24孔板上。联合孵育时间后,过滤器可转移到1.5 mL离心管中,共孵化点可以通过涡旋或上下移液重新悬浮。5小时的孵育时间足以检测V.Fischeri分离^物19之间的细菌间杀灭,然而,对于其他物种或竞争机制,这种联合孵育时间可能需要更短或更长。有关详细信息,请参阅讨论。
4. 用于起始接种的串行稀释
   1. 要对起始共育混合物进行连续稀释,请旋转 96 孔板 90°,以便有 8 列和 12 行。每行将包含第一列中未稀释的混合物样本,然后沿行剩余井中进行七次十倍连续稀释(图 2A)。
   2. 用应变 ID、复制编号和时间(开始接种 = T0)标记每行。标记 LBS 琼脂板,辅以适当的抗生素,在其中发现稀释系列。请务必确定每个抗生素板选择的菌株。
   3. 使用多通道移液器,向每口井中加入 180 mL 的 LBS 肉汤,使未稀释的共孵化混合物的第一列为空。
      注:研究人员可以选择使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)来重新悬浮联合孵化点,如果使用生长特别快的细菌物种或持续进行大型实验,其中可能进行连续稀释,则进行连续稀释。很长一段时间执行。在这些情况下使用PBS可以防止细菌在进行连续稀释过程中大量外泄。但是,在所有实验中使用哪种解决方案(例如 PBS 或 LBS)(无论其大小或持续时间如何)非常重要。
   4. 使用 200 mL 单通道移液器,将 100 mL 的共育混合物从管转移到第一柱井。丢弃尖端,对所有共育混合物重复。
   5. 使用多通道移液器,将 20 mL 从 1 列转移到 2 列,然后通过上下移液进行混合。放弃每列的提示并重复,以便到最后,每行包含初始共育混合物的十倍序列稀释。
      注:与稀释液上下移液的次数一致。例如,将移液器手柄压压五次,使每个稀释在整个稀释系列中保持一致。
   6. 使用装有8个吸头的多通道移液器,在稀释系列中从每口井(即一排8口井)中吸出5 mL,并将其点到为参考菌株(辅以卡那霉素)的LBS琼脂板上。重复此步骤,在选择竞争对手菌株(辅以氯霉素)的板上进行识别(图2B)。在放入培养箱之前,让斑点完全干燥。
      注:相同的尖端可用于在选择参考和竞争对手应变的板材上发现复制稀释系列,但必须在复制之间进行更改。避免将移液器尖端的末端接触 LBS 琼脂板,因为这可能产生类似于细菌菌落的凹陷,并在板计数期间产生倾斜结果。如果尖端确实接触了盘子,请记下并不要将凹陷包括在菌群计数中。
5. 进行 T 最终测量
   1. 在24孔板中的共孵化点在24°C下孵育5小时后,向每口井中加入1mL的LBS肉汤,然后通过上下移液重新悬浮共育点,直到所有细胞重新悬浮。与细胞在所有复制中重新悬浮的活力保持一致。例如,按下移液器手柄八次以完全重新悬浮每个样品。
   2. 重新暂停每个共孵化点后,准备一个 96 孔板,用于连续稀释和 LBS 琼脂板,并配备适当的抗生素,以与步骤 2.4.1 相同的方式发现稀释。
   3. 执行步骤 2.4.2-2.4.6 以完成 T 最终测量的串行稀释。
      注:在联合孵育测定的初始优化过程中,应包括一个重要的控制。在共孵化期结束时,将混合菌株盘到包括两种抗生素的介质上。除非1)发生自发突变,或2)在菌株之间交换可选择的标记,否则两种菌株都不应能够生长。

