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方法文章

Streptococcus mutans 中一种高分子质量蛋白的纯化

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DOI：

10.3791/59804

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2019年9月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Laboratory for Oral Health Science

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于纯化Streptococcus mutans基因产物的简单方法。该技术在蛋白质纯化中具有优势，尤其适用于膜蛋白和高分子质量蛋白的纯化，并可应用于多种其他细菌种类。

摘要

阐明一个基因的功能通常需要比较野生型菌株与目标基因被破坏的菌株之间的表型特征。在基因被破坏后，通过外源添加该基因的产物，可恢复其功能缺失的表型，从而帮助确定该基因的功能。此前已有方法描述了构建 gtfC 基因被破坏的 Streptococcus mutans 菌株。本文则介绍了一种简便的方法，用于在基因破坏后从新构建的 S. mutans 菌株中纯化 gtfC 基因的产物。该方法涉及在目标基因的 3′ 端添加一段编码多聚组氨酸的序列，从而可通过固定化金属亲和层析简便地纯化该基因产物。该遗传修饰方法除 PCR 外无需其他酶促反应。在基因破坏后通过外源添加基因产物以恢复功能，是一种高效确定基因功能的方法，且该策略也可适用于其他不同物种。

引言

分析一个基因的功能通常需要将野生型菌株的表型特征与目标基因被破坏的菌株进行比较。一旦获得基因被破坏的菌株，外源添加该基因产物即可实现功能的恢复。

获取后续修复实验所需纯化基因产物的最常用方法是在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行异源表达1。然而，利用该系统表达膜蛋白或高分子量蛋白通常较为困难1。在这些情况下，目标蛋白通常需从天然合成该蛋白的细胞中分离，这一过程涉及一系列复杂的步骤，可能导致基因产物的损失。为克服这些问题，已建立一种简便的基因产物纯化流程，该流程结合了基因敲除方法2、基于PCR的DNA拼接方法3 （称为两步融合PCR）以及在变形链球菌（Streptococcus mutans）中进行电穿孔介导的遗传转化。在基因产物的C末端添加多组氨酸标签（His标签）可使其通过固定化金属亲和色谱法（IMAC）实现高效纯化。

为了分离表达His标签的菌株，需将目的基因（在此表达His标签的基因敲除菌株中）的全部基因组DNA替换为抗生素抗性标记基因。构建表达His标签菌株的流程与此前所述的基因敲除菌株构建方法几乎完全相同4,5。因此，基因敲除与基因产物分离的方法应作为连续实验进行，以实现功能分析。

在本研究中，将一段编码多聚组氨酸的序列连接到 gtfC 基因（GenBank 位点标签 SMU_1005）的 3′ 末端，该基因编码变异链球菌（S. mutans）中的葡萄糖基转移酶-SI（GTF-SI）6。随后在链球菌中进行了表达研究。由于 GTF-SI 分子量较高，大肠杆菌（E. coli）异源表达 gtfC 基因较为困难。该菌株命名为 S. mutans His-gtfC。图 1（图 1）展示了野生型 S. mutans（S. mutans WT）及其衍生菌株中 gtfC 基因与壮观霉素抗性基因盒（spcr）7 位点结构的示意图。GTF-SI 是一种分泌蛋白，参与致龋性牙菌斑生物膜的形成6。在蔗糖存在条件下，野生型 S. mutans 菌株可在光滑玻璃表面形成黏附性生物膜，而 gtfC 基因缺失的 S. mutans 菌株（S. mutans ΔgtfC）则不能形成2,5。在 S. mutans ΔgtfC 菌株中外源添加重组 GTF-SI 后，其生物膜形成能力得以恢复。随后利用 S. mutans His-gtfC 菌株生产重组 GTF-SI。

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方案

注意：在进行这些实验方案之前，必须完成S. mutans ∆gtfC菌株的构建，其中gtfC基因的全部编码区已被spcr取代。有关构建方法的详细信息，请参阅已发表的文章5。

