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方法文章

使用含有 Alu 元件的微基因分析环状 RNA

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DOI：

10.3791/59760

⸱

2020年3月10日

 ,  ,  , 
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky

本文内容

摘要

我们克隆并分析产生环状RNA的报告基因。这些报告基因比用于分析线性剪接的载体更大，并包含Alu元件。为了研究这些环状RNA，将载体转染入细胞，去除线性RNA后，通过RT-PCR分析所获得的RNA。

摘要

除了线性mRNA外，许多真核基因还能产生环状RNA。大多数环状RNA是通过前体mRNA中一个5'剪接位点与上游的3'剪接位点连接而形成的，这一过程称为反向剪接。这种环化过程可能由前体mRNA中的二级结构促进，这些二级结构使剪接位点彼此靠近。在人类基因中，Alu元件被认为能够促进此类RNA二级结构的形成，因为当Alu元件在前体mRNA中以相反方向存在时，它们含量丰富且彼此之间具有碱基互补性。本文描述了包含大量Alu元件并能形成环状RNA的报告基因的构建与分析方法。通过优化克隆方案，可构建插入片段长度达20 kb的报告基因。在共转染实验中对这些报告基因进行分析，有助于鉴定调控环状RNA生成的因子。因此，该方法可用于识别参与环状RNA形成的RNA序列及细胞组分。

引言

环状RNA
环状RNA（circRNA）是一类在大多数生物体中表达的共价闭合单链RNA。它们通过将下游5'剪接位点与上游3'剪接位点连接而生成，该过程称为反向剪接（图1A）1。前体mRNA中长度仅为30–40 nt的碱基互补序列可使反向剪接位点正确对齐，从而促进circRNA的形成2。在人类中，Alu元件1约占基因组的11%3，由于其自身具有互补性，可在前体mRNA中形成广泛的双链RNA结构4,5，从而促进circRNA的生成1。

目前，circRNA 的三大主要功能已被阐明。一些 circRNA 可结合微小 RNA（miRNA），并通过隔离作用发挥类似 miRNA 海绵的功能6。circRNA 还参与转录及转录后调控，其机制包括与线性剪接竞争7，或调节转录因子活性8。最后，circRNA 含有短的开放阅读框，原理性研究已证明其具备翻译能力9,10。然而，大多数 circRNA 的功能仍不明确。目前多数环状 RNA 是通过高通量测序技术检测到的11。针对特定基因的靶向 RT-PCR 分析表明，仍有大量 circRNA 尚待发现12。

利用报告基因分析前体 mRNA 加工过程
通过将DNA报告基因构建体转染入细胞，进而分析所产生的mRNA，是研究可变前体mRNA剪接的一种成熟方法，该方法也可应用于环状RNA的研究。通常，将可变外显子、其两侧的内含子以及组成型外显子进行扩增，并克隆到真核表达载体中。内含子通常会被截短。将构建好的载体转染至真核细胞中，一般通过RT-PCR13,14进行分析。该方法已在共转染实验中被广泛用于绘制调控性剪接位点及反式作用因子的图谱13,15,16,17,18。此外，构建可表达蛋白的微型基因（minigene）还使得筛选能够改变可变剪接的小分子物质成为可能19,20。

该方法已应用于环状RNA的研究。目前，文献中已描述了至少12种微型基因骨架，总结于表1中。除基于tRNA的表达系统21,22外，其余均依赖于RNA聚合酶II启动子。本文介绍一种构建人类报告微型基因的方法，用于鉴定参与环状RNA生成的顺式和反式作用因子。使用已发表的报告基因序列23对本方法的示意图见图1。

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方案

1. 载体构建的设计

  1. 使用 UCSC 基因组浏览器24 鉴定环状 RNA 形成所必需的重复元件，并将其纳入构建体中。重要的是，用于扩增的引物必须位于重复元件之外。
  2. 将环状 RNA 序列（补充图 1 为测试序列）粘贴至 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start，并选择正确的物种。提交序列后进入浏览器视图，放大 1.5 倍或适当调整（图 2A）。
    注意：搜索序列显示在最上方一行（图 2A, 1）。根据环状 RNA 中外显子的排列顺序，BLAT 可能不会连接所有外显子。在此示例中，外显子 12（图 2A, 4）未与外显子 11（图 2A, 2, 3）连接，因为在外显子 12 在环状 RNA 序列中位于外显子 11 的上游（补充图 1）。重复元件位于“重复屏蔽”（repeat masker）轨道中，以方框表示，其中黑色至灰色表示进化保守性（图 2A, 5）。
  3. 将鼠标悬停在重复元件上，可在浮动窗口中识别其亚型。Alu 元件位于 SINE（短散在核元件）行。若获得的图像与 图 2 不同，可点击窗口下方的“默认轨道”（default tracks）按钮重置浏览器。
    注意：将鼠标悬停在基因显示区的外显子上时，会弹出一个包含外显子编号的窗口，这些编号由计算机生成，与文献中已确立的外显子编号不一致，且在不同异构体之间会发生变化。

