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使用超低输入量载体CAGE进行转录起始位点定位

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DOI：

10.3791/59805

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2019年6月26日

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1Institute of Clinical Sciences, Faculty of Medicine, Imperial College London, 2MRC London Institute of Medical Sciences, 3Sars International Centre for Marine Molecular Biology, University of Bergen

本文内容

摘要

基因表达的末端分析（Cap Analysis of Gene Expression, CAGE）是一种在全基因组范围内对mRNA 5’端进行定量作图的方法，可单核苷酸分辨率地捕获RNA聚合酶II的转录起始位点。本文描述了一种低起始量（SLIC-CAGE）建库方案，仅需纳克级总量RNA即可生成高质量文库。

摘要

基因表达的帽子分析（Cap analysis of gene expression, CAGE）是一种用于单核苷酸分辨率检测RNA聚合酶II转录起始位点（transcription start sites, TSSs）的方法。准确检测TSSs有助于核心启动子的识别与发现。此外，通过双向转录起始的特征还可检测活跃的增强子。本文描述了一种超低起始量载体-CAGE（super-low input carrier-CAGE, SLIC-CAGE）实验方案。该SLIC-CAGE方法通过向目标样本中添加体外转录的RNA载体混合物，人为增加RNA总量，从而最大限度减少RNA损失，使得仅需纳克级总RNA（即数千个细胞）即可完成文库构建。该载体模拟了目标DNA文库片段的长度分布，避免了均一载体丰度过高可能带来的偏差。在实验流程的最后阶段，利用归巢核酸内切酶降解去除载体，同时扩增目标文库。目标样本文库可免于降解，因为归巢核酸内切酶的识别位点较长（18至27 bp），在真核生物基因组中自然出现的概率极低。最终获得可用于高通量测序的DNA文库。从实验开始到测序前的所有步骤可在6天内完成。载体的制备需一整天工作时间，但可批量制备后于-80 °C冷冻保存。测序后，可对读段进行分析以获得全基因组范围内单核苷酸分辨率的TSSs。这些TSSs可用于核心启动子或增强子的发现，从而揭示基因调控机制。当数据按启动子聚合后，还可用于5’端为中心的表达谱分析。

引言

基因表达的末端分析（Cap analysis of gene expression, CAGE）是一种用于在全基因组范围内以单核苷酸分辨率定位RNA聚合酶II转录起始位点（transcription start sites, TSSs）的方法1。其定量特性还支持以转录本5’端为中心的表达谱分析。TSSs周围区域（约起始位点上下游各40 bp）为核心启动子区，代表RNA聚合酶II和通用转录因子结合的物理位置（此前已有综述2,3）。精确的TSS位置信息可用于核心启动子的识别以及启动子动态变化的监测。此外，由于活跃的增强子表现出双向转录特征，CAGE数据也可用于增强子的发现及其动态变化的监测4。近年来，CAGE技术因其广泛的应用性以及在ENCODE5、modENCODE6和FANTOM项目7等高影响力研究计划中的应用而日益受到关注。此外，TSS信息在区分健康组织与病变组织方面也显示出重要价值，因为疾病特异性的TSS可作为诊断标志物使用8。

尽管目前已存在多种TSS定位方法（CAGE、RAMPAGE、STRT、nanoCAGE、nanoCAGE-XL、oligo-capping），但我们及其他研究者近期已证明，CAGE是捕获真实TSS、且假阳性数量最少的最无偏倚方法9,10。最近开发的CAGE实验流程nAnT-iCAGE11是目前TSS分析中最无偏倚的方案，因为它避免了使用限制性内切酶将片段切割为短标签，并且不依赖PCR扩增。然而，nAnT-iCAGE方案的一个局限性在于需要大量的起始材料（例如，每个样本需5 µg 总RNA）。在回答某些具有重要生物学意义的问题时，往往难以获得如此大量的起始材料（例如，经FACS分选的细胞或早期胚胎阶段）。最后，即使nAnT-iCAGE实验成功，每个样本也仅能获得1–2 ng的DNA文库材料，从而限制了可实现的测序深度。

为实现仅使用纳克级总RNA进行转录起始位点（TSS）分析，我们近期开发了超低输入载体CAGE（Super-low Input Carrier-CAGE）10 SLIC-CAGE， 图1）。SLIC-CAGE 仅需 10 ng 总 RNA 即可获得高复杂度的文库。本方案依赖于精心设计的合成 RNA 载体，将其添加至目标 RNA 中，使 RNA 总量达到 5 μg。该合成载体在长度分布上模拟目标 DNA 文库，以避免过量均质分子可能引起的潜在偏差。载体序列基于 大肠杆菌 亮氨酰-tRNA合成酶基因（表1）出于两个原因。第一，载体在最终文库中的任何残留，即使被测序，也不会比对到真核生物基因组上。第二，由于 E. coli 是一种嗜温物种，其看家基因已优化为适合SLIC-CAGE的温度范围。载体序列中还嵌入了归巢内切酶识别位点，以实现对来源于载体RNA分子的DNA的特异性降解。目标样本来源的文库则保持完整，因为归巢内切酶识别位点较长（I-CeuI = 27 bp；I-SceI = 18 bp），在真核生物基因组中出现的概率极低。在对载体进行特异性降解并通过排阻大小去除片段后，目标文库经PCR扩增即可用于下一代测序。根据起始RNA量（1–100 ng），预计需要进行13–18个PCR扩增循环。每个样本最终获得的DNA量为5–50 ng，足以支持深度测序。当仅使用1–2 ng总RNA时，仍可检测到真实的转录起始位点（TSSs）；然而，所构建的文库复杂度预计较低。最后，由于SLIC-CAGE基于nAnT-iCAGE实验流程11可实现在测序前对多达八个样本进行多重检测。