1. 引物设计

  1. 准备用于构建的引物 S. mutans His-gtfC.
    注意： 本方案中使用的引物序列如下所示 表1两步融合PCR法用于生成 S. mutans His-gtfC 在示意图中示出 图2.
    1. 设计引物（gtfC-逆转和 spcr-正向）用于连接编码His标签的序列，位于两者之间 gtfC 基因和 spcr (图2A).
      1. 在两者中均加入GS连接子及编码His标签的序列 gtfC-逆转和 spcr- 正向引物，其5’端的24个碱基彼此互补。
        注意：GS连接子和His标签（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His）的氨基酸序列通过基因翻译连接至GTF-SI的C末端。
      2. 设计一个 gtfC-用于靶向的上游引物 gtfC 基因在 S. mutans 野生型基因组 >基因下游1 kb处及 spcr-反向引物用于靶向下游侧翼区域 spcr 在 S. mutans ∆gtfC设定熔解温度8 (Tm的 gtfC-正向和 spcr-反向引物，以匹配其熔解温度 gtfC-逆转和 spcr-上游引物，分别。
    2. 设计用于第二轮 PCR 的巢式引物（巢式正向引物和巢式反向引物）图2B).
    3. 设计引物（gtfC-正向和菌落-反向）特异性针对转化子基因组DNA的（图2C；引物用于菌落PCR。
      注意： 扩增子跨越了边界 gtfC 和 spcr。该 gtfC- 可将正向引物用作正向引物。
    4. 设计引物（上游-正向和下游-反向）以最终确认生成产物 S. mutans His-gtfC (图2C；由引物扩增出的PCR产物用于DNA测序。

2. 从S. mutans中提取基因组DNA

注意：每种S. mutans菌株均应在37 °C的厌氧条件下，于脑心浸出液（BHI）培养基中进行培养。S. mutans ∆gtfC突变株和S. mutans His-gtfC突变株需在添加100 µg/mL链霉素的BHI培养基中培养。

  1. 分别将 S. mutans WT 和 S. mutans ∆gtfC 划线接种至每块 BHI 琼脂平板上，在 37 °C 条件下过夜培养。
  2. 使用无菌牙签挑取 S. mutans WT 或 S. mutans ∆gtfC 的单菌落，接种于 1.5 mL BHI 液体培养基中，在 37 °C 条件下过夜培养。
    注意：菌落可作为第一次 PCR（步骤 3.1）的模板 DNA 来源。
  3. 将每种细菌培养物各 1 mL 转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 15,000 × g 条件下离心 1 分钟。
  4. 弃去上清液，加入 1 mL Tris-EDTA 缓冲液（pH 8.0），重悬菌体沉淀。
  5. 将悬液在 15,000 × g 条件下离心 1 分钟，弃去上清液，将菌体沉淀重悬于 50 µL Tris-EDTA 缓冲液（pH 8.0）中。
  6. 使用金属浴或加热块在 95 °C 加热悬液 5 分钟，随后在 15,000 × g 条件下离心 5 分钟。
  7. 将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中（该上清液将作为第一次 PCR 的模板 DNA）。

3. PCR 扩增

注意： 表1、表2 和 表3 分别总结了PCR引物、试剂和扩增循环条件。

  1. 使用 S. mutans WT 和 S. mutans ∆gtfC 基因组作为PCR模板进行第一次PCR扩增。利用步骤1.1.1.2中所述引物扩增包含gtfC基因下游区域及spcr的片段（图2A）。
  2. 将每种PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。切下大小约为1,000 bp和2,000 bp的目标DNA片段。采用基于硅胶膜的凝胶回收方法从凝胶中纯化这些片段。
    注意：PCR9、DNA凝胶电泳10和DNA纯化11的基本操作流程在其他文献中有详细描述。
  3. 以第一次PCR的产物（大致等摩尔量）作为模板，使用嵌套式正向引物和嵌套式反向引物进行第二次PCR扩增（图2B）。
  4. 取十分之一的PCR反应混合物在琼脂糖凝胶上进行电泳。确认生成了大小约为3,000 bp的正确扩增片段。
  5. 沉淀剩余的PCR产物。
    注意：    无需纯化PCR产物，因为第二次PCR产生的非特异性扩增片段不会干扰同源重组过程。
    1. 向PCR反应体系中加入无核酸酶水，使总体积达到100 µL，随后加入0.1倍体积（10 µL）的3 M乙酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积（250 µL）的无水乙醇。混匀后于室温（RT）放置10分钟。
    2. 在4 °C条件下以15,000 x g离心20分钟。弃去上清液。加入1 mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。
    3. 在4 °C条件下以15,000 x g离心5分钟。弃去上清液。将DNA沉淀空气干燥后，用10 µL无核酸酶水溶解。