2. 选择要在表达载体中克隆的序列

  1. 在 UCSC 基因组浏览器顶部菜单栏中，点击 View → DNA，下载窗口中显示的 DNA 序列。在 Sequencing Formatting Option 中，选择 Extended Case/Color Options。
  2. 将默认字母格式设为 Lower，并为 NCBI refseq 选择切换大小写。为 Repeat Masker 选择下划线、加粗和斜体格式。点击 Submit。此时外显子将以大写字母显示，内含子以小写字母显示。请检查外显子/内含子边界。
  3. 在本示例中，出现序列为 'ccctttacCTTTTT'，表明浏览器显示的是反向互补链。若如此，请返回并勾选反向互补选项，直至观察到正确的外显子-内含子边界（agEXONgt），在本例中应为 AAAAAGgtaaaggg。
  4. 将具有正确方向（内部外显子两侧为内含子序列 ag…gt）的序列复制到文字处理文档中，并标出外显子区域（补充图 2）。
    注意：在本示例中，包含第 9 至第 12 外显子的基因组片段长约 24 kb，因此无法直接从基因组 DNA 上扩增。因此，每个外显子及其两侧约 1 kb 的内含子区域分别进行扩增，然后将这四个片段组装至克隆载体中。
  5. 选择待扩增的片段（外显子 ± 500 nt 内含子）。确保所选内含子区域不以重复序列起始或终止，因为位于重复区域的引物无法特异性扩增目标序列。所选区域如 图 2B 所示，其序列见 补充图 3。
    注意：通常情况下，构建体越大，克隆难度越高。这些片段可采用逐步组装方式（即先将外显子 9 与载体连接，下一步再将外显子 10 通过克隆插入该构建体，依此类推直至所有外显子就位），也可选择同时组装所有片段。逐步组装法通常可行，但耗时较长；而同时组装法并非总能成功，其成功率取决于各片段从基因组 DNA 上扩增的效率以及整体构建体的大小。因此，我们通常会同时尝试这两种方法。

3. 设计克隆引物

  1. 使用网络工具（https://nebuilder.neb.com/#!/）设计克隆引物。例如，将片段 9、10、11 和 12 以及载体序列（补充图 3）输入该工具。
  2. 对于载体序列，将插入位点作为最后一个核苷酸，随后添加各片段。由于载体序列的编号并非从特定插入位点开始，需先定位插入位点，再将下游序列置于上游序列之前。在本例中，插入片段紧接在 HindIII [AAGCTT] 位点之后开始，并紧接在 pcDNA3.1 的 PmeI [GTTTAAAC] 位点之后结束。因此，将序列 cccgctgatcag … ccgtaaaaaggccgc 粘贴至 pcDNA3.1 序列（gttgctggcgtttttcc …）第 1 位点之前。
  3. 若引物的熔解温度相差超过 4 °C，需进行调整，否则将无法有效扩增。片段组装方式及所设计的引物序列详见 补充图 4。克隆引物也可手动设计25。

4. PCR 与扩增子检测

  1. 标准PCR反应：配制每反应总体积为50 µL的反应体系。以下是使用聚合酶1进行一次反应的配制方案：
    10 µL 5x反应缓冲液
    1 µL 10 mM dNTPs
    2.5 µL 10 µM 正向引物
    2.5 µL 10 µM 反向引物
    0.5 µL 聚合酶1
    32.5 µL 无核酸酶水（Nuclease free H2O）
    1. 若扩增产物GC含量较高，可选择性加入10 µL 5x GC增强剂；建议配制含GC增强剂的独立反应体系以测试PCR效果。
  2. 将49 µL反应体系分装至每个PCR管中。
  3. 向PCR体系中加入1 µL DNA模板，DNA用量范围为10 pg至1 ng。
  4. 短暂离心以去除管壁残留液体，并将PCR管放入PCR仪中。在优化PCR条件时，应使用同一台PCR仪及仪器内相同的位置。

