Streptococcus mutans 中一种高分子质量蛋白的纯化

摘要

本文介绍了一种用于纯化Streptococcus mutans基因产物的简单方法。该技术在蛋白质纯化中具有优势，尤其适用于膜蛋白和高分子质量蛋白的纯化，并可应用于多种其他细菌种类。

摘要

阐明一个基因的功能通常需要比较野生型菌株与目标基因被破坏的菌株之间的表型特征。在基因被破坏后，通过外源添加该基因的产物，可恢复其功能缺失的表型，从而帮助确定该基因的功能。此前已有方法描述了构建 gtfC 基因被破坏的 Streptococcus mutans 菌株。本文则介绍了一种简便的方法，用于在基因破坏后从新构建的 S. mutans 菌株中纯化 gtfC 基因的产物。该方法涉及在目标基因的 3′ 端添加一段编码多聚组氨酸的序列，从而可通过固定化金属亲和层析简便地纯化该基因产物。该遗传修饰方法除 PCR 外无需其他酶促反应。在基因破坏后通过外源添加基因产物以恢复功能，是一种高效确定基因功能的方法，且该策略也可适用于其他不同物种。

引言

分析一个基因的功能通常需要将野生型菌株的表型特征与目标基因被破坏的菌株进行比较。一旦获得基因被破坏的菌株，外源添加该基因产物即可实现功能的恢复。

获取后续修复实验所需纯化基因产物的最常用方法是在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行异源表达¹。然而，利用该系统表达膜蛋白或高分子量蛋白通常较为困难¹。在这些情况下，目标蛋白通常需从天然合成该蛋白的细胞中分离，这一过程涉及一系列复杂的步骤，可能导致基因产物的损失。为克服这些问题，已建立一种简便的基因产物纯化流程，该流程结合了基因敲除方法²、基于PCR的DNA拼接方法³ （称为两步融合PCR）以及在变形链球菌（Streptococcus mutans）中进行电穿孔介导的遗传转化。在基因产物的C末端添加多组氨酸标签（His标签）可使其通过固定化金属亲和色谱法（IMAC）实现高效纯化。

为了分离表达His标签的菌株，需将目的基因（在此表达His标签的基因敲除菌株中）的全部基因组DNA替换为抗生素抗性标记基因。构建表达His标签菌株的流程与此前所述的基因敲除菌株构建方法几乎完全相同⁴

方案

注意：在进行这些实验方案之前，必须完成S. mutans ∆gtfC菌株的构建，其中gtfC基因的全部编码区已被spc^r取代。有关构建方法的详细信息，请参阅已发表的文章⁵。

1. 引物设计

1. 准备用于构建的引物 S. mutans His-gtfC.
   注意： 本方案中使用的引物序列如下所示 表1两步融合PCR法用于生成 S. mutans His-gtfC 在示意图中示出 图2.
   1. 设计引物（gtfC-逆转和 spc^r-正向）用于连接编码His标签的序列，位于两者之间 gtfC 基因和 spc^r (图2A).
      1. 在两者中均加入GS连接子及编码His标签的序列 gtfC-逆转和 spc^....

结果

图3 显示了第一次PCR（图3A）和第二次PCR（图3B）各扩增片段的大小。各扩增片段的大小均与表1中所述的预测大小一致。图4A 显示了用第二次PCR产物转化的S. mutans菌落在含链霉素的BHI琼脂平板上的菌落。对菌落进行PCR扩增后，在琼脂糖凝胶上电泳分析（图4B）。各扩增片段的大小均与表1中所述的预测大小一致。图5 显示了SDS-PAGE和蛋白质印迹（western blot）的结果。通过IMAC纯化的蛋白质在SDS-PAGE中表现为单一蛋白条带（图5A）。使用抗多.......