方案

1. 载体的制备

  1. 体外转录用DNA模板的制备
    1. 通过混合41 µL水、20 µL 5x HF缓冲液、8 µL 2.5 mM dNTPs、10 µL 10 µM特异性正向引物（PCR_GN5_f1，表2；引物溶于并稀释于水中）、10 µL含合成载体基因的2 ng/µL质粒模板以及1 µL Phusion聚合酶，为每个PCR模板配制PCR反应液。用移液器吹打混匀。可一次性配制全部10个模板的总反应液（按11个反应量配制）。
    2. 向每种10 µM反向引物（PCR_N6_r1-r10，表2）各10 µL中加入90 µL PCR反应液，用移液器吹打混匀。
    3. 使用以下程序进行PCR扩增：98 °C预变性60 s，(98 °C变性10 s，50 °C退火30 s，72 °C延伸30 s) 共35个循环，72 °C终延伸10 min，4 °C保存。
    4. PCR扩增DNA模板的凝胶纯化
      1. 配制1%琼脂糖凝胶（推荐使用低熔点琼脂糖）。
      2. 为减少体积，使用真空浓缩仪在中低温（30–40 °C）条件下将100 µL PCR反应液浓缩至总体积20 µL。
      3. 加入6 µL 6x上样染料，充分混匀后上样至凝胶。在1x TAE缓冲液中以适合所用电泳槽的电压（5–10 V/cm）进行电泳30分钟。同时平行跑100 bp或1,000 bp DNA Marker。
      4. 使用洁净的手术刀切下含有目标PCR产物的凝胶条带，避免切取过多琼脂糖。使用凝胶回收试剂盒纯化PCR产物（按照生产商说明书操作）。
        注意：从琼脂糖凝胶中提取的DNA其A260/A230比值通常较低（0.1–0.3）。目标产物及副产物预期结果见图2A。100 µL PCR反应预期产量为1.2–3 µg。可通过放大反应体系提高产量。
  2. 载体分子的体外转录
    1. 根据生产商说明书，使用T7 RNA聚合酶进行载体RNA的体外转录。设置10–20 µL反应体系（推荐试剂盒见材料表）。
    2. 使用RNA纯化试剂盒纯化体外转录所得RNA。按照生产商标准操作流程，在溶液中加入DNase I消化残留DNA，最后将RNA洗脱于50 µL水中。为提高洗脱效率，离心前可将水在柱中静置5分钟。
      注意：注意不要超过纯化柱的最大结合容量（在材料表中提及的试剂盒中，最大容量为100 µg）。由PCR模板1–10（长度从1 kbp至200 bp）进行10 µL体外转录反应，预期产量为25–50 µg。可通过放大反应体系获得更多的载体分子储备液。
  3. 体外转录载体RNA分子的加帽
    1. 每份载体RNA的加帽反应液配制如下：2 µL 10x加帽缓冲液、1 µL 10 mM GTP、1 µL 2 mM SAM（新鲜稀释）以及1 µL Vaccinia加帽酶。
    2. 将每种载体分子最多10 µg混合至总体积15 µL，于65 °C变性10分钟。立即置于冰上，防止二级结构形成。
    3. 将变性后的载体RNA与5 µL加帽反应液混合，37 °C孵育1小时。
    4. 使用RNA纯化试剂盒纯化加帽后的RNA分子——遵循生产商提供的纯化流程。将RNA洗脱于30 µL水中。为提高洗脱效率，离心前可将水在柱中静置5分钟。
      注意：使用微量分光光度计测定浓度。预期A260/A280比值>2，A260/A230比值>2。需注意部分RNA样品的A260/A230比值可能在1.3–2之间。使用10 µg未加帽RNA时，预期可获得9–10 µg加帽RNA。
  4. 按照表3中描述的量混合加帽与未加帽的载体RNA。通过轻弹管壁充分混匀，并使用微量分光光度计测定浓度。
    注意：若逆转录反应（见下文）需要更高浓度的载体RNA，可使用真空浓缩仪在中低温（30–35 °C）条件下浓缩载体混合液，直至达到所需终浓度。步骤2–14修改自Murata等人报道的标准nAnT-iCAGE实验流程11。

2. 逆转录

  1. 在低吸附性PCR板中，将1 µL RT引物（2.5 mM TCT-N6溶于水，序列见补充表1）、10 ng目标总RNA和4,990 ng载体混合液（表3）混合至总体积为10 µL。通过轻弹管壁混匀。
    注意：如果样本RNA浓度过低，不适合进行逆转录（见下文），可将其与适量载体混合，使用真空浓缩仪浓缩至总体积9 µL，再加入1 µL RT引物。提前加入载体使总RNA量达到5 µg，可防止样本损失。
  2. 将步骤2.1中的混合物在65 °C加热5分钟，立即置于冰上，以防止重新退火。
  3. 配制逆转录（RT）反应混合液。
    1. 每个样本中加入6.1 µL无RNase和DNase的水、7.6 µL 5x第一链缓冲液、1.9 µL 0.1 M DTT、1 µL 10 mM dNTPs、7.6 µL海藻糖/山梨醇混合液（配方见Murata等11）以及3.8 µL推荐的逆转录酶（见材料表）。通过轻弹管壁充分混匀。
  4. 向含有10 µL RNA、载体和RT引物的PCR管中加入28 µL RT反应混合液（总体积为38 µL）。使用移液器充分混匀。
    注意：由于含有海藻糖/山梨醇，混合液黏度较高。需混匀至肉眼观察均匀为止。
  5. 在热循环仪中按照以下程序孵育：25 °C孵育30秒，50 °C孵育60分钟，然后保持在4 °C。
  6. 使用SPRI磁珠纯化cDNA:RNA杂交体
    1. 向38 µL RT反应液中加入68.4 µL推荐的无RNase和DNase的SPRI磁珠（见材料表）（磁珠与样本体积比为1.8:1）。使用移液器充分混匀，并在室温（RT）下孵育5分钟。
    2. 将磁珠置于磁力架上静置5分钟。弃去上清液，并用200 µL新鲜配制的70%乙醇洗涤磁珠两次。
      注意：添加乙醇时无需混匀，且试管应始终置于磁力架上。加入的乙醇应立即去除。洗涤过程中需小心避免磁珠丢失，否则可能导致样本损失。
    3. 试管仍置于磁力架上时，彻底去除残留乙醇。可使用P10移液器吸除并推出管壁残留的乙醇液滴。切勿让磁珠完全干燥。
    4. 向磁珠中加入42 µL预热至37 °C的水，通过上下吹打60次洗脱样本。
      注意：移液时应避免产生气泡，否则可能导致磁珠（即结合的样本）被包裹在泡沫中而丢失（即，造成样本损失）。
    5. 在37 °C孵育5分钟，不加盖，以使微量乙醇挥发。
    6. 将磁珠置于磁力架上静置5分钟，然后将上清液转移至新板中。
      注意：应尽量回收全部上清液以防止样本损失，同时避免磁珠污染。可使用P10移液器吸取最后的样本液滴。