5. 针对较长DNA片段及不同聚合酶使用的优化

  1. 温度
    1. 优化长片段扩增聚合酶2。
      1. 使用较低的变性温度（聚合酶1：98 °C，聚合酶2：94 °C）。
      2. 延长变性时间（聚合酶1：10 s，聚合酶2：30 s）。
      3. 延长退火时间（聚合酶1：30 s，聚合酶2：60 s）。
      4. 延长延伸时间（聚合酶1：30 s/kb，聚合酶2：50 s/kb）。
      5. 使用较低的延伸温度（聚合酶1：72 °C，聚合酶2：65 °C）。
      6. 退火温度设置为比引物Tm值低5 °C。
    2. 优化引物浓度（原始引物浓度的5倍稀释至5倍增加）。优化DNA浓度，范围为10 pg、50 pg、100 pg、1 ng、5 ng至10 ng。
    3. 以使用聚合酶2扩增15 kb产物为例，PCR程序如下：94 °C预变性30 s，随后进行94 °C变性30 s，58 °C退火30 s，65 °C延伸12 min 30 s。最后在65 °C进行10 min终延伸，并在4 °C保存。
      注：退火温度（Ta）应根据针对特定聚合酶设计的在线温度计算工具确定。若扩增片段大于10 kb，延伸时间可能需要调整并优化。
  2. 延伸时间与DNA浓度
    1. 对于超过6 kb的DNA片段，应使用更长的延伸时间：每1 kb需1 min。较长的片段应使用较少的DNA模板量。
    2. 通过DNA梯度稀释确定最佳扩增浓度，通常质粒DNA为1 pg至1 ng，基因组DNA为1 ng至1 µg。
      注：大多数克隆实验推荐使用聚合酶1，该酶通过将Sso7d DNA结合结构域与一种专有的耐热DNA聚合酶融合而成26。该聚合酶具有较低的错误率，并因含有Sso7d结构域而具备高持续合成能力，适用于扩增较大的（10–15 kb）基因组片段。由于扩增片段较大，通常采用酶法DNA分子组装技术27将片段插入载体，该方法无需限制性内切酶。使用聚合酶1扩增超过15 kb的片段难度逐渐增加。对于大片段扩增，建议使用聚合酶2，其由类似pyrococcus的具有校对功能的聚合酶与Sso7d融合而成，或使用长片段PCR扩增试剂盒，但后者错误率较高。

6. 克隆用PCR产物的纯化

  1. 取一半的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶中含嵌入式核酸染料（例如，1x GelGreen）。在暗场读取仪的透射光下观察染色后的凝胶。注意：经此染料染色的DNA电泳迁移率与实际大小不符。
    注意：GelGreen与DNA发生嵌入结合，作用方式类似于溴化乙锭，但其激发光波长约为500 nm（青色），该波长不会损伤DNA，从而显著提高克隆效率。
  2. 同时，取另一半PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳后用溴化乙锭染色（图3A,B）。
  3. 从染色凝胶（步骤6.1）中切下大小正确的条带，使用凝胶回收与PCR产物纯化试剂盒提取DNA。与试剂盒标准操作略有不同的是，应仅用20 µL双蒸水洗脱DNA，因为通常DNA浓度较低。
  4. 在进行克隆前，通过琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度和完整性（图3B）。目标插入片段与载体的摩尔比应为2:1。若使用多个插入片段，则摩尔比设定为2:2:2:1。

7. DNA 组装与克隆检测

注意：克隆使用酶法 DNA 组装试剂盒完成，仅作轻微修改。组装反应在 50 °C 下进行 60 分钟，通常使用较低范围的 DNA 量进行组装（每 20 µL 反应体系加入 20–100 fmol）。将整个反应混合物加入化学感受态细胞中，并将全部细胞涂布于一个 6 cm 琼脂平板上。