讨论

引物设计是本实验方案中最关键的步骤。gtfC-reverse 和 spc^r-forward 引物的序列是根据 gtfC 基因 3′ 末端区域和 spc^r 基因 5′ 末端区域的序列自动确定的。每个引物在其 5′ 端均包含 24 个互补碱基，用于编码 GS 连接肽以及 His 标签编码序列。通过在 3′ 端添加 His 标签编码序列，可避免破坏位于上游侧翼区域的天然调控序列。gtfC-reverse 引物中必须去除 DNA 终止密码子，而该终止密码子应添加至 spc^r-forward 引物中。此外，gtfC-forward 和 spc^r-reverse 引物应分别设计用于扩增 S. mutans 野生型基因组中同源重组目标区域上下游约 1 kb 的侧翼片段。添加较长的侧翼序列可提高同源重组效率。本方案中，嵌套引物将用于替代最外侧的一对引物（即 gtfC-forward 和 <.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Nippon Genetics	NE-AG02	用于琼脂糖凝胶电泳
厌氧袋	三菱瓦斯化学	A-03	厌氧培养系统
抗His标签单克隆抗体	MBL	D291-7	HRP-偶联的
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23227	蛋白质浓度测定
脑心浸液肉汤	贝克顿，迪金森	237500	细菌培养基
考马斯亮蓝 R-250	和光	031-17922	用于生物膜染色
离心超滤装置	Sartorius	VS2032	缓冲液置换与蛋白质浓缩
离心	Kubota	7780II
层析柱	Bio-Rad	7321010	用于金属螯合亲和层析（IMAC）
透析膜夹	Fisher 品牌	21-153-100
透析袋	作为一体	2-316-06
DNA聚合酶	Takara	R045A	高保真DNA聚合酶
DNA测序	Eurofins Genomics
ECL 底物	Bio-Rad	170-5060	用于蛋白质印迹分析
EDTA（0.5 M，pH 8.0）	和光	311-90075	Tris-EDTA 缓冲液的配制
电穿孔比色皿	Bio-Rad	1652086	0.2 cm 间隙
电穿孔仪	Bio-Rad	1652100
EtBr 溶液	Nippon Gene	315-90051	用于琼脂糖凝胶电泳
凝胶切胶器	Nippon Genetics	FG-830
凝胶回收试剂盒	Nippon Genetics	FG-91202	从琼脂糖凝胶中提取DNA
成像仪	GE Healthcare	29083461	用于 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析
咪唑	和光	095-00015	结合缓冲液和洗脱缓冲液的配制
培养箱	日本医科大学 &与化学仪器	EZ-022	温度设置：4 °C
培养箱	日本医科大学 &和化学仪器	LH-100-RDS	温度设置：37 °C
膜过滤器	默克密理博	JGWP04700	0.2 µm 直径
微型离心机	Kubota	3740
NaCl	和光	191-01665	结合缓冲液和洗脱缓冲液的制备
NaH2PO4·2H2O	和光	192-02815	结合缓冲液和洗脱缓冲液的制备
NaOH	和光	198-13765	结合缓冲液和洗脱缓冲液的制备
（NH4)2SO4	和光	015-06737	硫酸铵沉淀
镍离子负载树脂	Bio-Rad	1560133	用于金属螯合亲和层析
PCR 引物	Eurofins Genomics	定制订购
蛋白标准品	Bio-Rad	161-0381	用于 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析
溶剂过滤装置	作为一体	FH-1G
壮观霉素	和光	195-11531	抗生素；使用浓度为100 μg/mL
无菌注射器滤器	默克密理博	SLGV004SL	0.22 µ微米直径
变形链球菌 ΔgtfC	实验室保藏菌株		gtfC 替换为 spcr
变异链球菌 UA159	实验室保藏菌株		S. mutans ATCC 700610，野生型菌株
蔗糖	和光	196-00015	用于生物膜形成
TAE（50 × )	日本基因公司	313-90035	用于琼脂糖凝胶电泳
热循环仪	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl（1 M，pH 8.0）	和光	314-90065	Tris-EDTA 缓冲液的配制