3. 氧化

  1. 向纯化的 RT 反应体系中加入 2 µL 1 M NaOAc（pH 4.5），用移液器混匀，再加入 2 µL 250 mM NaIO4，再次混匀。
  2. 冰上孵育 45 分钟。用铝箔纸覆盖反应板以避光。
  3. 向氧化反应混合物中加入 16 µL Tris-HCl（pH 8.5），以中和 pH 值。
  4. 使用 SPRI 磁珠纯化氧化后的 cDNA:RNA 杂交体。向 60 µL 氧化反应混合物中加入 108 µL SPRI 磁珠（磁珠与样品体积比为 1.8:1）。按照步骤 2.6.1–2.6.6 所述方法重复纯化过程。使用预热至 37 °C 的 42 µL 水进行洗脱。
    注意：通过每 1 mg NaIO4 加入 18.7 µL 水，新鲜配制 250 mM NaIO4 溶液。NaIO4 对光敏感，因此应将溶液置于用铝箔纸包裹的离心管中或避光管中保存。

4. 生物素标记

  1. 向含有纯化后氧化样品的离心管中加入 4 µL 的 1 M NaOAc（pH 6.0），并通过移液混匀。
  2. 加入 4 µL 的 10 mM 生物素溶液，通过移液混匀，并在 23 °C 下于热循环仪中避光孵育 2 小时。
    注意：通过将 50 mg 生物素与 13.5 mL DMSO 混合制备生物素溶液。分装成单次使用量，于 -80 °C 冻存。
  3. 使用 SPRI 磁珠纯化生物素标记的 cDNA:RNA 杂交体：加入 12 µL 的 2-丙醇，通过移液混匀。加入 108 µL SPRI 磁珠（磁珠与样品体积比为 1.8:1），按照步骤 2.6.1–2.6.6 所述重复纯化过程。使用预热至 37 °C 的 42 µL 水进行洗脱。
    注意：此步骤可暂停，样品可在 -80 °C 冻存。

5. RNase I 消化

  1. 通过移液将每份样品所需的 4.5 µL 10x RNase I 缓冲液与 0.5 µL RNase I（10 U/µL）混合，配制 RNase I 混合液。轻轻吹打混匀。
  2. 向每份纯化后的样品中加入 5 µL 上述混合液（共 45 µL）。吹打混匀后，于 37 °C 孵育 30 分钟。

6. 链霉亲和素磁珠的制备

  1. 每个样本中，将 30 µL 链霉亲和素磁珠悬液与 0.38 µL 的 20 mg/mL tRNA 混合。冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟轻轻 flick 管壁混匀一次。
    注意：移液前应通过轻弹瓶身充分重悬链霉亲和素磁珠悬液。tRNA 溶液的配制应参照 Murata 等人11的方法。
  2. 将磁珠置于磁力架上分离 2–3 分钟，吸除上清液。
  3. 用 15 µL 缓冲液 A 重悬磁珠，再置于磁力架上分离 2–3 分钟，吸除上清液。重复洗涤一次，并吸除上清液。
  4. 将磁珠重悬于 105 µL 缓冲液 A 中，并加入 0.19 µL 的 20 mg/mL tRNA。通过移液充分混匀。
    注意：磁珠应在使用前新鲜配制。建议在进行 RNase I 消化时开始磁珠的制备。若处理多个样本，可将磁珠在同一个离心管中集中配制。

7. 帽捕获

  1. 样品结合
    1. 将105 µL预先制备的链霉亲和素磁珠加入45 µL经RNase I处理的样品中。用移液器充分混匀，于37 °C孵育30分钟，每10分钟用移液器混匀一次。
    2. 将磁珠置于磁力架上分离2–3分钟，弃去上清液。
  2. 洗涤磁珠
    1. 加入150 µL洗涤缓冲液A，用移液器重悬磁珠。将磁珠置于磁力架上分离2–3分钟，弃去上清液。
    2. 加入150 µL洗涤缓冲液B，用移液器重悬磁珠。将磁珠置于磁力架上分离2–3分钟，弃去上清液。
    3. 加入150 µL洗涤缓冲液C，用移液器重悬磁珠。将磁珠置于磁力架上分离2–3分钟，弃去上清液。
      注意：缓冲液B和C应预热至37 °C。洗涤缓冲液A、B和C的配方见Murata等11中的描述。
  3. cDNA释放
    1. 通过将58.5 µL水与6.5 µL 10x RNase I缓冲液混合，配制1x RNase I缓冲液。
    2. 用35 µL 1x RNase I缓冲液重悬磁珠。于95 °C孵育5分钟，随后立即置于冰上2分钟，以防止cDNA重新结合。转移至冰上时请按住管盖，以防因压力积聚导致管盖弹开。
    3. 将磁珠置于磁力架上分离2–3分钟，将上清液转移至新板中。
    4. 用30 µL 1x RNase I缓冲液重悬磁珠。将磁珠置于磁力架上分离2–3分钟，将上清液转移至先前收集的上清液中（洗脱出的cDNA总体积应约为65 µL）。

8. 通过RNase H和RNase I消化去除RNA

  1. 每个样品中加入 2.4 µL 水、0.5 µL 10x RNase I 缓冲液、0.1 µL RNase H 和 2 µL RNase I。
  2. 将 5 µL 混合液加入 65 µL 已释放的 cDNA 样品中，通过移液混匀。在 37 °C 下孵育 15 分钟，然后保持在 4 °C。
  3. 使用 SPRI 磁珠从 RNase 消化混合物中纯化 cDNA。向 70 µL 降解反应液中加入 126 µL SPRI 磁珠，通过移液混匀。按照 2.6.1–2.6.6 中所述 SPRI 磁珠纯化步骤进行操作。按所述方法使用预热至 37 °C 的 42 µL 水洗脱。
  4. 通过混合 4.5 µL 10x RNase I 缓冲液和 0.5 µL RNase I，制备 RNase I 混合液。
  5. 将 5 µL RNase 混合液加入 40 µL 纯化后的 cDNA 样品中，通过移液混匀，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。随后保持在 4 °C。
  6. 使用 SPRI 磁珠纯化样品。向 45 µL 降解反应液中加入 81 µL SPRI 磁珠，通过移液混匀。按照 2.6.1–2.6.6 中所述 SPRI 磁珠纯化步骤进行操作。按所述方法使用 42 µL 水洗脱。

