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方法文章

从小鼠血液中纯化血小板

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DOI：

10.3791/59803

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2019年5月7日

 , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine

本文内容

摘要

本实验中，使用抗凝剂收集小鼠血液。通过碘克沙醇梯度介质并采用低速离心法纯化血小板。加入凝血酶激活血小板，以检测其是否具有活性。采用流式细胞术和显微镜检查分析纯化后血小板的质量。

摘要

血小板从全血中纯化以研究其功能特性，纯化产物应不含红细胞（RBC）、白细胞（WBC）和血浆蛋白。本文描述了从小鼠血液中纯化血小板的方法：使用相对于血样体积三倍量的碘海醇梯度介质，在水平转子中于20 °C以400 × g 离心20分钟。纯化后血小板的回收率/得率为18.2–38.5%，且血小板处于静息状态，不含显著数量的红细胞和白细胞。经凝血酶处理后，纯化血小板激活率可达93%，表明其具有良好的活性。我们通过流式细胞术和显微镜评估验证了纯化血小板的纯度。这些血小板可用于基因表达、激活、颗粒释放、聚集和黏附等实验检测。该方法也可用于其他物种血液中血小板的纯化。

引言

血小板是血液的一种组分，在血管受损时可启动血液凝固过程。它们会聚集到损伤部位，以堵塞血管壁的破损处1。血小板是无细胞核的细胞质碎片，由骨髓中的巨核细胞在血小板生成素的作用下产生，并进入血液循环2。血小板具有代谢活性，能够通过激活细胞内信号级联反应来感知细胞外环境，从而导致血小板铺展、聚集以及止血栓的形成1,3。除了在止血/血栓形成和伤口愈合中发挥作用4外，血小板还在机体炎症反应、血管生成以及肿瘤转移过程中发挥重要作用3,5,6,7,8。

血小板从血液中纯化以研究其生化和生理特性，纯化后的血小板应不含其他血液成分。由于红细胞（RBC）和白细胞（WBC）所含的RNA和蛋白质显著多于血小板9,10，即使存在少量这些细胞，也可能干扰来源于血小板的RNA和蛋白质的转录组学和蛋白质组学分析。我们发现，经凝血酶激活的纯化血小板比全血中的血小板更高效地结合抗体，例如抗GPIIb/IIIa（JON/A）和抗P-选择素。

由于血小板较为脆弱，因此在处理样本时应尽可能轻柔。如果血小板被激活，它们会释放颗粒内容物并最终降解。因此，为了保持血小板的功能特性完整，在分离过程中维持血小板的静息状态至关重要。已有多种文献报道了通过不同方法从人、狗、大鼠和非人灵长类动物中分离血小板的方案1,10,11,12。其中一些方法需要多个步骤，例如通过离心收集富血小板血浆、使用分离柱进行过滤、利用与磁珠偶联的红细胞和白细胞特异性抗体对血小板进行负向筛选等，这些步骤耗时较长，且可能导致血小板及其内容物的降解。

Ford 及其同事描述了使用碘海醇介质从人血中纯化血小板的方法11。该方法在纯化过程中使用的血样和介质体积相近。由于人类可提供较大量的血液，因此相对容易实现血小板的纯化。

碘海醇是一种通用的密度梯度惰性介质，可自由溶于水，用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白的分离13,14。其渗透压低且无毒性，因此是纯化完整活细胞的理想介质11。它为非颗粒性介质，因此可通过血细胞计数板、流式细胞仪或分光光度计测定细胞在梯度中的分布情况。经稀释后，它不会干扰细胞或细胞碎片的大多数酶促或化学反应。

小鼠是研究多种人类疾病的重要动物模型15,16,17,18。已有少数发表的文章描述了小鼠血小板的纯化方法19,20。然而，小鼠采血量相对较少，这使得血小板的纯化较为困难。若使用相同的小体积梯度介质和血液样本，离心后血小板层无法与红细胞-白细胞层清晰分离。本文介绍了一种快速且简便的小鼠血小板纯化方法，该方法采用相对于血液样本体积三倍量的碘海醇梯度介质，并结合低速离心。我们还使用凝血酶激活纯化的血小板，并通过流式细胞术和显微镜检查其质量。