3. 使用荧光显微镜可视化培养

1. 使用配备用于绿色和红色荧光检测的立体显微镜,在 LBS Agar Petri 板上对每个共生点进行成像,该显微镜与稳定质粒上表达的荧光蛋白相对应。
2. 首先拍摄控制共孵化点的图像(参考应变 pVSV102 + 参考应变 pVSV208)。
   1. 调整放大倍率,使点处于对焦中。
   2. 使用适当的激励光和滤光片观察GFP,调整曝光时间,以便只能检测到来自共孵化点的荧光,并且介质中的任何背景荧光都很低或不可见。
   3. 更改激励灯和滤镜以观察 RFP,调整曝光时间以最小化介质的背景。
3. 对于实验处理中的每个共孵化点,使用 GFP 滤波器的参考应变图像和步骤 3.2.2 中确定的暴露时间。
4. 使用 RFP 滤镜对竞争对手应变进行成像,调整暴露时间,以便仅从介质的孵育点和背景荧光中观察到荧光。保存两个图像并命名它们,以包括应变 D、复制编号、拍摄图像时的孵育时间(例如,24 小时)。对所有复制重复上述步骤。
   注:可能需要根据不同的质粒或细菌物种调整联合孵育时间。请参阅讨论以进行优化。

4. 数据分析

1. 在每个时间点(T 开始和 T 最终)计算每个控制和实验处理的 CCF
   1. 一旦菌落在连续稀释板上可见(例如,24小时在24°C对V.菲舍尔),确定稀释因子,其中单个菌落可以计数,并且没有一起成长为大型的多群落簇(图2B)。对于每个复制,计数并记录给定稀释的单个菌落数。此数字表示该复制的 CCF。
   2. 使用以下公式将稀释的 CCF 转换为共育中每种菌株的总 CCF:
      • CCF = (稀释系数 x 稀释点的 vol)= 未稀释样品的 x vol = 总 CCF
      示例:T0:[(6 CCFUs) = (10*-6 x 0.005 mL)] x [0.01 mL] = 实验开始时混合点中 1 号菌株的总 CCF
      T5: [(4 CCFUs) = (10°-3 x 0.005 mL)] x [1.0 mL] = 8.0E5 在混合点中菌株 1 的总 CCFUs,在 5 h 共孵育后
      每个时间点的每个应变的 CFU 值是可用于多个不同分析和统计测试的原始数据(见下文第 4.2 节)。
2. 执行以下数据转换,以确定竞争对手应变是否优于参考应变:(i) 确定参考应变的比例是否随着竞争对手应变的存在而减小,或 (ii) 计算日志相对竞争指数 (RCI)。这些分析将原始数据转换为比率,可用于确定交互的竞争结果,但不能确定竞争机制(即杀戮与增长抑制)。
   1. 计算联合孵育过程中每个时间点的每个应变的比例
      1. 将 CFU 数据转换为治疗中每个菌株的比例。对于 T0 处的参考应变 (RS),将 T0 处参考应变的总 CCF 除以参考应变和竞争对手 (CS) 在 T0 的总 CCF 之和:
         RS_T0 CCFUs = (RS_T0 CCFUs = CS_T0 CCFUs) = T0 处参考应变的比例。
         执行相同的计算以确定 T0 处竞争对手应变的比例:
         CS_T0 CCF= (RS_T0 CCFUs = CS_T0 CCF) = T0 处参考应变的比例
         对每个时间点重复此过程,并复制实验处理和控制处理(微分标记参考菌株共孵化)。
      2. 在堆叠条形图(图 3A) 中绘制 T0 和 T5 中每种应变类型的平均比例。
      3. 确保获得所需的菌株启动比。对于最初混合菌株为 1:1 的共育,每种菌株类型应包含 T0 时总体的 ±0.5,并且不应使用学生的 t 检验 (P > 0.05) 在统计上彼此不同。如果一个应变在 T0 处的比例明显大于另一个应变的比例,则重复实验,直到达到 1:1 启动比。
      4. 确定在5小时后,竞争对手菌株是否包含明显较大的人群比例。 执行学生T测试,比较T0和T5实验处理中每种菌株的比例。如果竞争对手应变的比例与 T5(P < 0.05) 的参考应变的比例显著不同,则此结果表明可能发生应变竞争。继续执行步骤 4.2.1.5。
      5. 要确定竞争对手应变的存在在 5 小时后是否降低了参考应变的比例,请执行学生 t 检验,将对照中参考应变的比例与参考应变在实验处理(参考应变v竞争对手菌株)。
         注:如果参考菌株在实验处理中相对于对照(P< 0.05)的比例在统计学上较低,则竞争对手菌株在5小时后显著降低参考菌株的比例,比参考应变。
   2. 计算每次处理(包括控制)的日志 RCI 值
      注:相对竞争指数(RCI)是一个值,用于比较应变类型的结束比与起始比有何不同。RCI 值经过日志转换,因此日志 RCI 值大于零表示竞争对手应变 (CS) 超过参考应变 (RS),日志 RCI 值小于零表示参考应变超过竞争对手应变,对数 RCI值为零表示两个应变均未被超越。