4. 细胞转化

  1. 按照先前发表文献5中描述的步骤制备感受态S. mutans WT，用于导入第二次PCR产物。将细胞储存于-80 °C。
    注意：本实验中，感受态S. mutans WT细胞已预先保存在-80 °C，用于构建S. mutans ∆gtfC突变株。
  2. 取5 μL浓缩后的第二次PCR产物，加入到50 μL预先冷冻的冰上感受态细胞中。将混合物转移至电穿孔比色皿中，使用电穿孔仪施加一次电脉冲（1.8 kV，2.5 ms，600 Ω，10 µF）。
  3. 将细胞重悬于500 μL BHI液体培养基中。立即取10–100 μL悬液涂布于含链霉素的BHI琼脂平板上。于37 °C培养2–6天，直至菌落生长至可挑取的程度。

5. 验证 G基因组重组 和储存

  1. 进行菌落 PCR，使用 gtfC-上游引物和菌落-下游引物筛选重组子。将每个菌落 PCR 产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，确认获得约 1,500 bp 的 DNA 片段。
  2. 用无菌牙签挑取一个阳性菌落，将细胞在含链霉素的 2 mL BHI 液体培养基中过夜培养。
  3. 将 0.8 mL 细菌培养物与 0.8 mL 无菌 50% 甘油混合，于 -80 °C 或 -20 °C 保存。
  4. 将剩余的 1 mL 细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。重复步骤 2.3–2.7，提取细胞的基因组 DNA。
  5. 以基因组 DNA 为模板，使用上游-上游引物和下游-下游引物进行 PCR 扩增。重复步骤 3.2，从凝胶中纯化扩增的 DNA 产物。
  6. 对纯化的扩增片段进行 DNA 测序。
    注意：务必通过 DNA 测序确认 S. mutans His-gtfC 菌株的成功构建。

