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方法文章

从E14-E16天Sprague Dawley大鼠胚胎分离的原代海马和皮层神经元混合培养中生成神经球

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DOI：

10.3791/59800

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2019年8月31日

 ,  ,  ,  , 
1Organic and Medicinal Chemistry Division, CSIR-Indian Institute of Chemical Biology, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

本文内容

摘要

本文介绍了一种从高密度接种的神经元中自发生成富含神经前体细胞的神经球的实验方案。在同一实验中，当神经元以较低密度接种时，该方案还可实现原代大鼠神经元的长期培养。

摘要

原代神经元培养是神经科学领域中一项基本的技术。为了更深入地了解大脑的机制，必须建立一种可靠的体外模型，以用于各种神经生物学研究。尽管原代神经元培养（例如长期海马神经元培养）已为科学家提供了研究模型，但其仍未能完全模拟大脑网络的复杂性。针对这些局限性，一种基于神经球的新模型应运而生，该模型更接近真实脑组织的结构特征。本实验方案描述了从胚胎期第14至16天的Sprague Dawley大鼠胚胎中分离混合皮层和海马神经元，并以高密度和低密度接种培养的方法。该方法可同时建立神经球和长期原代神经元培养两种独立平台，用于后续研究。该流程极为简便且成本低廉，省去了以往被认为神经元培养所必需的多个步骤和试剂。本方案要求极简，操作稳定，结果可重复，适用于开展多种神经科学相关研究。

引言

大脑是由神经元和非神经元细胞构成的复杂网络。多年来，科学家一直致力于深入了解这一复杂的系统。为此，神经科学家最初借助多种转化的神经细胞系进行研究。然而，这些克隆细胞系无法形成稳定的突触连接以及正常的轴突或树突，这使得科研兴趣逐渐转向原代神经元培养1,2。原代神经元培养最引人注目的优势在于，它为观察和操控活体神经元提供了可能3。此外，与神经组织相比，其复杂性较低，因此成为研究多种神经元蛋白功能与运输的理想模型。近年来，显微成像、基因组学和蛋白质组学领域的多项进展，为神经科学家利用神经元培养体系创造了新的机遇4。

原代培养使神经科学家能够探索神经发育背后的分子机制，分析多种神经信号通路，并更系统地理解突触形成。尽管已有多种方法报道了原代神经元（主要来源于海马组织5,6,7）的培养，但仍缺乏一种使用化学成分明确培养基、可实现神经元长期培养的统一方案。然而，通常观察到的神经元接种密度较低，难以长期存活，这可能是由于缺乏邻近神经元和胶质细胞所提供的营养支持8所致。一些方法甚至建议将原代神经元与胶质细胞共培养，其中胶质细胞作为饲养层9。然而，胶质细胞容易过度生长，有时会抑制神经元的生长10，带来诸多问题。因此，鉴于上述问题，亟需一种更简便且成本较低的原代神经细胞培养方案，可供神经生物学家和神经化学家广泛用于研究。

原代神经元培养本质上是一种二维培养形式，无法体现大脑的可塑性、空间完整性和细胞异质性。这促使人们需要一种更具可信度的三维模型，即神经球11,12。 神经球为神经科学研究人员提供了一个新颖的平台，其结构更接近真实的体内大脑环境13。神经球是由神经干细胞（NSCs）、神经前体细胞（NPCs）、神经元和星形胶质细胞组成的非贴壁性三维细胞聚集体。它们是分离神经干细胞和神经前体细胞的优良来源，可用于研究向多种神经元及非神经元谱系的分化过程。然而，采用既往报道的实验方案所建立的神经球培养体系仍存在较大变异性，这成为制定统一神经球培养标准方案的主要障碍14。

本文介绍了一种通过交替混合皮层与海马培养物的细胞接种密度，从而生成二维和三维培养平台的实验方案。观察发现，7天内可获得游离的神经球。 从E14-E16天的Sprague Dawley大鼠胚胎中分离出的高密度接种神经元，在进一步培养后，可通过放射状胶质样突起形成神经元桥和相互连接。类似地，低密度接种神经元可建立初级神经元培养体系，通过每周更换两次维持培养基，该体系可维持长达30天。

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方案

所有涉及动物的实验程序均经CSIR-印度化学生物学研究所机构动物伦理委员会批准（IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1）。