9. 连接5’接头

  1. 使用真空浓缩仪将纯化的cDNA样品浓缩至4 µL。保持温度在30–35 °C。用移液器检测体积。如果样品完全干燥，加入4 µL水溶解。
    注意：最好避免完全干燥，以防止样品损失。
  2. 将浓缩后的样品在95 °C孵育5分钟，然后立即置于冰上2分钟，以防止复性。转移管子时请按住管盖，因为压力积聚可能导致管盖弹开。
  3. 将4 µL的2.5 µM 5’接头在55 °C孵育5分钟，然后立即置于冰上2分钟，以防止复性。
  4. 将4 µL的2.5 µM 5’接头与4 µL样品混合。
    注意：5’接头应根据补充表2、补充表3、补充表4和补充表5制备。使用100 mM NaCl将10 µM的5’接头稀释至2.5 µM浓度后使用。
  5. 向混合的5’接头和样品中加入16 µL连接预混液（见材料表），并通过移液充分混匀。在16 °C孵育16小时。
  6. 使用SPRI磁珠纯化连接产物。加入43.2 µL SPRI磁珠，并按步骤2.6.1–2.6.6操作。使用预热至37 °C的42 µL水进行洗脱。
  7. 通过向转移后的上清液中加入72 µL SPRI磁珠，重复步骤9.6的纯化操作（磁珠与样品比例为1.8:1）。
    注意：5’接头包含条形码，允许在测序前将多达八个样品混合（共有八种三核苷酸条形码可用，详见Murata等11及补充表1）。

10. 连接 3’ 接头

  1. 使用真空浓缩仪将纯化后的样品浓缩至 4 µL，操作步骤如第 9.1 步所述。
  2. 将浓缩后的样品在 95 °C 下孵育 5 分钟，然后立即置于冰上 2 分钟，以防止复性。转移试管时请握住管盖，因为压力积聚可能导致管盖弹开。
  3. 将 4 µL 的 2.5 µM 3’ 连接子在 65 °C 下孵育 5 分钟，然后立即置于冰上 2 分钟，以防止复性。
  4. 向 4 µL 浓缩样品中加入 4 µL 的 2.5 µM 3’ 连接子。
  5. 加入 16 µL 连接预混液，用移液器充分混匀。在 16 °C 下孵育 16 小时。
  6. 使用 SPRI 磁珠纯化连接产物。加入 43.2 µL SPRI 磁珠，并按照步骤 2.6.1–2.6.6 进行操作。用预热至 37 °C 的 42 µL 水洗脱。
    注意： 3’ 连接子应根据补充表 6 和 补充表 7 制备。使用 100 mM NaCl 将 10 µM 的 3’ 连接子稀释至 2.5 µM 的浓度。

11. 去磷酸化

  1. 通过混合4 µL水、5 µL 10x SAP缓冲液和1 µL SAP酶来配制SAP混合液。
  2. 将10 µL SAP混合液加入纯化的连接产物（总体积50 µL）中，并在PCR仪中按照以下程序孵育：37 °C孵育30分钟，65 °C孵育15分钟，然后保持在4 °C。

12. 使用尿嘧啶特异性切除酶降解3’接头链的上链

  1. 向去磷酸化的样品中加入 2 µL 尿嘧啶特异性切除酶（见材料表），用移液器吹打混匀，并在热循环仪中按照以下程序孵育：37 °C 反应 30 分钟，95 °C 反应 5 分钟，随后立即置于冰上 2 分钟，以防止断裂的上链重新退火。
  2. 向 52 µL 反应混合物中加入 93.6 µL SPRI 磁珠，用移液器充分吹打混匀，随后重复步骤 2.6.1–2.6.6 的纯化操作。按所述方法用预热至 37 °C 的 42 µL 水进行洗脱。

13. 第二链合成

  1. 通过混合以下组分配制第二链合成反应液（体积按每份样品计）：5 µL 10x DNA 聚合酶反应缓冲液、2 µL 水、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 50 µM nAnT-iCAGE 第二链引物（序列见补充表1）和 1 µL 缺乏DNA外切酶活性的DNA聚合酶（推荐聚合酶见材料表）。
  2. 取 10 µL 上述混合液加入纯化后的样品中，用移液器充分混匀（总体积为 50 µL）。将反应体系置于热循环仪中，按以下程序孵育：95 °C 5 分钟，55 °C 5 分钟，72 °C 30 分钟，然后保存于 4 °C。

14. 使用外切酶 I 降解第二链合成引物

  1. 向第二链合成混合物中加入 1 µL 外切酶 I。用移液器充分混匀，于 37 °C 孵育 30 分钟，随后置于 4 °C 保存。
  2. 向 51 µL 经外切酶 I 处理的样品中加入 91.8 µL SPRI 磁珠，纯化双链 DNA。重复步骤 2.6.1–2.6.6 中所述的纯化步骤，并按照所述方法用预热至 37 °C 的 42 µL 水洗脱。
  3. 使用真空浓缩仪将样品浓缩至 15 µL，操作方法同步骤 9.1 所述。

15. 质量与数量控制

  1. 取1 µL浓缩样品，使用DNA质量分析仪进行高灵敏度DNA芯片检测。预期的图谱/数量见图3。

16. 载体降解的第一轮

  1. 通过混合 2 µL 水、2 µL 10x 限制性内切酶缓冲液、1 µL I-SceI 和 1 µL I-CeuI 制备降解反应混合液。
  2. 将 6 µL 降解反应混合液加入 14 µL 浓缩样品中，通过移液混匀。在 37 °C 下孵育 3 小时，随后在 65 °C 下灭活 20 分钟，最后保持在 4 °C。
  3. 使用 SPRI 磁珠纯化降解反应混合液。加入 5 µL 水以增加反应体系体积，并加入 45 µL SPRI 磁珠（磁珠与样品体积比为 1.8:1）。按照步骤 2.6.1–2.6.6 中所述重复纯化操作，并用预热至 37 °C 的 42 µL 水洗脱。
  4. 按照步骤 9.1 所述方法，将洗脱后的样品从 42 µL 浓缩至总体积为 20 µL。

