从小鼠血液中纯化血小板

摘要

本实验中，使用抗凝剂收集小鼠血液。通过碘克沙醇梯度介质并采用低速离心法纯化血小板。加入凝血酶激活血小板，以检测其是否具有活性。采用流式细胞术和显微镜检查分析纯化后血小板的质量。

摘要

血小板从全血中纯化以研究其功能特性，纯化产物应不含红细胞（RBC）、白细胞（WBC）和血浆蛋白。本文描述了从小鼠血液中纯化血小板的方法：使用相对于血样体积三倍量的碘海醇梯度介质，在水平转子中于20 °C以400 × g 离心20分钟。纯化后血小板的回收率/得率为18.2–38.5%，且血小板处于静息状态，不含显著数量的红细胞和白细胞。经凝血酶处理后，纯化血小板激活率可达93%，表明其具有良好的活性。我们通过流式细胞术和显微镜评估验证了纯化血小板的纯度。这些血小板可用于基因表达、激活、颗粒释放、聚集和黏附等实验检测。该方法也可用于其他物种血液中血小板的纯化。

引言

血小板是血液的一种组分，在血管受损时可启动血液凝固过程。它们会聚集到损伤部位，以堵塞血管壁的破损处¹。血小板是无细胞核的细胞质碎片，由骨髓中的巨核细胞在血小板生成素的作用下产生，并进入血液循环²。血小板具有代谢活性，能够通过激活细胞内信号级联反应来感知细胞外环境，从而导致血小板铺展、聚集以及止血栓的形成^1,3。除了在止血/血栓形成和伤口愈合中发挥作用⁴外，血小板还在机体炎症反应、血管生成以及肿瘤转移过程中发挥重要作用^3,5,6,7,8。

血小板从血液中纯化以研究其生化和生理特性，纯化后的血小板应不含其他血液成分。由于红细胞（RBC）和白细胞（WBC）所含的RNA和蛋白质显著多于血小板^9,10<....

方案

小鼠采血应获得适当的机构动物护理和使用委员会批准。

注意： 血小板纯化方案在图1的流程图中进行了描述。

1. 血液采集

1. 在聚丙烯管中加入 25 µL 3.2% 枸橼酸钠（pH 7.2）作为抗凝剂，并加入 0.4 mM 的 Gly-Pro-Arg-Pro（GPRP）。
2. 使用眼眶后取血法从 C57BL/6 小鼠采集约 200 µL 血液。
   注意：可从任意品系、年龄或性别的小鼠采集血液。
   1. 在任意类型的麻醉舱中使用 2 mL 异氟烷对小鼠进行麻醉。
      注意：通过观察呼吸加深和活动减少来判断麻醉深度。小鼠在麻醉舱移动或被触碰时应无反应。若小鼠对移动或触碰有反应，则需延长其在麻醉舱中的时间。
   2. 打开小鼠右侧或左侧眼睑，将一根长 7.5 cm（直径 0.12 cm）的毛细管插入眼部血管丛。
   3. 在毛细管上施加压力的同时旋转半圈，以破裂血管并启动血液流动。将动物倒置在收集管上方，使血液通过毛细作用流入管中。
   4. 当采集到所需血量后，移出毛细管，并用纱布轻压眼睑 30 秒以闭合眼睛。止血后，将小鼠放回笼中，并观察是否继续出血。

结果

血小板纯化的概述以流程图形式展示（图1）。步骤包括在抗凝剂存在下通过小鼠眶后静脉采血，将血液样本加至碘海醇梯度培养基上，使用摆动转子在20 °C条件下以400 × g 离心20分钟。纯化后血小板的质量通过显微镜和流式细胞术进行评估，在使用抗体染色后检测是否存在污染细胞及活化血小板。