  1. 按1:2的摩尔比（每种20-500 fmol）将载体和插入片段混合于10 µL水中。
  2. 加入10 µL DNA组装预混液（DNA Assembly Master Mix）。
  3. 在50 °C下孵育样品60分钟。
  4. 接下来，将完整的组装反应产物转化至感受态细胞中。此处，对于较短的构建体使用E. coli strain 1细胞，而对于较长或不稳定的构建体则使用E. coli strain 2细胞。细胞体积应为50 µL。
  5. 在冰上融化细胞，并向感受态细胞中加入2 µL冷藏的组装产物。通过轻轻弹击离心管4-5次进行混匀。切勿涡旋振荡。
  6. 将混合物置于冰上静置30分钟。
  7. 在42 °C下热激30秒。期间不要混匀。
  8. 将离心管放回冰上2分钟。
  9. 向离心管中加入950 µL室温的SOC培养基。
  10. 在37 °C下孵育反应管60分钟，剧烈振荡（300 rpm）。
  11. 在37 °C孵育期间，将含有适当抗生素的筛选平板预热。
  12. 通过离心（10,000 x g，30秒）收集细胞，并将细胞的¼和¾分别涂布于两块筛选平板上，于37 °C过夜培养。

8. 克隆的验证

  1. 采用菌落PCR，使用跨越组装位点的PCR引物进行检测（图1C）。
  2. 取无菌牙签，接触单个细菌菌落。
  3. 用沾有菌落的牙签轻触PCR管底部，然后将牙签在含抗生素的琼脂平板上划线，将划线后的平板于37 °C或室温下过夜培养，适用于敏感型构建体。
  4. 在接触过菌落的PCR管中加入含有检测引物的PCR反应混合液。引物设计使用Primer3软件（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），该程序可通过使用"[ccc]"符号指定在特定序列区域强制设计引物，以跨越组装连接处。阳性菌株的DNA被提取后通过测序验证。

9. 表达报告基因的环状RNA分析

  1. 进行分析时，将报告基因转染至真核细胞中。此处使用 HEK293 细胞（ATTC #CRL-1573），因其具有较高的转染效率。为节约成本，使用 PEI（聚乙烯亚胺）溶液。
  2. 配制 PEI 溶液时，将线性聚乙烯亚胺盐酸盐（PEI）以 1 mg/mL 的浓度溶于低 pH 值（pH 2）的水中，随后用 NaOH 调节 pH 至 7。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌，并于 4 °C 保存。
  3. 将细胞接种至六孔板中（每孔约 150,000 个细胞），在含 10% FBS 的 DMEM 培养基中培养过夜。
  4. 取 1 µg 报告基因加入无菌离心管中，加入 200 µL 经无菌过滤的 150 mM NaCl 溶液，通过涡旋混合 DNA。
  5. 向该混合物中加入 PEI 溶液，涡旋混匀后短暂离心，使液体沉降至管底。DNA 与 PEI 的用量比例为每 1 µg DNA 加入 3 µL PEI。
  6. 室温孵育 10 分钟后，直接将混合物加入 HEK293 细胞中。
  7. 将 HEK293 细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。
  8. 使用 RNA 提取试剂盒提取 RNA，用于 RT-PCR 分析。

10. 使用RNase R处理去除线性RNA

  1. 在无 RNase 的离心管中使用 10 µg 总 RNA。
  2. 向 RNA 中加入 10 µL 10x RNase R 缓冲液（0.2 M Tris-HCl (pH 8.0)，1 M KCl，1 mM MgCl2）。
  3. 向 RNA 中加入 RNase R（1 µL = 20 U）。
  4. 向 RNA 中加入 1 µL 甘油蓝，并用无菌水补至终体积 100 µL。
  5. 在 37 °C 下孵育样品 30 分钟。
  6. 加入 100 µL 苯酚/氯仿，涡旋振荡 1 分钟。
  7. 在 21,000 x g 下离心 1 分钟以分离相层。
  8. 吸取上清液（水相），加入 1 体积（约 80 µL）氯仿。
  9. 涡旋振荡 1 分钟，然后离心 1 分钟以分离相层。
  10. 取上清液，加入 1/10 体积的 KAc 和 2.5 体积的乙醇，在 -20 °C 沉淀 1–4 小时。在 4 °C 下以最大速度（21,000 x g）离心 30 分钟。管底将出现少量蓝色沉淀。
  11. 弃去上清液，用 80% 乙醇洗涤，室温下晾干 5 分钟，然后溶于 10 µL 水中。