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方案

小鼠采血应获得适当的机构动物护理和使用委员会批准。

注意： 血小板纯化方案在图1的流程图中进行了描述。

1. 血液采集

  1. 在聚丙烯管中加入 25 µL 3.2% 枸橼酸钠（pH 7.2）作为抗凝剂，并加入 0.4 mM 的 Gly-Pro-Arg-Pro（GPRP）。
  2. 使用眼眶后取血法从 C57BL/6 小鼠采集约 200 µL 血液。
    注意：    可从任意品系、年龄或性别的小鼠采集血液。
    1. 在任意类型的麻醉舱中使用 2 mL 异氟烷对小鼠进行麻醉。
      注意：通过观察呼吸加深和活动减少来判断麻醉深度。小鼠在麻醉舱移动或被触碰时应无反应。若小鼠对移动或触碰有反应，则需延长其在麻醉舱中的时间。
    2. 打开小鼠右侧或左侧眼睑，将一根长 7.5 cm（直径 0.12 cm）的毛细管插入眼部血管丛。
    3. 在毛细管上施加压力的同时旋转半圈，以破裂血管并启动血液流动。将动物倒置在收集管上方，使血液通过毛细作用流入管中。
    4. 当采集到所需血量后，移出毛细管，并用纱布轻压眼睑 30 秒以闭合眼睛。止血后，将小鼠放回笼中，并观察是否继续出血。
    5. 眼眶后取血后 1–2 天内检查眼睛是否有创伤。若小鼠因操作导致眼部出现明显创伤，应将其从实验中剔除并实施安乐死。
      注意：小鼠在采血前至少两周内不得接受任何可能抑制血小板功能的处理。血液样本必须在取血后一小时内用于血小板纯化。

2. 血小板纯化

注意：血小板纯化应在室温下进行，以防止其降解。确保试剂和仪器的温度在 18 至 22 °C 之间。为防止血小板降解，操作过程中应避免快速移液和剧烈振荡。

  1. 在1.5 mL离心管中加入600 µL碘海醇梯度介质（12%碘海醇粉末溶于0.85%氯化钠、5 mM Tricine，pH 7.2）11。
  2. 使用宽口移液器吸头，沿管壁缓慢将200 µL血液样本加至梯度介质上方，避免血液与碘海醇介质混合（图2A）。
  3. 将含有样本的离心管在20 °C下以400 × g离心20分钟，使用水平转子，加速度和减速度均设为缓慢。
  4. 使用宽口移液器吸头收集大部分富血小板层及少量贫血小板层（总体积300至400 µL），注意勿扰动红细胞层和白细胞层（图2B）。将血小板样本转移至新离心管。
    注意：若血液中血小板计数较低或使用血液体积较小，则富血小板层与贫血小板层可能合并为单一层次。
  5. 向血小板样本中加入1 mL PBS，通过反复倒置混匀，然后在20 °C下以800 × g离心10分钟（使用水平转子）。彻底弃去上清液，加入200 µL PBS，轻轻吹打重悬血小板。
    注意：此步骤为可选步骤，可去除梯度介质和血浆蛋白，提高血小板对凝血酶等激动剂的敏感性。由于不同离心机程序设置不同，缓慢加/减速参数应参考离心机用户手册进行设定。
  6. 取30 µL上述样本转移至新离心管用于血小板计数。剩余血小板可用于生化与生理学检测，如血小板活化、聚集、颗粒释放等实验。
  7. 如需进行RNA或蛋白质提取，将血小板样本在800 × g离心10分钟以沉淀血小板。彻底弃去上清液，注意勿扰动沉淀。加入适量体积的RNA或蛋白质裂解缓冲液以裂解血小板。

3. 血小板计数

  1. 使用自动细胞分析仪对未稀释的全血细胞和经PBS稀释2至5倍的纯化血小板进行计数。计数时使用30至50 µL样本。
  2. 将计数值乘以样本体积，计算血小板总数。
  3. 计算纯化血小板的得率/回收率百分比。
  4. 使用血细胞计数板和显微镜，对经PBS稀释50至100倍的纯化血小板样本中的红细胞（RBC）和白细胞（WBC）进行计数。