1. 试剂与培养基的配制

  1. 多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液：将多聚-D-赖氨酸配制成浓度为 0.1 mg/mL 的去离子水溶液，4 °C 保存备用。
  2. 解离液：在 1 L 无菌过滤的去离子水中，加入以下成分至相应浓度：氯化钠（8 mg/mL）、氯化钾（0.4 mg/mL）、一水合磷酸二氢钾（0.06 mg/mL）、D-葡萄糖（1 mg/mL）、磷酸氢二钠（0.479 mg/mL）以及 1 M HEPES [4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；10 mM]。涡旋振荡以充分混匀，4 °C 保存备用。
    注意：解离过程中使用冰冻的解离液，而洗涤及其他步骤则使用室温（RT）状态的解离液。
  3. 铺板培养基：铺板培养基由以下成分组成：含 Earle's 平衡盐溶液（BSS；88.4%）的 Eagle's 最低必需培养基（MEM）、D-葡萄糖（0.6%）、马血清（10%）以及青霉素/链霉素（1%）。按相应比例混合各成分，并在超净台内无菌条件下操作。
    注意：应始终使用新鲜配制的铺板培养基，以避免任何成分降解。
  4. 维持培养基：按以下比例配制维持培养基：神经基础培养基（Neurobasal medium，97%）、商品化谷氨酰胺溶液（0.5 mM）、无血清 B27 添加剂（2%）以及青霉素/链霉素（1%）。按相应比例混合各成分，并在超净台内无菌条件下操作。确保所有成分均为新鲜配制。

2. 盖玻片的准备

  1. 取一个直径为12 mm的圆形玻璃盖玻片，将其浸泡在1 M盐酸（HCl）中4小时。
  2. 用镊子将盖玻片转移至蒸馏水中，并轻轻搅动，以彻底去除残留的酸。
  3. 将清洗后的盖玻片放入盛有100%乙醇的烧杯中，进行进一步清洁处理。
  4. 在使用盖玻片前，将其置于纸巾上，在超净工作台中充分干燥。

3. 神经元培养用多聚-D-赖氨酸包被培养板的制备

  1. 取两个24孔板：一个用于高密度铺板，另一个用于低密度铺板。仅在超净台内打开无菌包装。
  2. 将12 mm的无菌玻璃盖玻片转移至24孔板中。
  3. 每孔加入300 µL多聚赖氨酸溶液（0.1 mg/mL，溶于去离子水中），确保溶液完全覆盖盖玻片表面。
  4. 用铝箔纸包裹孔板以防止干燥，并于CO2培养箱中过夜孵育。
  5. 次日（铺板前），吸除多聚赖氨酸溶液，用300 µL无菌去离子水充分洗涤两到三次。
  6. 每孔加入200 µL新鲜配制的铺板培养基，随后将孔板放回培养箱中，待铺板时使用。

4. 胎儿的取出与断头

注意：将用铝箔纸包裹的所有手术器械在高压灭菌器中于 121 °C（15 psi）条件下灭菌 30 分钟。整个操作过程所需的器械包括：一对钝头剪刀、镊子、精细镊子、两把精细剪刀和一把动脉夹。

  1. 为生成神经元和神经球，使用妊娠时间确定的Sprague Dawley大鼠，并以检测到阴道栓的当天记为E0。
    ​注意：培养必须在E14至E16之间进行。
  2. 在培养当天，将无菌玻璃培养皿置于冰上，并加入冰冷的Hank's平衡盐溶液（HBSS）。
  3. 通过腹腔注射（i.p.）给予E14至E16妊娠大鼠每公斤体重90 mg的氯胺酮和每公斤体重10 mg的赛拉嗪进行麻醉，随后通过颈椎脱位处死动物。
    注意：也可通过过量戊巴比妥、过量氯胺酮联合赛拉嗪或地西泮进行安乐死。
  4. 用70%乙醇喷洒母鼠腹部进行消毒，然后使用无菌镊子和钝头剪刀在腹部做V形切口。
  5. 将胚胎囊小心转移至盛有冰冷HBSS溶液的培养皿中。
    注意：切勿使用刚刚用于皮肤操作的同一把镊子和剪刀，以免污染内脏器官。应使用另一套专用的剪刀/镊子处理内脏器官。
  6. 在新鲜且冰冷的HBSS中将胚胎从胚胎囊中取出。
  7. 使用无菌剪刀剪下头部。

5. 脑组织的取出及伴有海马的皮层解剖

  1. 开始前，将冷的无菌 HBSS 加入 90 mm 无菌培养皿中。
  2. 使用无菌钝头敷料镊将头部转移至无菌培养皿中。
  3. 在体视显微镜下，用无菌锯齿状镊子夹住头部的吻部区域，切开皮肤和颅骨以取出脑组织。
  4. 以相同方式将所有胚胎脑组织收集到 HBSS 溶液中。
  5. 夹住脑干，去除大脑半球和中脑上的所有脑膜。
  6. 小心分离出完整的大脑半球，其形状类似蘑菇帽，包含海马和皮层。
  7. 将含有皮层和完整海马的大脑半球收集到含有 10 mL 解离液的 15 mL 锥形管中。

