使用含有 Alu 元件的微基因分析环状 RNA

摘要

我们克隆并分析产生环状RNA的报告基因。这些报告基因比用于分析线性剪接的载体更大，并包含Alu元件。为了研究这些环状RNA，将载体转染入细胞，去除线性RNA后，通过RT-PCR分析所获得的RNA。

摘要

除了线性mRNA外，许多真核基因还能产生环状RNA。大多数环状RNA是通过前体mRNA中一个5'剪接位点与上游的3'剪接位点连接而形成的，这一过程称为反向剪接。这种环化过程可能由前体mRNA中的二级结构促进，这些二级结构使剪接位点彼此靠近。在人类基因中，Alu元件被认为能够促进此类RNA二级结构的形成，因为当Alu元件在前体mRNA中以相反方向存在时，它们含量丰富且彼此之间具有碱基互补性。本文描述了包含大量Alu元件并能形成环状RNA的报告基因的构建与分析方法。通过优化克隆方案，可构建插入片段长度达20 kb的报告基因。在共转染实验中对这些报告基因进行分析，有助于鉴定调控环状RNA生成的因子。因此，该方法可用于识别参与环状RNA形成的RNA序列及细胞组分。

引言

环状RNA
环状RNA（circRNA）是一类在大多数生物体中表达的共价闭合单链RNA。它们通过将下游5'剪接位点与上游3'剪接位点连接而生成，该过程称为反向剪接（图1A）¹。前体mRNA中长度仅为30–40 nt的碱基互补序列可使反向剪接位点正确对齐，从而促进circRNA的形成²。在人类中，Alu元件¹约占基因组的11%³，由于其自身具有互补性，可在前体mRNA中形成广泛的双链RNA结构^4,5，从而促进circRNA的生成¹。

目前，circRNA 的三大主要功能已被阐明。一些 circRNA 可结合微小 RNA（miRNA），并通过隔离作用发挥类似 miRNA 海绵的功能⁶。circRNA 还参与转录及转录后调控，其机制包括与线性剪接竞争⁷，或调节转录因子活性

方案

1. 载体构建的设计

1. 使用 UCSC 基因组浏览器²⁴ 鉴定环状 RNA 形成所必需的重复元件，并将其纳入构建体中。重要的是，用于扩增的引物必须位于重复元件之外。
2. 将环状 RNA 序列（补充图 1 为测试序列）粘贴至 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start，并选择正确的物种。提交序列后进入浏览器视图，放大 1.5 倍或适当调整（图 2A）。
   注意：搜索序列显示在最上方一行（图 2A, 1）。根据环状 RNA 中外显子的排列顺序，BLAT 可能不会连接所有外显子。在此示例中，外显子 12（图 2A, 4）未与外显子 11（图 2A, 2, 3）连接，因为在外显子 12 在环状 RNA 序列中位于外显....

结果

报告基因可用于确定影响环状RNA形成的调控因子。然而，这些报告基因体积较大且含有重复元件，常常导致DNA构建体不稳定。由于其尺寸较大，通常需要删除部分内含子，这可通过扩增包含外显子及较小侧翼内含子区域的基因组片段来实现。这些DNA片段可通过酶促方法进行组装，从而实现无需限制性内切酶的构建过程。

由微管相关蛋白tau（MAPT）基因产生的环状RNA示例展示了利用微型基因（minigene）方法分析环状RNA的应用。本示例中使用的tau 9→12微型基因与不同的剪接因子共转染，并通过RT-PCR检测这些剪接因子的作用（图6）。不同的反式作用因子同时影响环状RNA和线性前体mRNA的生成。该实验还表明，环状RNA形成所需的所有序列元件均定位于克隆的片段内。

讨论

一般来说，环状RNA的丰度较低¹，这使得研究其功能和形成机制变得复杂。与线性RNA类似¹³，利用报告基因微基因（reporter minigenes）可鉴定调控环状RNA形成的顺式和反式作用因子。因此，该方法可提出假设，后续可通过内源基因进一步验证。

最关键的步骤是报告基因的设计。DNA片段的酶促组装（"Gibson克隆"²⁷）有助于这一设计，因为它能够在不依赖限制性酶切位点的情况下构建较大的报告基因。

通过侧翼的反向重复序列可使反向剪接位点相互靠近，这在报告基因构建时应予以考虑。这些重复序列可在基因组浏览器的“重复序列轨迹”中进行注释，选择后可显示其方向。需要注意的是，蛋白质也可促使反向剪接位点形成环状RNA表达所需的二级结构²⁸，为了进行无偏倚分析，应检测侧翼1-2 kb的内含子区域。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(PEI) 盐酸盐	Polysciences	24765-1
构建工具	NEB		https://nebuilder.neb.com/#!/
暗场读取式透射仪	Clare Chemical Research
酶法DNA组装试剂盒	NEB	E2621S
凝胶与PCR产物纯化试剂盒	Promega	A9282
糖蓝（Glyco Blue）	Thermo Fisher	AM9516
pcDNA3.1 克隆位点	多克隆位点		https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
DNA聚合酶1	NEB	M0491L	Q5 DNA聚合酶
DNA聚合酶2	Biorad	1725310	长片段聚合酶（NEB），iProof（BioRad）
DNA聚合酶2	Qiagen	206402	Qiagen长片段聚合酶试剂盒
逆转录酶	Thermo Fisher	18080044
RNA提取试剂盒	Life Technologies	12183025	Life Technologies旗下Ambion品牌
RNase R	Lucigen	RNR07250	Epicenter/Lucigen
稳定感受态细胞	NEB	C3040H	NEB稳定细胞
常规克隆用细菌	NEB	C2988J	NEB5-alpha感受态细胞
引物设计在线工具	NEB		https://nebuilder.neb.com/#!/
基于网络的温度计算工具	NEB		https://tmcalculator.neb.com/#!/main