4. 血小板活化

  1. 在离心管中加入1至200万个纯化的血小板，体积不超过100 µL的染色缓冲液（含2%胎牛血清的PBS）。
  2. 对于多个样本，配制抗体主混合液，每种抗体各取1 µL（0.5 mg/mL），包括PE-Cy7标记的抗小鼠TER-119抗体、PE标记的抗小鼠CD45抗体、FITC标记的抗小鼠CD41抗体，以及APC标记的抗小鼠/人CD62P（P-选择素）抗体，分别用于检测红细胞、白细胞、血小板和活化血小板。将主混合液加入各离心管中以染色细胞。切勿加入凝血酶。
  3. 在另一离心管中加入1至200万个纯化的血小板，体积不超过100 µL的染色缓冲液，并加入0.4 mM GPRP肽。随后加入凝血酶以活化血小板，并按照步骤4.2进行染色。
    注意：为防止血小板活化导致聚集或凝块形成，应在加入凝血酶前先加入GPRP。凝血酶浓度需优化，以获得良好的血小板活化效果。血小板活化后，在流式细胞术检测过程中事件计数会减少。
  4. 作为阳性对照，在离心管中加入最多100 µL染色缓冲液和1 µL全血，并加入0.4 mM GPRP肽，随后加入凝血酶以活化血小板。作为阴性对照，在离心管中加入最多100 µL染色缓冲液和1 µL全血，阴性对照样本中不加入凝血酶。按照步骤4.2进行细胞染色。
  5. 进行流式细胞术同型对照实验时，标记5个离心管，分别标注为未染色、PE-Cy7、PE、FITC和APC。向各标记管中加入100 µL染色缓冲液、1 µL血液以及1 µL相应的抗体，用于细胞染色。
  6. 将样本在室温避光条件下孵育30分钟，完成染色。
  7. 向每管中加入1 mL染色缓冲液洗涤样本，在室温下以800 × g 离心5分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。
  8. 向每管中加入300 µL染色缓冲液，轻轻混匀后转移至FACS管中。将染色后的样本避光保存，直至使用流式细胞仪进行分析。

5. 血小板的流式细胞术分析

  1. 创建新实验，在FACS DIVA软件中根据所选的设门策略生成对数前向散射（log forward scatter）与对数侧向散射（log side scatter）点图，并为Ter119 PE-Cy7（红细胞）、CD45 PE（白细胞）、CD41 FITC（血小板）和CD62P APC（活化血小板）群体设置门控。
    1. 在群体选项卡下选择显示群体层级，以打开群体层级结构。通过检查设门策略并正确重命名门控，来编辑群体层级。
    2. 选择创建统计视图以打开统计视图。通过右键单击统计视图并选择编辑统计视图，根据用户偏好编辑统计视图。
    3. 通过双击对应群体的方框，为每个门控选择一种颜色，以增强布局的视觉效果。
  2. 在流式细胞仪窗口中，点击参数选项卡，并调整各参数的电压，以便在图中观察到目标群体。
  3. 调整每个参数的电压，使阴性群体与阳性群体能够被区分开来。在记录补偿对照样本之前，检查单染的阳性对照是否在量程范围内（确保阳性峰可见且不过分偏右）。
    注意：如果阳性峰超出量程，应调整电压以使阳性群体可见。
  4. 记录用于补偿对照的单色染色细胞（未染色、PE-Cy7、PE、FITC和APC）。
  5. 如果阳性对照门控未正确设置，可通过调整电压进行修正。
  6. 进入实验 > 补偿设置 > 计算补偿。在弹出窗口中选择仅应用。
  7. 点击工作表窗口左上角的切换按钮，切换至全局工作表。
  8. 加载阳性对照样本，并采集足够数量的细胞以调整补偿和门控。
  9. 再次加载样本，检查每个图是否显示出基于荧光染料标记抗体的预期细胞群体。对全血样本采集并记录100,000个事件，对纯化的血小板采集并记录10,000个事件。逐一加载样本直至采集完成。
  10. 使用适当的图和门控，通过软件分析流式细胞术数据（图3）

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结果

血小板纯化的概述以流程图形式展示（图1）。步骤包括在抗凝剂存在下通过小鼠眶后静脉采血，将血液样本加至碘海醇梯度培养基上，使用摆动转子在20 °C条件下以400 × g 离心20分钟。纯化后血小板的质量通过显微镜和流式细胞术进行评估，在使用抗体染色后检测是否存在污染细胞及活化血小板。

如果将血液样本缓慢加至介质上，则碘海醇梯度介质与血液样本在离心管中会形成两个独立的层（图2A）。然而，若此步骤存在延迟，大部分血液样本可能扩散进入介质中，从而难以纯化血小板。宽口移液吸头可确保血小板不受物理应力，这对于维持血小板完整性并防止其降解至关重要。离心过程中，缓慢加速有助于防止血液样本与碘海醇介质意外混合，而缓慢减速则有助于在离心后维持梯度结构。最上层（淡黄色）为血浆层，不含任何完整的血细胞；第二层（乳白色）主要含有血小板，使用宽口移液吸头收集该层；第三层（透明）为血小板贫乏层，需小心部分收集，以避免吸入底层（红色）的红细胞和白细胞（