6. 将皮层和海马组织解离为单个神经元

  1. 让收集的组织自然沉降，吸除消化液，保留5%-10%的培养基。
  2. 向组织中加入10 mL新鲜解离培养基，重复步骤6.1两次。
  3. 加入4.5 mL解离液和0.5 mL 0.25%（1×）胰蛋白酶EDTA（乙二胺四乙酸）溶液。
  4. 将组织置于37 °C培养箱中孵育20分钟，以进行消化。
  5. 吸弃培养基，随后向消化后的组织中连续加入10 mL解离与铺板培养基。
  6. 让消化后的组织沉淀，吸除解离液。加入2.5 mL铺板培养基，倒入90 mm无菌培养皿底部。
  7. 使用1,000 µL移液器吸头在培养皿的底部角落反复吹打消化后的组织，以占据最小体积。
  8. 将获得的细胞悬液通过70 µm细胞滤网，去除任何组织块。
  9. 使用台盼蓝染料排斥法测定活细胞密度，并利用自动细胞计数仪对细胞数量进行计数。
    1. 对于台盼蓝染料排斥法，取10 µL细胞悬液与10 µL 0.4%台盼蓝染色液，充分混匀，然后取10 µL混合液加入一次性腔室载玻片的两个封闭腔室之一中。
    2. 将含有混合液的载玻片插入细胞计数仪，获取读数。
      注意：台盼蓝染料排斥法的原理是，活细胞由于细胞膜完整，能够排斥台盼蓝染料，细胞质呈透明状；而死细胞则容易摄取台盼蓝，呈现蓝色。15.
  10. 将获得的细胞稀释至 1.5 × 10⁵ 个细胞，用于接种培养5 高密度为每管30 mL铺板培养基中接种100,000个细胞/mL，低密度为每管30 mL铺板培养基中接种20,000个细胞/mL。
  11. 吸去各孔中先前加入的铺板培养基，每孔加入500 µL用铺板培养基悬浮的细胞。
  12. 之后将培养板放回 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中2 4小时。
  13. 铺板后4小时，在显微镜下观察细胞贴壁情况。
  14. 如果两个培养板中的细胞均贴壁良好，则将每孔中的培养基更换为500 µL新鲜维持培养基，并在37 °C下继续培养。
  15. 将低密度培养的神经元继续培养30天，每周更换2次维持培养基。
  16. 将高密度接种的神经元获得的神经球转移至超低吸附培养板中，用相同的维持培养基进行培养。
  17. 使用重要标志物对神经元和神经球进行免疫染色表征。进行免疫细胞化学染色时，首先在培养板中用4%甲醛固定细胞/神经球30分钟，随后用0.1%非离子型去污剂对细胞进行10分钟透化处理。
  18. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中按1:300浓度加入针对神经元（抗Tuj1、GFAP、O4、tau）和神经球（抗Nestin、GFAP、Tuj1）的一抗，4 °C孵育过夜16.
    注意：Tuj1（III类β-微管蛋白）和tau是原代神经元的阳性标志物，而GFAP（胶质纤维酸性蛋白）和O4（少突胶质细胞标志物）是原代神经元的阴性标志物17,18对于神经球而言，Tuj1、GFAP 和 Nestin 均 作为阳性标志物19,20.
  19. 次日，用 PBS 洗涤细胞一至两次，在室温下以 1:600 的浓度加入适量的二抗 PBS 溶液，孵育 2 小时。
    注意：根据所添加的一抗的宿主物种选择相应的抗小鼠或抗兔二抗。需注意二抗必须偶联适用于荧光显微镜检测的荧光衍生物。
  20. 用 PBS 再次清洗细胞一至两次。
    1. 用Hoechst 33258（1 mg/mL储存液，溶于去离子水）对细胞进行核染色。将储存液用PBS稀释成0.1%的Hoechst溶液，并加入细胞中。
    2. 将细胞与0.1% Hoechst溶液孵育30分钟，然后用PBS再次洗涤。
  21. 在载玻片上加入 20 µL PBS（或封片剂），然后缓慢将含有染色细胞的盖玻片覆盖在载玻片上含有 PBS 的区域。用邻苯二甲酸二丁酯聚苯乙烯二甲苯（DPX）密封盖玻片边缘。
  22. 在显微镜下以10倍和40倍放大倍数对固定后的细胞进行成像。

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结果

在本方案中，阐明了一种简单策略，可获得来自两种不同神经筛选平台的可变细胞接种密度。 图1A,B 分别展示了神经元在高密度和低密度接种后4小时的细胞贴壁情况。通过观察神经元的正常贴壁状态，如图所示 图1，每个孔中的铺板培养基被更换为维持培养基，并随后放回培养箱中 37 °C高密度接种的神经元中观察到相对更多的细胞黏附。接种24小时后，高密度和低密度接种的神经元均表现出复杂的神经突起和突触连接，这在微分干涉相差（DIC）图像中可见。 图 2A,B.