17. 控制降解程度并确定PCR扩增循环次数

  1. 准备用于扩增完整文库的qPCR混合液（接头混合液）。每个样本加入3.8 µL水、5 µL qPCR预混液（2×）、0.1 µL 10 µM的adaptor_f1引物（5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’）和0.1 µL 10 µM的adaptor_r1引物（5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’）（qPCR预混液推荐产品见材料表）。
  2. 将9 µL qPCR接头混合液与来自步骤16.4的1 µL样本混合，通过移液充分混匀。
  3. 准备用于扩增来自载体的DNA的qPCR混合液（载体混合液）。每个样本加入3.8 µL水、5 µL qPCR预混液（2×）、0.1 µL 10 µM的carrier_f1引物（5’-GCGGCAGCGTTCGCTATAAC-3’）和0.1 µL 10 µM的adaptor_r1引物。
  4. 将9 µL qPCR载体混合液与来自步骤16.4的1 µL样本混合，通过移液充分混匀。
  5. 设置qPCR程序：95 °C 预变性3 min，然后进行40个循环（95 °C 变性20 s，60 °C 退火20 s，72 °C 延伸2 min），随后按仪器要求进行解链曲线分析（65–95 °C），最后在4 °C 保存。
    注意：以水替代样本制备阴性对照。

18. 目标文库的 PCR 扩增

  1. 通过混合6 µL水、0.5 µL 10 µM adaptor_f1引物、0.5 µL 10 µM adaptor_r1引物和25 µL PCR预混液（2x）来配制PCR扩增混合液。用移液器吹打混匀（推荐的PCR预混液见材料表）。
  2. 将32 µL PCR混合液加入到18 µL第16.4步的样品中。用移液器充分吹打混匀。
  3. 设置PCR扩增程序：95 °C预变性3 min，(98 °C变性20 s，60 °C退火15 s，72 °C延伸2 min)循环12–18次，72 °C最终延伸2 min，然后置于4 °C保存。
    注意：PCR循环数由qPCR结果确定，对应于使用接头引物混合物测得的Ct值（PCR循环数等于Ct值）。
  4. 向50 µL扩增产物中加入90 µL SPRI磁珠，通过移液充分混匀。重复步骤2.6.1–2.6.6中所述的纯化步骤，并按照所述方法使用42 µL水洗脱样品。

19. 载体降解第二轮

  1. 重复步骤 16.1–16.3。
  2. 使用 SPRI 磁珠纯化降解混合物。向样品中加入 10 µL 水以增加体积，并与 30 µL SPRI 磁珠（磁珠与样品体积比为 1:1）混合。按照步骤 2.6.1–2.6.6 中所述重复纯化操作，并如前所述用预热至 37 °C 的 42 µL 水洗脱。
  3. 将洗脱后的样品从 42 µL 浓缩至总体积为 30 µL。

20. 文库大小筛选

  1. 将24 µL SPRI磁珠与步骤19.3中的30 µL样本混合（磁珠与样本比例为0.8:1）。重复步骤2.6.1–2.6.6中所述的纯化步骤，并按所述方法用42 µL水洗脱样本。
  2. 按步骤9.1所述方法将样本浓缩至约14 µL。

21. 质量控制

  1. 片段大小分布评估
    1. 取1 µL样品在高灵敏度DNA芯片上进行检测。预期结果见图4。
      注意：若可见短于200 bp的片段（见图4A、C示例），应重复片段大小选择步骤（步骤20.1–20.2），直至短片段被完全去除（图4B、D）。通常额外进行一轮大小选择即可。若短片段含量严重（如图4C所示），应将磁珠与样品的比例降低至0.6:1。
  2. 载体降解质量控制
    1. 重复步骤17.1–17.5。
      注意：根据高灵敏度DNA芯片运行结果中估算的文库浓度（区域分析），在进行qPCR前需对样品进行稀释。使用0.5 µL样品以避免样品损失，并用水稀释100–500倍（最终浓度稀释至1–20 pg/µL）。使用接头与载体混合物所获得的Ct值差异应在5–10之间。
  3. 文库定量
    1. 通过将20 µL 100 mg/mL的λ DNA标准品与980 µL 1x TE缓冲液混合，配制λ DNA标准品的工作稀释液（使用DNA定量试剂盒中提供的20x TE稀释获得1x TE）。稀释后的λ DNA标准品可保存于-20 °C。
    2. 根据补充表8，将稀释后的λ DNA标准品与1x TE缓冲液混合，制备λ DNA标准品的系列稀释液。
      注意：为提高准确性，建议先向所有管中加入100 µL 1x TE缓冲液，再根据所需加入的稀释λ DNA体积移除相应体积的1x TE。文库加入量不得超过1 µL；建议使用384孔板进行该检测。

结果

本报告描述了从纳克级起始总RNA材料中制备可用于测序文库的完整SLIC-CAGE实验流程（图1）。为获得合成RNA载体混合物，首先需要制备PCR载体模板，并通过凝胶纯化以去除PCR副产物（图2A）。每个PCR模板（共十个）使用相同的正向引物，但搭配不同的反向引物（Table 2），从而产生不同长度的PCR模板，以实现合成RNA载体在尺寸上的多样性。模板经纯化后，用于体外转录生成载体分子。若模板经过凝胶纯化，则预期仅产生单一RNA载体条带（参见图2B中代表性凝胶分析结果）。载体的制备可根据需要进行放大，制备完成后可混合并分装，于-80 °C冻存以供后续使用。

使用推荐的最低总量RNA样本量（10 ng）并结合16-18个PCR扩增循环，即可获得高复杂度的SLIC-CAGE文库。扩增最终文库所需的PCR循环数很大程度上取决于所用总RNA输入量（预期循环数见表4）。

第一轮降解后，在qPCR结果（步骤17）中，使用adaptor_f1或carrier_f1引物获得的Ct值之间的预期差异为1-2，其中adaptor_f1引物获得的Ct值低于carrier_f1引物。

最终文库中片段长度的分布范围为 200-2,000 bp，平均片段大小为 700-900 bp（基于使用 Bioanalyzer 软件进行的区域分析，图 4B、D）。如图 4A、C所示的较短片段需通过额外的尺寸排阻步骤（步骤 20-21）去除。这些短片段属于 PCR 扩增的副产物，并非目标文库。需注意的是，较短的片段在测序流动池中的簇生成效率更高，可能引发测序问题。