      1. 使用以下公式计算每个控制和实验处理的日志 RCI 值:
         日志 =(CS_T5 CFU = RS_T5 CCFUs) = (CS_T0 CFU = RS_T0 CFU)= = 日志 RCI
      2. 使用分隔框和胡须绘制的图形日志 RCI 值,其中数据以水平方向绘制(图 3B)。
      3. 通过执行学生 t 检验,将每个处理的 LOG RCI 值(包括控件)与数据集进行比较,将相同数量的复制都与零值进行比较,确定每种处理是否与零显著不同。如果实验处理的对数 RCI 值在统计上大于零(P < 0.05),则竞争对手应变超过参考应变。
         注:该对照值不应与零(P > 0.05)在统计上不同,因为差分标记的参考菌株是同源的。
      4. 执行学生的 t 检验,以确定实验处理的 log RCI 值是否明显大于对照(P < 0.05)。如果实验处理中的对数 RCI 值在统计上大于对照处理,则竞争对手应变超过参考应变。
3. 执行以下统计分析以确定竞争对手应变优于参考应变的机制:(i) 分析原始总 CFU 数据,或 (ii) 检查参考应变的回收百分比。与步骤 4.2 中的分析相比,这些分析可能更麻烦,但将确定竞争对手应变是否通过超过参考应变、抑制参考应变增长或主动消除参考应变而超过参考应变。
   1. 分析原始总 CFU 数据
      1. 使用交错散点图绘制两个应变的原始原始总 CFU 数据,其中复制显示为单个数据点(图4A)。在日志比例上显示数据,并添加一条水平线,指示两个菌株的平均 T0 CCF。
      2. 要确定竞争对手应变的存在是否对参考应变产生负面影响,请执行学生 t 检验比较参考应变 CCFUs,用于 T5 的控制和实验处理。如果实验处理中的参考应变 CCF 在统计上低于对照(P< 0.05),则竞争对手应变的存在对参考应变有显著影响。
      3. 要确定竞争对手菌株的存在是否抑制了参考菌株的生长或消除参考菌株,请执行学生 t 检验,比较 T0 和 T5 的参考应变 CCFUs,以便进行控制和实验处理。
         注:在没有竞争对手的情况下,在比较控制处理的 T0 和 T5 时,参考应变应显示 CFU 显著增加。在分析实验处理时,如果 T5 中的参考应变 CCF 与 T0 (P> 0.05) 没有统计上的不同,则竞争对手应变会抑制参考应变的生长。如果参考应变 T5 CCFUs 明显低于 T0CCF(P< 0.05),则竞争对手应变杀死了参考应变。
   2. 计算参考应变的回收百分比
      1. 使用以下公式将参考应变 (RS) 的总 CFU 数据转换为百分比恢复数据:
      2. (RS_T5 CCFUs = RS_T0 CCFUs) x 100 = 参考应变恢复百分比
      3. 使用分离的条形图显示参考应变的百分比恢复百分比,其中每个条形表示控制或实验处理(图 4B)。在 y = 100 处添加虚线,以指示参考应变的 100% 恢复(参考应变 CCF 从 0 h 到 5 h 没有增加或减少)。
      4. 要确定竞争对手应变是否对参考应变产生负面影响,请执行学生 t 检验,将对照处理的参考应变百分比恢复与实验处理进行比较。如果回收百分比明显小于控制 (P< 0.05),则竞争对手应变对参考应变产生负面影响。
      5. 要确定竞争对手应变是否抑制了参考菌株的生长或消除参考菌株,请执行学生 t 检验比较实验治疗的参考应变百分比恢复,以及具有相同数量的复制次数的数据集。值为 100。
         注:如果实验处理与 100 (P> 0.05) 在统计上没有区别,则竞争对手菌株抑制参考菌株的生长。如果实验处理中的参考菌株百分比恢复显著低于 100 (P< 0.05),则竞争对手菌株杀死了参考菌株。
   3. 解释荧光显微镜图像
      1. 一旦拍摄荧光显微镜图像,确定每个菌株是否可明显检测在联合孵育点。对于控制共育育菌(参考应变 pVSV102 + 参考应变 pVSV208),GFP 和 RFP 应从一个共孵化点可见。如果不是这样,再次设置实验,确保菌株正确标记,并在无抗生素的板上孵化。
      2. 对于每个实验共孵化点,检查可能的结果。
         注:如果竞争对手应变是可见的,但未检测到参考应变,则表明竞争对手的应变终止或抑制了参考应变的生长。如果两种菌株都存在且均匀混合(GFP 和 RFP 存在于整个联合孵育点),则这些数据表明竞争对手菌株不与参考菌株竞争,并且两种菌株共存。如果两种菌株都存在,但空间分离(GFP 或 RFP 的微聚位点存在于整个联合孵育点),则表明参考菌株和竞争对手菌株可能正在进行竞争交互和修改,可能需要参考菌株或初始共育比。有关详细信息,请参阅讨论。