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讨论

通常，血小板通过低速离心法分离，该方法获得的血小板富集血浆中含有大量血细胞、细胞碎片和血浆蛋白，这些成分可能干扰生化和生理检测，需要进一步纯化21。因此，采用一种快速且简便的方法以获得无显著污染物的纯化血小板显得尤为重要。本文所述方案介绍了利用梯度介质结合低速离心法从小鼠血液中纯化血小板的方法。本方案所用参数可最大化血小板得率并最小化其降解。在收集血小板后增加洗涤步骤，可去除梯度介质和血浆蛋白，从而提高血小板对激动剂或抗体的敏感性。最重要的是，所获得的纯化血小板处于静息状态，但在激动剂（如凝血酶）存在下可被激活。我们发现，不同来源的凝血酶活性存在差异。因此，应通过实验经验优化凝血酶浓度，以实现良好的血小板激活效果。

由于小鼠血液体积较小，血小板纯化存在不便，因为在吸取过程中血小板可能与红细胞和白细胞混合。我们通过优化血液样本与梯度介质的比例解决了这一问题。研究发现，梯度介质体积为血液体积的三倍时，可清晰地将血小板层与血清层及红细胞-白细胞层分离，从而便于纯血小板的收集。

血小板纯...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了辛辛那提儿童研究基金会启动资金以及辛辛那提大学试点转化研究基金对 M.N. 的资助。 我们感谢辛辛那提儿童医院研究流式细胞术核心实验室提供的服务。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
APC 标记的抗小鼠/人 CD62P（P-选择素）大鼠抗体Thermoscientific17-0626-82血小板活化标志物
Eppendorf 管Fisher Scientific14-222-166离心用管
FACS DIVA 软件BD BiosciencesNon-catalog item血小板和全血分析
FACS 管Fisher Scientific352008流式细胞术用管
胎牛血清（FBS）Invitrogen26140079染色缓冲液组分
FITC 标记的抗小鼠 CD41 大鼠抗体BD Biosciences553848血小板标志物
流式细胞仪BD BiosciencesNon-catalog item血小板和全血分析
FlowJo 软件FlowJo, Inc.Non-catalog item血小板和全血分析
甘氨酰-脯氨酰-精氨酰-脯氨酸（GPRP）EMD Millipore03-34-0001防止血小板凝块形成
血细胞比容毛细管Fisher Scientific22-362566血液采集毛细管
Hemavet 血液分析仪Drew ScientificNon-catalog item血细胞分析仪
血细胞计数板Hausser Scientific3100细胞计数室
异氟烷Baxter1001936040用于小鼠麻醉
显微镜（Olympus CKX41）OlympusNon-catalog item细胞观察与计数
Nycodenz（Histodenz）Sigma-AldrichD2158密度梯度介质
PE 标记的抗小鼠 CD45 大鼠抗体BD Biosciences561087白细胞标志物
PE-Cy7 标记的抗小鼠 TER-119 大鼠抗体BD Biosciences557853红细胞标志物
200 µL 宽口移液器吸头ThermoFisher Scientific21-236-1A用于转移血液和血小板样本
1000 µL 宽口移液器吸头ThermoFisher Scientific21-236-2C用于转移血液和血小板样本
磷酸盐缓冲液（PBS）ThermoFisher Scientific14040-117洗涤和稀释用缓冲液
氯化钠Sigma-AldrichS7653生理盐水
柠檬酸钠Fisher Scientific02-688-26抗凝剂
染色缓冲液本实验室制备Non-catalog item洗涤和稀释缓冲液
无菌水本实验室制备Non-catalog item溶剂
台式离心机ThermoFisher Scientific75253839/433607水平转子离心机
凝血酶Enzyme Research LaboratoryHT 1002a血小板活化激动剂
TricineSigma-AldrichT0377Nycodenz 介质用缓冲液

参考文献

  1. de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
  2. Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
  3. Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
  4. Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
  5. Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
  6. Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
  7. Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
  8. Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
  9. Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
  10. Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144(2013).
  11. Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
  12. Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
  13. Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
  14. Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
  15. Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
  16. Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
  17. Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
  18. Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
  19. Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
  20. Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
  21. Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).

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