每个样本预期获得的文库材料量为 5–50 ng。显著偏低的产量提示在实验过程中可能发生样本损失。如果所获得的低产量仍足以用于测序（文库混合后需要 2–3 ng），则文库可能复杂度较低（见下文）。

根据测序仪器的不同，加载到流动池中的文库量可能需要优化。使用Illumina HiSeq 2500时，加载8-12 pM的SLIC-CAGE文库，平均可获得1.5亿至2亿条读长， >80%的读段通过质量分数Q30作为阈值。

获得的测序读段随后比对至参考基因组 [对于50 bp的读段，可使用Bowtie212，其默认参数允许每条种子序列（22 bp）零错配]。预期比对效率取决于总RNA输入量，详见表5。 uniquely mapped reads 可导入R语言图形与统计计算环境13，并利用CAGEr（Bioconductor软件包14）进行处理。该软件包的示例文档易于操作，详细说明了比对数据的分析流程与处理步骤。评估文库复杂度的一个简便可视化方法是启动子宽度的分布情况，因为低复杂度文库会导致启动子区域人为变窄（图5A，由1 ng总RNA构建的SLIC-CAGE文库，详细信息见先前发表的研究10）。然而，即使是低复杂度的SLIC-CAGE文库，仍可准确识别真实的转录起始位点（CTSSs），其精度优于其他适用于低/中等输入量的转录起始位点定位方法（图5B、C）。

figure-results-1
图 1：SLIC-CAGE 实验流程中的各个步骤。 将样品 RNA 与 RNA 载体混合物混合，使总 RNA 量达到 5 µg。通过逆转录合成 cDNA，并使用偏高碘酸钠对帽子结构进行氧化。氧化反应使得生物素肼能够将生物素连接至帽子结构上。由于 mRNA 的 3′ 端也被偏高碘酸钠氧化，生物素同样会连接到 mRNA 的 3′ 末端。为了去除在 cDNA 合成不完全的 mRNA:cDNA 杂交链以及 mRNA 3′ 末端上的生物素，样品经 RNase I 处理。随后，通过链霉亲和素磁珠进行亲和纯化，富集那些延伸至 mRNA 5′ 端的 cDNA（即帽子捕获）。在释放 cDNA 后，连接 5′ 和 3′ 接头。起源于载体的文库分子通过 I-SceI 和 I-CeuI 归巢内切酶降解，并使用 SPRI 磁珠去除片段。最后对文库进行 PCR 扩增。请点击此处查看该图的高清版本。

figure-results-2
图2：载体PCR模板和载体体外转录本的代表性凝胶分析。（A） 凝胶纯化前的载体PCR模板：第一泳道为1 kbp DNA标记物，随后为载体PCR模板1至10。（B） 载体体外转录本：第一泳道为1 kbp DNA标记物，随后为载体转录本1至10。加载前，将载体转录本在95 °C加热5分钟以使其变性。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：SLIC-CAGE在第一轮载体降解前的代表性DNA质量（高灵敏度DNA芯片）图谱。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图4：PCR扩增后SLIC-CAGE文库的代表性DNA质量（高灵敏度DNA芯片）图谱。（A）需要额外进行片段大小选择以去除短片段的SLIC-CAGE文库。（B）使用0.6倍体积SPRI磁珠与样本比例进行大小选择后的SLIC-CAGE文库。（C）产量较低、需要进行大小选择以去除短片段的SLIC-CAGE文库。（D）使用0.6:1的SPRI磁珠与样本比例进行大小选择后，产量较低的SLIC-CAGE文库。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 5: SLIC-CAGE 文库的验证。(A) 使用 1、5 或 10 ng 的 S. cerevisiae 总 RNA 构建的 SLIC-CAGE 文库，以及使用 5 µg 的 S. cerevisiae 总 RNA 构建的 nAnT-iCAGE 文库中，标签簇（tag cluster）的四分位间距分布。1 ng SLIC-CAGE 文库中存在大量窄峰标签簇，表明其复杂度较低。（B）在 S. cerevisiae SLIC-CAGE 文库中进行转录起始位点（CTSS）识别的 ROC 曲线。以所有 S. cerevisiae nAnT-iCAGE CTSS 作为真实集合。（C）在 S. cerevisiae nanoCAGE 文库中进行 CTSS 识别的 ROC 曲线。同样以所有 S. cerevisiae nAnT-iCAGE CTSS 作为真实集合。ROC 曲线的比较表明，SLIC-CAGE 在 CTSS 识别方面显著优于 nanoCAGE。数据来源于 ArrayExpress E-MTAB-6519。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：载体合成基因的序列。 紫色加粗斜体显示的是 I-SceI 位点，绿色显示的是 I-CeuI 识别位点。请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。

载体下游引物 5’-3’PCR 产物长度 / bp
1PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT1034
2PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC966
3PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG889
4PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT821
5PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC744
6PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA676
7PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC599
8PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC531
9PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG454
10PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA386
* 所有载体模板使用相同的上游引物。下划线部分为 T7 启动子序列。PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA

表2：载体模板扩增的引物序列。 所有载体模板的正向引物相同。下划线部分为T7启动子序列。PCR_GN5_f1：TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA。通过使用不同的反向引物，可产生不同长度的PCR模板，从而获得相应不同长度的载体RNA。

载体长度未加帽/µg加帽/µg
110343.960.45
29668.360.95
38894.40.5
48216.60.75
57444.40.5
66763.080.35
75994.40.5
85313.960.45
94542.640.3
103862.20.25

表3：RNA 载体混合物。 载体混合物总重 49 µg，其中 0.3–1 kbp：未加帽为 44 µg，加帽为 5 µg。

总RNA输入量 /ngPCR循环数
1 ng18
2 ng17
5 ng16
10 ng15-16
25 ng14-15
50 ng13-15
100 ng12-14

表4： 不同总RNA加样量下预期的PCR循环数。 循环数的近似值基于使用Saccharomyces cerevisiae、Drosophila melanogaster 和 Mus musculus 总RNA进行的实验结果。

总RNA输入量/ng总体比对率/%唯一比对率/%载体占比/%
1 ng3020-3030
2 ng6020-5010
5 ng60-7040-605-10
10 ng60-7040-605-10
25 ng65-8040-700-5
50 ng65-8040-700-3
100 ng70-8540-700-2