5. 确定交互是否与联系人相关

注:如果您发现一种菌株杀死或抑制参考菌株,则相互作用可能是可扩散的或接触相关的。要确定相互作用是否依赖于细胞-细胞接触,请执行与上述步骤 1-2 所述的共孵化测定,并进行以下修改。

1. 执行步骤 1.1-2.2。
2. 一旦菌株规范化,使用0.22毫米孔径的硝化纤维素过滤器进行物理分离菌株。这种孔径允许抗菌素和小分子扩散,但防止V.菲舍尔细胞之间的物理接触。
   注:如果相互作用取决于细胞-细胞接触,则参考菌株与过滤器的竞争对手菌株分离应废除杀灭或抑制表型,参考应变不应减少 CfUS。如果相互作用不依赖于细胞-细胞接触,并且是一种可扩散的机制,分离菌株不应防止竞争对手菌株杀死参考菌株。
   1. 将参考应变的 5 mL 点到过滤器的中心,将竞争对手应变的 5 mL 点到不同过滤器的中心。将含有参考应变的过滤器放在 LBS 琼脂板表面。将含有竞争对手应变的过滤器直接放在过滤器顶部,并带有参考应变。
      注:每个菌株都印在过滤器上,而不是直接在琼脂板上发现底部菌株,因此菌株可以更容易地直接放置在彼此的顶部。
   2. 如果担心菌株不能直接堆叠在彼此的顶部,则减少在过滤器上发现的参考菌株接种量。这将确保参考应变点的区域较小且完全高于或低于竞争对手应变。交替哪个菌株位于顶部和底部,以解释琼脂培养基中营养物质扩散的差异。
   3. 为了确保过滤器允许小分子扩散,包括控制治疗,其中参考菌株被发现到过滤器上,一种对它敏感的抗生素(氯霉素)被发现到另一个。将过滤器直接堆叠在彼此的顶部,并放置在 LBS 琼脂板上。抗生素应该能够通过过滤器扩散,并应杀死参考菌株。
3. 在 24°C 下用过滤器孵育板 5 小时。孵育时不要反转琼脂板,以免移动滤清器。
4. 根据步骤 2.4 对起始接种执行串行稀释。
5. 进行 T 最终测量
   1. 使用无菌钳子,将每组过滤器转移到含有 5 mL LBS 汤的 50 mL 猎鹰管中。确保过滤器在管内物理分离,以便每种应变类型完全重新悬浮。
   2. 通过上下移液,从过滤器中重新悬浮菌株,直到过滤器清除所有细胞。使用钳子旋转过滤器,并从两侧清除细胞材料。在样品之间用乙醇消毒钳子。
   3. 根据步骤 2.5 对 T 最终执行串行稀释。在计算 T 终审样品的总量时,将"未稀释样品的总体积"从 1 mL 调整为 5 mL。