在图3A中，展示了低密度接种的神经元在培养7天后的相差图像。此时，神经元已发育出由树突分支构成的复杂突触网...

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讨论

本方案描述了如何通过改变 原代神经元的细胞接种密度，两种可变的神经元平台 获得。尽管这是一种简单的方法，但每一步都必须仔细操作才能获得理想的结果。以往其他方法曾报道过长期原代神经元培养或神经球培养。大多数原代神经元培养方案涉及海马神经元培养3-5周，但多数未能成功，因为神经元因失去连接而死亡并萎缩。本方案的另一优势在于，神经元培养无需任何胶质细胞饲养层，从而保持神经元的纯度。

然而，必须严格遵循若干关键步骤才能获得理想的结果。首先，整个操作过程必须保持无菌条件。建议在层流罩内进行大部分操作，并在开始前用70%酒精对所有培养皿、器械和手术工具进行预清洁；否则，由于细菌和真菌污染，实验失败的风险将显著增加。其次，准确分离E14-16胚胎至关重要，因此必须仔细完成阴道栓检测步骤。随着胚胎发育天数的增加，非神经元细胞污染的可能性也随之升高。彻底去除大脑半球的脑膜对于减少非神经元细胞对培养的干扰极为关键。接种培养基和维持培养基均需新鲜配制，并包含所有组分，因为每个组分都发挥着重要作用。另一个需要注意的因素是，所获得的原代神经元必须通过每周更换两次维持培养基来持续养护，以确...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们感谢CSIR-IICB动物实验中心。G. D. 感谢印度医学研究理事会（ICMR）提供的奖学金，J. K. 和 V. G. 感谢印度科技部DST Inspire项目提供的奖学金，D. M. 感谢印度生物技术部（DBT）提供的奖学金。S. G. 衷心感谢印度科学与工程研究委员会（SERB，项目号：EMR/2015/002230）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗GFAPAbcamAB7260
抗NestinAbcamAB92391
抗O4MilliporeMAB345
抗TauAbcamAB76128
抗Tuj1MilliporeMAB1637
B27无血清培养基添加剂 Gibco17504-044
细胞计数仪Life technologiesCountess II FL
CO2培养箱EppendorfGalaxy 170 R
D-葡萄糖 SDFCL38450-K05
乙醇Merck Millipore100983
荧光显微镜OlympusIX83型号
甲醛Sigma Aldrich47608
GlutaMax-I添加剂Gibco35050-061
山羊抗小鼠IgG荧光抗体MilliporeAP1814
山羊抗小鼠IgG（H+L）MilliporeAP124C
HEPESSRL16826
Hoechst 33258Calbiochem382061
马血清 HiMediaRM10674
盐酸RankemH0100
超净工作台BioBaseBBS-V1800
含Earle's BSS的MEM Eagle培养基’’ Sigma AldrichM-2279
显微镜DewinterVictory型号
Neurobasal培养基 Gibco21103-049
塑料耗材（24孔板、细胞筛和低黏附培养板）BD Falcon353047、352350和3471
90 mm培养皿HimediaPW001
青霉素/链霉素 Gibco15140-122
多聚-D-赖氨酸MilliporeA.003.E
氯化钾 Fisher ScientificBP366-500
磷酸二氢钾 MerckMI6M562401
氯化钠 Qualigem15918
磷酸氢二钠 MerckMI6M562328
体视显微镜DewinterZoomstar型号
Triton-X 100SRL2020130
台盼蓝溶液Gibco15250-061
0.25%胰蛋白酶-EDTAGibco25200-072

参考文献

  1. Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
  2. Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
  3. Banker, G. Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
  4. Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
  5. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
  6. Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797(2016).
  7. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703(2014).
  8. Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
  9. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  10. Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
  11. Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
  12. Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
  13. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
  15. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  16. Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
  17. Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
  18. Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  19. Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
  20. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
  21. Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449(2014).
  22. Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
  23. Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
  24. Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467(2015).
  25. Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
  26. Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).

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