最小红斑剂量（MED）检测用于确定紫外线辐射光疗的剂量方案。该方法可评估个体在炎症反应中的差异，但缺乏实现可重复结果的方法学。本文介绍了一种精确的MED实施方法，并展示了其捕捉个体炎症反应差异的能力。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
最小红斑剂量（MED）检测在临床中常用于确定在皮肤表面产生红斑（炎症性发红）所需的最小紫外线（UV）照射量。在此背景下，MED被视为确定银屑病和湿疹等常见皮肤病进行UV光疗时起始剂量的关键因素。在科研环境中，MED检测也有潜力成为评估个体内部及个体间炎症反应差异的有力工具。然而，MED检测尚未在科研领域得到广泛应用，这可能主要是由于缺乏已发表的指导规范，从而成为获得可重复实验结果的障碍。此外，建立MED的实验方案和设备差异较大，导致不同实验室之间的结果难以比较。本文介绍了一种精确且可重复的方法，通过新设计的方案和技术诱导并测量表皮红斑，且该方法可轻松适配其他设备和实验室环境。本文所述方法详细说明了相关操作步骤，可将标准化的剂量方案外推至其他设备，从而使该方案能够适用于任何紫外线辐射源。
引言
最小红斑剂量（MED）检测是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的检测方法，用于评估皮肤对辐射的敏感性，通常针对中波紫外线（UVB）范围，尽管MED也可在紫外线和可见光谱的其他波长下测定1。红斑定义为皮肤表面因毛细血管充血而引起的浅表性发红（红斑的后期阶段更常被称为晒伤）。MED检测已在皮肤科文献和临床光疗实践中广泛应用，用于确定能够引起皮肤红斑可测量变化的最小紫外线（UV）辐射剂量。MED检测可使用市售的紫外线灯完成，其类型与大多数商业晒黑机构所用的灯具相当。
最小红斑剂量（MED）检测涉及将紫外线辐射或可见光谱中的光线持续照射到皮肤表面，照射时间预先设定，剂量方案主要取决于皮肤的色素沉着程度以及辐射的强度和类型。该方法在临床中常用于确定接受紫外线辐射治疗的患者的剂量方案，例如治疗银屑病和湿疹等皮肤疾病2,3。有关在临床环境中确定MED的基本操作步骤已有其他文献描述4，可根据个体间皮肤敏感性的差异，用于上调或下调紫外线辐射的总剂量。
皮肤色素沉着可能是进行最小红斑量（MED）实验并测量其结果时最重要的特定变量6。这是因为引发最小红斑反应所需的紫外线照射时间主要取决于受试者皮肤的明暗程度，而该程度由Fitzpatrick皮肤分型（FST）定义。FST7是一种用于对人体肤色进行分类的数字体系。Fitzpatrick量表是皮肤色素沉着研究中公认的研究工具8,9，可将人类皮肤分为六类，从最浅色（FST I）到最深色（FST VI）。
FST 类型较深的皮肤需要更长的紫外线照射时间，因此准确分类 FST 非常重要。已有大量文献报道了多种准确评估 FST 的方法，包括自我报告、皮肤科医生访谈以及基于仪器的评估等不同手段。观察者对 FST 的评级已被证明与当前肤色相关，但与自然肤色无关10；然而，FST 可通过问卷进行主观自我报告12，或通过分光光度法进行客观评估来确定11。多项研究表明，采用分光光度法进行 Fitzpatrick 分型与受试者自我报告结果高度一致10,13,14,15。
尽管MED检测在临床服务中具有实用性和广泛应用，但该方法尚未在实验室环境中被广泛采用以测量个体对促炎刺激反应的差异。本文所述方法的目的是提供一系列技术和逐步操作流程，以提高MED检测的精确性和可重复性，从而推动未来在实验室环境中对炎症反应个体内变异性的精细量化研究。我们还提供了代表性结果，以展示该标准化方案准确捕捉个体间炎症反应差异的能力。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
以下所述的所有方法，包括使用人类志愿者，均已通过当地机构审查委员会（IRB）的审查和批准，并符合《赫尔辛基宣言》和《贝尔蒙报告》的要求。所有受试者（N=72）均按照IRB协议规定签署了知情同意书。纳入/排除标准及中止试验程序的设计旨在最大限度保障受试者的安全，任何对这些程序的偏离均应根据其对受试者风险和耐受性的影响加以考虑。在本研究工作背景下，排除标准限定为无个人或家族炎症性疾病史，且无任何合法或非法物质使用史的个体。如此设定的理由是，这些因素可能影响个体对最小红斑量（MED）检测程序的反应。
1. 受试者选择
- 采用以下纳入标准：年龄18-55岁；经医学症状检查表（Medical Symptom Checklist, MSCL）评估，总体健康状况良好5；能够理解并就以英文呈现的实验室安全规程进行沟通；能够提供书面知情同意书。