6. 带有多聚组氨酸标签的GTF-SI纯化

  1. 将含有壮观霉素的BHI琼脂平板上划线接种S. mutans His-gtfC，于37 °C培养过夜。
  2. 用无菌牙签挑取单个菌落，接种至3 mL BHI液体培养基中，于37 °C过夜培养。
  3. 准备两个锥形瓶，各装有1 L不含壮观霉素的BHI液体培养基。将1 mL过夜培养的菌液接种至1 L BHI液体培养基中，于37 °C过夜培养。
  4. 通过硫酸铵沉淀法浓缩培养上清液中的蛋白质。
    注意：    若目标蛋白为胞内蛋白，则需从菌体中提取。硫酸铵沉淀的基本操作步骤详见其他文献12。
    1. 将细菌培养液在4 °C条件下以10,000 × g离心20分钟，将上清液收集至3 L玻璃烧杯中。
    2. 在2 L上清液中加入1,122 g硫酸铵（达到80%饱和度），使用磁力搅拌器剧烈搅拌，于4 °C持续搅拌4小时或更长时间以形成沉淀。
      注意：沉淀过程可继续过夜。
    3. 将含硫酸铵的沉淀溶液在4 °C条件下以15,000 × g离心20分钟，弃去上清液。
    4. 用刮勺收集沉淀物并转移至200 mL玻璃烧杯中，用35 mL结合缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，5 mM 咪唑，pH 8.0）重悬沉淀。
    5. 使用再生纤维素透析袋，在4 °C条件下将上述悬液对2,500 mL结合缓冲液进行透析，并持续搅拌。2小时后更换透析液，继续透析过夜。
    6. 再次更换透析液，继续透析2小时。
  5. 将透析后的悬液在4 °C条件下以20,000 × g离心10分钟，通过抽滤装置用膜滤器过滤上清液，将滤液转移至75 cm2的培养瓶中。
  6. 采用固定化金属亲和层析（IMAC）从滤液中分离纯化多聚组氨酸标签的GTF-SI蛋白。
    1. 取2 mL镍离子负载的IMAC树脂悬液（约含1 mL树脂），转移至层析柱中，层析柱出口连接硅胶管，通过重力流去除保存液。
      注意：在整个IMAC过程中，切勿让树脂干燥。
    2. 向层析柱中加入3 mL蒸馏水洗涤树脂，再加入5 mL结合缓冲液以平衡树脂。
    3. 使用Hoffmann夹关闭流速，向柱中加入5 mL第6.5步所得滤液，制成悬液。
    4. 将上述悬液全部加入剩余的滤液中，于4 °C轻轻摇动混合30分钟。
    5. 将混合液重新加载至层析柱中，通过重力流去除未结合的液体，再用20 mL结合缓冲液洗涤IMAC树脂。
      注意：在后续IMAC操作中，使用Hoffmann夹将流速调节至约2 mL/min。
    6. 用20 mL洗脱缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，500 mM 咪唑，pH 8.0）洗脱重组GTF-SI蛋白。
      注意：此处可暂停实验流程。洗脱液应保存于4 °C。IMAC树脂可重复使用，请参考IMAC树脂的使用说明。
  7. 将洗脱缓冲液更换为保存缓冲液（50 mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5），使用离心超滤装置将重组GTF-SI溶液浓缩至约1 mL，并于4 °C保存。
    注意：应通过SDS-PAGE13和Western印迹14检测多聚组氨酸标签GTF-SI的纯化效果，使用辣根过氧化物酶标记的抗多聚组氨酸单克隆抗体进行检测。根据目标蛋白性质，可能需要在洗脱液中添加CHAPS（终浓度0.1%），以避免蛋白在超滤装置上的非特异性吸附。

7. 重组GTF-SI的功能重建

  1. 分别将每种S. mutans菌株划线接种于BHI琼脂平板上，在37 °C条件下培养过夜。
  2. 使用无菌牙签挑取单个菌落，接种至2 mL BHI液体培养基中，在37 °C条件下过夜培养。
  3. 取20 μL S. mutans ∆gtfC过夜培养物，接种于含有1%蔗糖且不加抗生素的2 mL BHI液体培养基中，置于玻璃试管内。向S. mutans ∆gtfC培养物中加入GTF-SI或等体积的溶剂对照，并将试管倾斜放置，过夜培养。
    注意：使用无菌注射器滤器对GTF-SI溶液进行灭菌处理，并在使用前通过二辛可宁酸蛋白定量法15测定其蛋白浓度。
  4. 用涡旋振荡器振荡培养液10秒，倾去悬浮液，用足量蒸馏水冲洗试管。
  5. 用1 mL 0.25%考马斯亮蓝（CBB）对试管壁上的生物膜进行染色。
  6. 1分钟后倾去染色液，用足量蒸馏水清洗试管，然后将试管自然晾干。

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结果

图3 显示了第一次PCR（图3A）和第二次PCR（图3B）各扩增片段的大小。各扩增片段的大小均与表1中所述的预测大小一致。图4A 显示了用第二次PCR产物转化的S. mutans菌落在含链霉素的BHI琼脂平板上的菌落。对菌落进行PCR扩增后，在琼脂糖凝胶上电泳分析（图4B）。各扩增片段的大小均与表1中所述的预测大小一致。图5 显示了SDS-PAGE和蛋白质印迹（western blot）的结果。通过IMAC纯化的蛋白质在SDS-PAGE中表现为单一蛋白条带（图5A）。使用抗多...