表5：预期的比对效率与总RNA输入量的关系。 所示数据为近似值，基于使用Saccharomyces cerevisiae和Mus musculus总RNA进行的实验结果。

补充表1：引物序列。 请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。

补充表 2：5’ 和 3’ 接头的退火。 请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。

补充表3：5’接头退火。 请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。

补充表4：5’接头混合。 请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。

补充表5：5’接头稀释液。 请点击此处查看该表格（右键点击可下载）。

补充表6：3’接头退火。 请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。

补充表7：3’接头稀释液。 请点击此处查看该表格（右键点击可下载）。

补充表 8：标准品系列稀释液的制备。 请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。

讨论

为了成功制备SLIC-CAGE文库，必须使用低吸附性枪头和离心管，以防止样品因吸附而损失。在涉及上清液回收的所有步骤中，建议完全回收全部样品体积。由于本实验流程包含多个步骤，持续的样品损失将导致文库构建失败。

如果尚未常规进行CAGE（nAnT-iCAGE），最好使用同一总RNA样本的不同上样量（10 ng、20 ng、50 ng、100 ng、200 ng）测试SLIC-CAGE，并与使用5 µg总RNA制备的nAnT-iCAGE文库进行比较。如果nAnT-iCAGE文库构建失败（每样本获得的DNA文库少于0.5–1 ng），则SLIC-CAGE很可能也无法成功，此时需要尽量减少样本损失。

确保获得高质量文库（不含未加帽的降解RNA或rRNA）的关键步骤是第7节中所述的加帽捕获（cap-trapping）。必须充分重悬链霉亲和素磁珠于洗涤缓冲液中，并在进入下一步洗涤或cDNA洗脱之前彻底去除洗涤缓冲液，这一点至关重要。

如果第一轮载体降解后的qPCR结果表明使用adaptor_f1和carrier_f1引物之间无差异，仍建议继续本实验方案。如果第二轮载体降解后，Ct值差异小于5，则建议进行第三轮载体降解。我们从未发现需要进行第三轮降解；若出现此情况，建议更换归巢内切酶的储存液。

如果最终获得的文库量不足以进行测序，可在本方案中增加额外的PCR扩增轮次。此时应设置尽可能少的扩增循环数，以获得足够测序用量的产物，同时需考虑到片段大小筛选过程中不可避免的样品损失。随后应使用SPRI磁珠进行纯化或片段大小筛选，直至所有小片段（<200 bp）均被去除（如有需要，可采用0.6:1的磁珠与样品比例），并使用Picogreen对文库进行定量。

文库可采用单端或双端测序模式进行测序。使用双端测序可获得有关转录本异构体的信息。此外，由于反转录使用随机引物（TCT-N6，其中N6为随机六聚体）进行，因此测序得到的3’端信息可作为唯一的分子标识符（UMI），用于合并PCR重复序列。由于仅使用中等数量的PCR扩增循环（最多18个循环），先前研究发现使用UMI 通常是不必要的。

由于该方案的核心依赖于 nAnT-iCAGE11，SLIC-CAGE 使用了八个条形码。因此，目前不支持对超过八个样本进行多重检测。此外，SLIC-CAGE 和 nAnT-iCAGE 均不适合捕获短于 200 bp 的 RNA，因为这些方案通过 AMPure XP 磁珠的尺寸排阻来去除接头序列和 PCR 产物，从而导致短片段丢失。

SLIC-CAGE 是目前唯一一种无偏倚、低输入量且具有单核苷酸分辨率的方法，可用于利用数纳克总RNA材料绘制转录起始位点。其他替代方法依赖于逆转录酶的模板转换活性来对带帽RNA进行条形码标记，而非采用加帽捕获技术（例如 NanoCAGE15 和 NanoPARE16）。由于存在模板转换现象，这些方法在转录起始位点（TSSs）检测中表现出序列特异性偏差，导致假阳性TSS数量增加，而真实TSS数量减少9,10。