11. RT-PCR 分析

  1. 每个反转录（RT）反应使用 1 µg RNA。
  2. 配制反应体系，使每个反应的终体积为 20 µL。单个反应体系中包含 1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 0.1 M 二硫苏糖醇（DTT）、4 µL 5x 第一链缓冲液和 0.5 µL 反转录酶。
  3. 将 6.5 µL 反应混合液分装至新的 PCR 管中。
  4. 可将最多 5 种引物混合于同一反应体系中。但某些引物可能在 PCR 中与其他引物发生非特异性配对（图 5）。引物序列见 表 2。我们常规使用基因特异性的外显子连接区引物，但也可使用随机六聚体引物进行引物延伸。
  5. 向目标 RT 反应管中加入 1 µL 10 µM 的反向引物。
  6. 向 PCR 反应管中加入 1 µg RNA。
  7. 加入无 RNase 的 H2O，补足至总体积 20 µL。
  8. 短暂离心以去除管壁残留液体，并将反应管放入热循环仪中。
  9. 在热循环仪中于 50 °C 运行 RT 反应 50 分钟。
  10. 将 RT 反应所得 cDNA 储存于 -20 °C，或直接进行后续 PCR 反应。

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结果

报告基因可用于确定影响环状RNA形成的调控因子。然而，这些报告基因体积较大且含有重复元件，常常导致DNA构建体不稳定。由于其尺寸较大，通常需要删除部分内含子，这可通过扩增包含外显子及较小侧翼内含子区域的基因组片段来实现。这些DNA片段可通过酶促方法进行组装，从而实现无需限制性内切酶的构建过程。

由微管相关蛋白tau（MAPT）基因产生的环状RNA示例展示了利用微型基因（minigene）方法分析环状RNA的应用。本示例中使用的tau 9→12微型基因与不同的剪接因子共转染，并通过RT-PCR检测这些剪接因子的作用（图6）。不同的反式作用因子同时影响环状RNA和线性前体mRNA的生成。该实验还表明，环状RNA形成所需的所有序列元件均定位于克隆的片段内。

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讨论

一般来说，环状RNA的丰度较低1，这使得研究其功能和形成机制变得复杂。与线性RNA类似13，利用报告基因微基因（reporter minigenes）可鉴定调控环状RNA形成的顺式和反式作用因子。因此，该方法可提出假设，后续可通过内源基因进一步验证。

最关键的步骤是报告基因的设计。DNA片段的酶促组装（"Gibson克隆"27）有助于这一设计，因为它能够在不依赖限制性酶切位点的情况下构建较大的报告基因。

通过侧翼的反向重复序列可使反向剪接位点相互靠近，这在报告基因构建时应予以考虑。这些重复序列可在基因组浏览器的“重复序列轨迹”中进行注释，选择后可显示其方向。需要注意的是，蛋白质也可促使反向剪接位点形成环状RNA表达所需的二级结构28，为了进行无偏倚分析，应检测侧翼1-2 kb的内含子区域。

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披露

无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作得到了美国国防部（DoD）资助项目AZ180075的支持。Stefan Stamm感谢Jacqueline Noonan基金的支持。Anna Pawluchin获得了德国学术交流中心（DAAD）德国学术交流项目的资助，Justin R. Welden获得了肯塔基大学Max Steckler奖。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(PEI) 盐酸盐Polysciences24765-1
构建工具NEBhttps://nebuilder.neb.com/#!/
暗场读取式透射仪Clare Chemical Research
酶法DNA组装试剂盒NEBE2621S
凝胶与PCR产物纯化试剂盒PromegaA9282
糖蓝（Glyco Blue）Thermo FisherAM9516
pcDNA3.1 克隆位点多克隆位点https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
DNA聚合酶1NEBM0491LQ5 DNA聚合酶
DNA聚合酶2Biorad1725310长片段聚合酶（NEB），iProof（BioRad）
DNA聚合酶2Qiagen206402Qiagen长片段聚合酶试剂盒
逆转录酶Thermo Fisher18080044
RNA提取试剂盒Life Technologies12183025Life Technologies旗下Ambion品牌
RNase RLucigenRNR07250Epicenter/Lucigen
稳定感受态细胞NEBC3040HNEB稳定细胞
常规克隆用细菌NEBC2988JNEB5-alpha感受态细胞
引物设计在线工具NEBhttps://nebuilder.neb.com/#!/
基于网络的温度计算工具NEBhttps://tmcalculator.neb.com/#!/main

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