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讨论

引物设计是本实验方案中最关键的步骤。gtfC-reverse 和 spcr-forward 引物的序列是根据 gtfC 基因 3′ 末端区域和 spcr 基因 5′ 末端区域的序列自动确定的。每个引物在其 5′ 端均包含 24 个互补碱基，用于编码 GS 连接肽以及 His 标签编码序列。通过在 3′ 端添加 His 标签编码序列，可避免破坏位于上游侧翼区域的天然调控序列。gtfC-reverse 引物中必须去除 DNA 终止密码子，而该终止密码子应添加至 spcr-forward 引物中。此外，gtfC-forward 和 spcr-reverse 引物应分别设计用于扩增 S. mutans 野生型基因组中同源重组目标区域上下游约 1 kb 的侧翼片段。添加较长的侧翼序列可提高同源重组效率。本方案中，嵌套引物将用于替代最外侧的一对引物（即 gtfC-forward 和 <...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由日本促进科学振兴会（JSPS）（资助编号：16K15860 和 19K10471，授予 T. M.；17K12032，授予 M. I.；18K09926，授予 N. H.）以及 SECOM 科学技术基金会（SECOM）（资助编号：2018.09.10 No. 1）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Nippon GeneticsNE-AG02用于琼脂糖凝胶电泳
厌氧袋三菱瓦斯化学A-03厌氧培养系统
抗His标签单克隆抗体MBLD291-7HRP-偶联的
BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Fisher Scientific23227蛋白质浓度测定
脑心浸液肉汤贝克顿，迪金森237500细菌培养基
考马斯亮蓝 R-250和光031-17922用于生物膜染色
离心超滤装置SartoriusVS2032缓冲液置换与蛋白质浓缩
离心Kubota7780II
层析柱Bio-Rad7321010用于金属螯合亲和层析（IMAC）
透析膜夹Fisher 品牌21-153-100
透析袋作为一体2-316-06
DNA聚合酶TakaraR045A高保真DNA聚合酶
DNA测序Eurofins Genomics
ECL 底物Bio-Rad170-5060用于蛋白质印迹分析
EDTA（0.5 M，pH 8.0）和光311-90075Tris-EDTA 缓冲液的配制
电穿孔比色皿Bio-Rad16520860.2 cm 间隙
电穿孔仪Bio-Rad1652100
EtBr 溶液Nippon Gene315-90051用于琼脂糖凝胶电泳
凝胶切胶器Nippon GeneticsFG-830
凝胶回收试剂盒Nippon GeneticsFG-91202从琼脂糖凝胶中提取DNA
成像仪GE Healthcare29083461用于 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析
咪唑和光095-00015结合缓冲液和洗脱缓冲液的配制
培养箱日本医科大学 &与化学仪器EZ-022温度设置：4 °C
培养箱日本医科大学 &和化学仪器LH-100-RDS温度设置：37 °C
膜过滤器默克密理博JGWP047000.2 µm 直径
微型离心机Kubota3740
NaCl和光191-01665结合缓冲液和洗脱缓冲液的制备
NaH2PO4·2H2O和光192-02815结合缓冲液和洗脱缓冲液的制备
NaOH和光198-13765结合缓冲液和洗脱缓冲液的制备
（NH4)2SO4和光015-06737硫酸铵沉淀
镍离子负载树脂Bio-Rad1560133用于金属螯合亲和层析
PCR 引物Eurofins Genomics定制订购
蛋白标准品Bio-Rad161-0381用于 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析
溶剂过滤装置作为一体FH-1G
壮观霉素和光195-11531抗生素；使用浓度为100 μg/mL
无菌注射器滤器默克密理博SLGV004SL0.22 µ微米直径
变形链球菌 ΔgtfC实验室保藏菌株gtfC 替换为 spcr
变异链球菌 UA159实验室保藏菌株S. mutans ATCC 700610，野生型菌株
蔗糖和光196-00015用于生物膜形成
TAE（50 × )日本基因公司313-90035用于琼脂糖凝胶电泳
热循环仪Bio-RadPTC-200
Tris-HCl（1 M，pH 8.0）和光314-90065Tris-EDTA 缓冲液的配制

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