如果将血液样本缓慢加至介质上，则碘海醇梯度介质与血液样本在离心管中会形成两个独立的层（图2A）。然而，若此步骤存在延迟，大部分血液样本可能扩散进入介质中，从而难以纯化血小板。宽口移液吸头可确保血小板不受物理应力，这对于维持血小板完整性并防止其降解至关重要。离心过程中，缓慢加速有助于防止血液样本与碘海醇介质意外混合，而缓慢减速则有助于在离心后维持梯度结构。最上层（淡黄色）为血浆层，不含任何完整的血细胞；第二层（乳白色）主要含有血小板，使用宽口移液吸头收集该层；第三层（透明）为血小板贫乏层，需小心部分收集，以避免吸入底层（红色）的红细胞和白细胞（

讨论

通常，血小板通过低速离心法分离，该方法获得的血小板富集血浆中含有大量血细胞、细胞碎片和血浆蛋白，这些成分可能干扰生化和生理检测，需要进一步纯化²¹。因此，采用一种快速且简便的方法以获得无显著污染物的纯化血小板显得尤为重要。本文所述方案介绍了利用梯度介质结合低速离心法从小鼠血液中纯化血小板的方法。本方案所用参数可最大化血小板得率并最小化其降解。在收集血小板后增加洗涤步骤，可去除梯度介质和血浆蛋白，从而提高血小板对激动剂或抗体的敏感性。最重要的是，所获得的纯化血小板处于静息状态，但在激动剂（如凝血酶）存在下可被激活。我们发现，不同来源的凝血酶活性存在差异。因此，应通过实验经验优化凝血酶浓度，以实现良好的血小板激活效果。

由于小鼠血液体积较小，血小板纯化存在不便，因为在吸取过程中血小板可能与红细胞和白细胞混合。我们通过优化血液样本与梯度介质的比例解决了这一问题。研究发现，梯度介质体积为血液体积的三倍时，可清晰地将血小板层与血清层及红细胞-白细胞层分离，从而便于纯血小板的收集。

血小板纯.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 标记的抗小鼠/人 CD62P（P-选择素）大鼠抗体	Thermoscientific	17-0626-82	血小板活化标志物
Eppendorf 管	Fisher Scientific	14-222-166	离心用管
FACS DIVA 软件	BD Biosciences	Non-catalog item	血小板和全血分析
FACS 管	Fisher Scientific	352008	流式细胞术用管
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	26140079	染色缓冲液组分
FITC 标记的抗小鼠 CD41 大鼠抗体	BD Biosciences	553848	血小板标志物
流式细胞仪	BD Biosciences	Non-catalog item	血小板和全血分析
FlowJo 软件	FlowJo, Inc.	Non-catalog item	血小板和全血分析
甘氨酰-脯氨酰-精氨酰-脯氨酸（GPRP）	EMD Millipore	03-34-0001	防止血小板凝块形成
血细胞比容毛细管	Fisher Scientific	22-362566	血液采集毛细管
Hemavet 血液分析仪	Drew Scientific	Non-catalog item	血细胞分析仪
血细胞计数板	Hausser Scientific	3100	细胞计数室
异氟烷	Baxter	1001936040	用于小鼠麻醉
显微镜（Olympus CKX41）	Olympus	Non-catalog item	细胞观察与计数
Nycodenz（Histodenz）	Sigma-Aldrich	D2158	密度梯度介质
PE 标记的抗小鼠 CD45 大鼠抗体	BD Biosciences	561087	白细胞标志物
PE-Cy7 标记的抗小鼠 TER-119 大鼠抗体	BD Biosciences	557853	红细胞标志物
200 µL 宽口移液器吸头	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	用于转移血液和血小板样本
1000 µL 宽口移液器吸头	ThermoFisher Scientific	21-236-2C	用于转移血液和血小板样本
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher Scientific	14040-117	洗涤和稀释用缓冲液
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	生理盐水
柠檬酸钠	Fisher Scientific	02-688-26	抗凝剂
染色缓冲液	本实验室制备	Non-catalog item	洗涤和稀释缓冲液
无菌水	本实验室制备	Non-catalog item	溶剂
台式离心机	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	水平转子离心机
凝血酶	Enzyme Research Laboratory	HT 1002a	血小板活化激动剂
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377	Nycodenz 介质用缓冲液