从E14-E16天Sprague Dawley大鼠胚胎分离的原代海马和皮层神经元混合培养中生成神经球

摘要

本文介绍了一种从高密度接种的神经元中自发生成富含神经前体细胞的神经球的实验方案。在同一实验中，当神经元以较低密度接种时，该方案还可实现原代大鼠神经元的长期培养。

摘要

原代神经元培养是神经科学领域中一项基本的技术。为了更深入地了解大脑的机制，必须建立一种可靠的体外模型，以用于各种神经生物学研究。尽管原代神经元培养（例如长期海马神经元培养）已为科学家提供了研究模型，但其仍未能完全模拟大脑网络的复杂性。针对这些局限性，一种基于神经球的新模型应运而生，该模型更接近真实脑组织的结构特征。本实验方案描述了从胚胎期第14至16天的Sprague Dawley大鼠胚胎中分离混合皮层和海马神经元，并以高密度和低密度接种培养的方法。该方法可同时建立神经球和长期原代神经元培养两种独立平台，用于后续研究。该流程极为简便且成本低廉，省去了以往被认为神经元培养所必需的多个步骤和试剂。本方案要求极简，操作稳定，结果可重复，适用于开展多种神经科学相关研究。

引言

大脑是由神经元和非神经元细胞构成的复杂网络。多年来，科学家一直致力于深入了解这一复杂的系统。为此，神经科学家最初借助多种转化的神经细胞系进行研究。然而，这些克隆细胞系无法形成稳定的突触连接以及正常的轴突或树突，这使得科研兴趣逐渐转向原代神经元培养^1,2。原代神经元培养最引人注目的优势在于，它为观察和操控活体神经元提供了可能³。此外，与神经组织相比，其复杂性较低，因此成为研究多种神经元蛋白功能与运输的理想模型。近年来，显微成像、基因组学和蛋白质组学领域的多项进展，为神经科学家利用神经元培养体系创造了新的机遇⁴。

原代培养使神经科学家能够探索神经发育背后的分子机制，分析多种神经信号通路，并更系统地理解突触形成。尽管已有多种方法报道了原代神经元（主要来源于海马组织^5,6,7）的培养，但仍缺乏一种使用化学成分明确培养基、可实现神经元长期培养的统一方案。然而，通常观察到的神经元接种密度较低，难以长期存活，这可能是由于缺乏邻近神经元和胶质细胞所提供的营养支持^....

方案

所有涉及动物的实验程序均经CSIR-印度化学生物学研究所机构动物伦理委员会批准（IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1）。

1. 试剂与培养基的配制

1. 多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液：将多聚-D-赖氨酸配制成浓度为 0.1 mg/mL 的去离子水溶液，4 °C 保存备用。
2. 解离液：在 1 L 无菌过滤的去离子水中，加入以下成分至相应浓度：氯化钠（8 mg/mL）、氯化钾（0.4 mg/mL）、一水合磷酸二氢钾（0.06 mg/mL）、D-葡萄糖（1 mg/mL）、磷酸氢二钠（0.479 mg/mL）以及 1 M HEPES [4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；10 mM]。涡旋振荡以充分混匀，4 °C 保存备用。
   注意：解离过程中使用冰冻的解离液，而洗涤及其他步骤则使用室温（RT）状态的解离液。
3. 铺板培养基：铺板培养基由以下成分组成：含 Earle's 平衡盐溶液（BSS；88.4%）的 Eagle's 最低必需培养基（MEM）、D-葡萄糖（0.6%）、马血清（10%）以及青霉素/链霉素（1%）。按相应比例混合各成分，并在超净台内无菌条件下操作。
   注意：应始终使用新鲜配制的铺板培养基，以避免任何成分降解。
4. 维持培养基：按以下比例配制维持培养基：神经基础培养基（Neurobasal medium，97%）、商品化谷氨酰胺溶液（0.5 mM）、无血清 B....

结果

在本方案中，阐明了一种简单策略，可获得来自两种不同神经筛选平台的可变细胞接种密度。 图1A,B 分别展示了神经元在高密度和低密度接种后4小时的细胞贴壁情况。通过观察神经元的正常贴壁状态，如图所示 图1，每个孔中的铺板培养基被更换为维持培养基，并随后放回培养箱中 37 °C高密度接种的神经元中观察到相对更多的细胞黏附。接种24小时后，高密度和低密度接种的神经元均表现出复杂的神经突起和突触连接，这在微分干涉相差（DIC）图像中可见。 图 2A,B.

在图3A中，展示了低密度接种的神经元在培养7天后的相差图像。此时，神经元已发育出由树突分支构成的复杂突触网.......

讨论

本方案描述了如何通过改变 原代神经元的细胞接种密度，两种可变的神经元平台 获得。尽管这是一种简单的方法，但每一步都必须仔细操作才能获得理想的结果。以往其他方法曾报道过长期原代神经元培养或神经球培养。大多数原代神经元培养方案涉及海马神经元培养3-5周，但多数未能成功，因为神经元因失去连接而死亡并萎缩。本方案的另一优势在于，神经元培养无需任何胶质细胞饲养层，从而保持神经元的纯度。

然而，必须严格遵循若干关键步骤才能获得理想的结果。首先，整个操作过程必须保持无菌条件。建议在层流罩内进行大部分操作，并在开始前用70%酒精对所有培养皿、器械和手术工具进行预清洁；否则，由于细菌和真菌污染，实验失败的风险将显著增加。其次，准确分离E14-16胚胎至关重要，因此必须仔细完成阴道栓检测步骤。随着胚胎发育天数的增加，非神经元细胞污染的可能性也随之升高。彻底去除大脑半球的脑膜对于减少非神经元细胞对培养的干扰极为关键。接种培养基和维持培养基均需新鲜配制，并包含所有组分，因为每个组分都发挥着重要作用。另一个需要注意的因素是，所获得的原代神经元必须通过每周更换两次维持培养基来持续养护，以确.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗GFAP	Abcam	AB7260
抗Nestin	Abcam	AB92391
抗O4	Millipore	MAB345
抗Tau	Abcam	AB76128
抗Tuj1	Millipore	MAB1637
B27无血清培养基添加剂	Gibco	17504-044
细胞计数仪	Life technologies	Countess II FL
CO2培养箱	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-葡萄糖	SDFCL	38450-K05
乙醇	Merck Millipore	100983
荧光显微镜	Olympus	IX83型号
甲醛	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I添加剂	Gibco	35050-061
山羊抗小鼠IgG荧光抗体	Millipore	AP1814
山羊抗小鼠IgG（H+L）	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
马血清	HiMedia	RM10674
盐酸	Rankem	H0100
超净工作台	BioBase	BBS-V1800
含Earle's BSS的MEM Eagle培养基’’	Sigma Aldrich	M-2279
显微镜	Dewinter	Victory型号
Neurobasal培养基	Gibco	21103-049
塑料耗材（24孔板、细胞筛和低黏附培养板）	BD Falcon	353047、352350和3471
90 mm培养皿	Himedia	PW001
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
多聚-D-赖氨酸	Millipore	A.003.E
氯化钾	Fisher Scientific	BP366-500
磷酸二氢钾	Merck	MI6M562401
氯化钠	Qualigem	15918
磷酸氢二钠	Merck	MI6M562328
体视显微镜	Dewinter	Zoomstar型号
Triton-X 100	SRL	2020130
台盼蓝溶液	Gibco	15250-061
0.25%胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-072