结果

为了评估细菌群之间的竞争相互作用,为V.fischeri开发并优化了联合孵育测定方案。该方法利用编码抗生素抗性基因和荧光蛋白的稳定质粒,允许每个菌株的微分选择和视觉鉴别。通过分析从共孵化测定中收集的数据,可以识别相互作用的竞争结果和相互作用的机制。例如,使用V.菲舍尔基分离物进行了以下实验。凝结菌株含有两个稳定的质粒之一:pVSV102表示卡那霉素抗性,GFP+,或pVSV208表示氯霉素抗性,DsRed®。在样本数据中,菌株以1:1的比例混合,在LBS琼脂板上孵育5小时。作为一种控制处理,参考菌株的差分标记版本相互结合。实验处理采用参考应变(带压pVSV102)和竞争对手应变1或竞争对手应变2(波林pVSV208)。进行。如上文所述,每个菌株的培养物都进行了制备和孵化,如图1和图2所示。

在

讨论

上述共育测定为发现细菌间竞争提供了一种强有力的方法。这种方法可以识别V.fischeri分离和描述竞争机制之间的特定^竞争19。虽然所述方法针对海洋细菌V.菲舍尔进行了优化,但可以轻松修改,以适应其他细菌种类,包括临床和环境分离物。需要注意的是,竞争机制通常有条件地受到5、6、23、24、25、26、27的制约。^,28,因此生长条件(如摇动与站立培养、温度等)和介质类型(如含盐量)的微小差异可以显著影响结果。因此,对于不同的细菌...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher	05-408-129
10 μL 多通道移液器
100 μL 多通道移液器
300 μL 多通道移液器
10 μL 单通道移液器
20 μL 单通道移液器
200 μL 单通道移液器
1,000 μL 单通道移液器
24 孔板	Fisher	07-200-84	带盖无菌
96 孔板	VWR	10062-900	带盖无菌
计算器
氯霉素	Sigma	C0378	原液（乙醇中 20 mg/mL）;培养基中的终浓度（2 &μ;g/mL LBS）
荧光解剖显微镜，带相机和成像软件
镊子	Fisher	08-880
硫酸卡那霉素	Fisher	BP906-5	原液（100 mg/mL 水溶液，过滤灭菌）;培养基中的最终浓度（1 μg/mL LBS）
硝酸纤维素膜 （FS MCE， 25MM， NS）	Fisher	SA1J788H5	0.22 &μ;m 硝酸纤维素膜（100 个/包）
培养皿	Fisher	FB0875713	无菌带盖
分光光度计
半微量比色皿	VWR	97000-586
TipOne 0.1-10 μL 启动系统	USA Scientific	1111-3500	10 架
TipOne 200 μL 启动系统	USA Scientific	1111-500	10 架
TipOne 1000 μL 启动系统	USA Scientific	1111-2520	10 架
Vortex
名称	>Company	目录号	评论
LBS 培养基
1 M Tris 缓冲液 （pH ~7.5）			50 mL 1 M 储备缓冲液（62 mL HCl、938 mL 去离子水、121 g Trizma 基础）
琼脂	Technical Fisher	DF0812-17-9	15 g（仅添加用于板）
去离子水			950 mL
氯化钠	Fisher	S640-3	20 g
胰蛋白胨		Fisher BP97265	10 g
酵母提取物	Fisher	BP9727-2	5 g