披露

一种可降解的载体RNA/DNA专利已提交。

致谢

本工作获得了惠康基金会（The Wellcome Trust）资助（106954）以及医学研究理事会（MRC）核心资助（MC-A652-5QA10）的支持，授予 B. L.。N. C. 获得了欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金（EMBO ALTF 1279-2016）的支持；E. P. 获得了英国医学研究理事会的支持；B. L. 获得了英国医学研究理事会（MC UP 1102/1）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-丙醇，Bioultra，分子生物学用，≥99.5%Sigma-Aldrich59304-100ML-F用于 RNAclean XP 纯化。
3' 连接子序列见 Murata 等人 2014 年文献及本文手稿的补充表 1。3' 连接子的链退火方法见本实验方案的补充材料。
5' 连接子序列见 Murata 等人 2014 年文献及本文手稿的补充表 1。5' 连接子的链退火方法见本实验方案的补充材料。
Agencourt AMPure XP，60 mLBeckman CoulterA63881用于 DNA 纯化
Agencourt RNAClean XP 试剂盒Beckman CoulterA63987用于 CAGE 步骤中 RNA 及 RNA:cDNA 杂交体的纯化。
Axygen 0.2 mL 聚丙烯 PCR 管条和圆顶盖管条Axygen（可通过 Corning 购得）PCR-0208-CP-C或任何 8 管 PCR 管条（仅用于水和混合液）。
Axygen 1 x 8 管圆顶 PCR 盖Axygen（可通过 Corning 购得）PCR-02CP-CPCR 板用盖。
Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock 微量离心管Axygen（可通过 Corning 购得）MCT-150-L-C低吸附 1.5 mL 管，用于酶混合液或样品浓缩。
Axygen 96 孔无裙边 PCR 微孔板Axygen（可通过 Corning 购得）PCR-96-C低吸附 PCR 板——必须用于本实验方案的所有步骤。注意，板应裁剪为每块含 2 x 8 孔，以便更清晰地观察样品。
Bioanalyzer（或 Tapestation）：RNA nano 和 HS DNA 试剂盒Agilent用于评估 RNA 质量、有效片段筛选及文库最终质量（也可使用 Tapestation）。
生物素（长臂）酰肼Vector laboratoriesSP-1100生物素标记/标记
Cutsmart 缓冲液NEB限制性内切酶缓冲液
Deep Vent (exo-) DNA 聚合酶NEBM0259S第二链合成
DNA 连接试剂盒，Mighty MixTakara6023用于 5' 和 3'-连接子连接
dNTP 混合液（每种 10 mM）ThermoFisher Scientific18427013用于载体模板制备的 dNTP 混合液（或任何适用于 PCR 的 dNTP）。
Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠Invitrogen65305帽捕获。请勿使用其他磁珠，因本实验所用缓冲液已针对此磁珠优化。
DynaMag-2 磁力架ThermoFisher Scientific12321D用于 1.5 mL 管的磁力架——用于制备链霉亲和素磁珠。
DynaMag-96 侧裙磁力架ThermoFisher Scientific12027用于 PCR 板（96 孔板）的磁力架——与裁剪为 2 x 8 孔的板配合使用。
乙醇，BioUltra，分子生物学用，≥99.8%Sigma-Aldrich51976-500ML-F用于 AMPure 洗涤。任何适用于分子生物学的乙醇均可使用。
核酸外切酶 I (E. coli)NEBM0293S残留引物降解
凝胶上样染料，紫色（6x），无 SDSNEBB7025S琼脂糖凝胶上样染料
HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒New England BiolabsE2040S用于载体体外转录的试剂盒
水平电泳装置从琼脂糖凝胶中纯化载体 DNA 模板
I-CeuNEBR0699S用于载体降解的归巢核酸内切酶。
I-SceINEBR0694S用于载体降解的归巢核酸内切酶。
KAPA HiFi HS ReadyMix（2x）Kapa Biosystems（由 Roche 提供）KK2601用于目标文库扩增的 PCR 混合液
KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒（通用型）2xKapa Biosystems（由 Roche 提供）KK4600qPCR 混合液，用于评估降解效率及所需 PCR 扩增循环数
微量移液器及多通道微量移液器（0.1-10 µL，1-20 µL，20-200 µL）Gilson推荐使用 Gilson 配合低吸附 Sorenson 吸头。其他移液器可能不兼容。不同品牌的低吸附吸头质量可能不一，可能导致样品损失增加。
微孔板读数仪用于最终文库的 Picogreen 浓度测定。使用微孔板可实现小体积测量并减少样品浪费。
无核酸酶水ThermoFisher ScientificAM9937或任何无核酸酶（DNase 和 RNase）的水
PCR 热循环仪用于孵育步骤和 PCR 扩增
Phusion 高保真 DNA 聚合酶ThermoFisher ScientificF530S用于载体模板扩增的 DNA 聚合酶（或任何高保真聚合酶）
QIAquick 凝胶提取试剂盒（50）Qiagen28704从琼脂糖凝胶中纯化载体 PCR 模板。
qPCR 仪用于确定 PCR 扩增循环数及载体降解程度
Quant-iT PicoGreen dsDNA 试剂ThermoFisher ScientificP11495用于测定最终文库浓度——推荐使用，因在我们实验中其比 Qubit 更准确且可重复性更高。
Quick-Load 紫色 100 bp DNA 标准物NEBN0551SDNA 标准物
Quick-Load 紫色 1 kb Plus DNA 标准物NEBN0550SDNA 标准物
核糖核酸酶 HTakara2150A帽捕获后 RNA 的消化。
RNase ONE 核糖核酸酶PromegaM4261降解未被 cDNA 保护的单链 RNA。
无 RNase DNase 试剂盒Qiagen79254体外转录后去除载体 DNA 模板。
RNeasy Mini 试剂盒Qiagen74104用于体外转录或加帽后载体 RNA 的纯化
乙酸钠，1 M，水溶液，pH 4.5，无 RNaseVWRAAJ63669-AK或任何无核酸酶（DNase 和 RNase）的溶液
乙酸钠，1 M，水溶液，pH 6.0，无 RNase或任何无核酸酶（DNase 和 RNase）的溶液
高碘酸钠Sigma-Aldrich311448-100G邻二醇氧化
Sorenson 低吸附气溶胶屏障吸头，MicroReach Guard，体积范围 10 μL，带刻度Sorenson（可通过 SIGMA-ALDRICH 购得）Z719390-960EA低吸附吸头——推荐在整个实验流程中使用，以最大限度减少样品损失。
Sorenson 低吸附气溶胶屏障吸头，MultiGuard，体积范围 1,000 μL，带刻度Sorenson（可通过 SIGMA-ALDRICH 购得）Z719463-1000EA低吸附吸头——推荐在整个实验流程中使用，以最大限度减少样品损失。
Sorenson 低吸附气溶胶屏障吸头，MultiGuard，体积范围 20 μL，带刻度Sorenson（可通过 SIGMA-ALDRICH 购得）Z719412-960EA低吸附吸头——推荐在整个实验流程中使用，以最大限度减少样品损失。
Sorenson 低吸附气溶胶屏障吸头，MultiGuard，体积范围 200 μL，带刻度Sorenson（可通过 SIGMA-ALDRICH 购得）Z719447-960EA低吸附吸头——推荐在整个实验流程中使用，以最大限度减少样品损失。
SpeedVac 真空浓缩仪在多个步骤中浓缩样品至较小体积
SuperScript III 逆转录酶ThermoFisher Scientific18080044用于逆转录（第一轮 CAGE 步骤）
海藻糖/山梨醇溶液制备方法见 Murata 等人 2014 年文献。
Tris-HCl，1 M 水溶液，pH 8.51 M 溶液，无 DNase 和 RNase
tRNA（20 mg/mL）tRNA 溶液。制备方法见 Murata 等人 2014 年文献。
UltraPure 低熔点琼脂糖ThermoFisher Scientific16520050或任何合适的纯低熔点琼脂糖。
USB 虾碱性磷酸酶（SAP）Applied Biosystems（由 ThermoFisher Scientific 提供）78390500UN
USER 酶NEBM5505S降解 3' 连接子上链，尿嘧啶特异性切除试剂/酶
痘苗病毒加帽系统NEBM2080S用于载体分子体外加帽的酶试剂盒
洗涤缓冲液 A帽捕获洗涤液。制备方法见 Murata 等人 2014 年文献。
洗涤缓冲液 B帽捕获洗涤液。制备方法见 Murata 等人 2014 年文献。
洗涤缓冲液 C帽捕获洗涤液。制备方法见 Murata 等人 2014 年文献。

参考文献

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CAGE RNA II RNA

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