- 采用以下排除标准：Fitzpatrick皮肤分型为I型（根据受试者自报）；经常使用商业美黑设备；暴露部位皮肤存在伤口或病变；当前患有皮肤癌，或既往有皮肤癌病史；家族中有皮肤癌病史；患有糖尿病；患有银屑病或其他炎症性皮肤疾病；患有外周血管疾病、外周动脉疾病、雷诺病，或任何其他已确诊的循环系统疾病；存在任何非自主性运动障碍；对胶带过敏；因哮喘使用吸入性类固醇药物（例如氟替卡松）；正在使用任何类固醇药物；在过去3个月内使用过影响中枢神经系统功能的药物，包括精神类药物、阿片类药物或类固醇药物；目前或过去3个月内曾使用任何处方性精神类药物（包括用于治疗焦虑、抑郁或其他心理问题的药物）；具备以下两项或以上情况者：已确诊的高血压、高脂血症、高胆固醇、吸烟、一级亲属（父母或兄弟姐妹）在55岁前患有冠状动脉疾病或动脉粥样硬化性疾病；存在活性物质依赖（无论合法或非法）；物质依赖但处于康复初期（康复时间少于一年）。
2. MED 的安排与准备
- 为受试者安排两次预约：第一次为MED暴露实验（约45分钟），第二次为随访，用于采集分光光度计读数（约10分钟）。随访预约应安排在第一次预约后的24小时进行。
- 在受试者到达前，准备好必要的设备，包括两个剂量测试袖带和安全防护装备。准备多种紫外线防护服装（如防紫外线运动袖套、防紫外线手套、长袖医用刷手服、防紫外线遮布以及用于固定遮布的胶带），供受试者和研究人员使用，以覆盖所有暴露于紫外线辐射的皮肤区域。
- 根据制造商的规格校准分光光度计。每位受试者在每次实验会话中均需进行校准。
3. 确定Fitzpatrick皮肤类型（FST）
- 当受试者参加 MED 暴露实验（访视 1）时，通过自述报告或分光光度法确定 Fitzpatrick 皮肤类型（FST）。为最大程度保障受试者安全，不得对归类为 FST 1 型的受试者进行 MED 测试。对于所有其他 Fitzpatrick 皮肤类型（2—6 型），应根据 FST 分值确定所采用的暴露方案。
4. 套管1的应用
- 向受试者解释MED测试的原理，并在开始前征求其疑问。
- 通常在非优势前臂内侧进行MED检测。
- 放置Cuff 1（移除所有孔洞覆盖物），避开雀斑、痣、疤痕、毛发（尽可能）、以及皮肤上的任何伤口、瘀伤或病变部位。仅移除Cuff 1外侧部分（非中央区域）的保护性蜡纸背衬。必须注意不要移除Cuff 1中央区域的蜡纸背衬，因为该区域的黏合剂在基线读数后撕下时极易刺激皮肤，导致孔洞附近皮肤发红。
- 将Cuff 1放置于预定照射部位后，使用永久性记号笔标记定位点，以确保Cuff 2能准确置于同一位置。在Cuff 1两侧翼片褶皱外的四个位置标记皮肤，分别为右上、左上、右下和左下点。
- 标记应足够清晰，以维持约24小时，因为这些标记还将在24小时后的随访时用于将Cuff 3精确放置于相同位置。
5. 基线读数：袖带1应用
- 使用根据制造商规格校准好的分光光度计，依次获取并永久记录六个开放孔径处的读数。
- 确保分光光度计位于袖带孔径的中心位置，尽可能避开痣、疤痕或其他皮肤瑕疵。
- 永久记录所有“SCI”值（L、A、B）。为确保与同一校准点的读数一致性，在最小红斑剂量（MED）检测过程中保持分光光度计处于开启状态，并在完成照射后读数前不得关闭。
- 记录完基础分光光度测量值后，取下袖带1。为尽量减少受试者的不适，在剥离袖带1时，将其边缘涂抹医用粘合剂溶剂，以防止手臂毛发被疼痛性拔除。
6. 暴露前阅读：袖带2应用
- 取下Cuff 1后，利用皮肤上为Cuff 1标记的定位参照，将Cuff 2置于相同位置。应完全暴露Cuff 2的粘性背衬并贴附，以确保其充分密封，防止因与皮肤粘附不充分而导致各孔之间发生交叉暴露。
- 要求受试者和研究人员均穿戴防紫外线防护服及安全配件。至少受试者、操作该程序的技术人员以及房间内的其他人员必须佩戴防紫外线护目镜。技术人员应穿着长袖衣物或使用防紫外线袖套。
- 在开启紫外灯之前，技术人员应协助受试者遮盖所有暴露的皮肤区域，包括贴片上方的上臂、贴片下方的前臂和手腕、手部，以及贴片两侧可能暴露的前臂或后臂部分（可使用防紫外线遮蔽片及固定用胶带辅助完成）。此外，穿着低领上衣的受试者若其颈部和胸部靠近紫外光源，建议用防紫外线布料覆盖这些区域。
- 在受试者手臂下方铺置防紫外线布料（以减少桌面反射紫外线）。
7. MED 操作步骤：暴露前处理
注意：光源的光线必须垂直于照射部位。通常情况下，移动光源本身不如移动或调整受试者手臂的角度可行。
- 在打开光源之前，调整受试者的手臂位置，使光源发出的紫外线垂直于受试者手臂上袖带2的角度。
- 确定光源与受试者手臂上袖带2之间的合适距离。将辐射计的传感器朝向紫外灯，使其与皮肤表面平行，并尽可能靠近袖带2的位置。
- 用防紫外线布覆盖受试者手臂以防止暴露，短暂开启光源，调节光源与袖带2之间的距离，直至辐射计传感器读数为270 μW/cm2.
- 为达到此读数，调节光源与皮肤表面之间的距离，直至辐射计读数为 270 μW/cm2 （± 10 μW）。确定合适距离后，关闭光源。
注意： 需要注意的是，辐射计角度的微小差异 将产生重大影响 读数。因此，辐射计的角度应尽可能与皮肤表面平行。
- 为达到此读数，调节光源与皮肤表面之间的距离，直至辐射计读数为 270 μW/cm2 （± 10 μW）。确定合适距离后，关闭光源。
- 在整个曝光过程中不断调整距离，以防止手臂位置发生漂移。每次读数时，确认距离并根据需要重新调整，以保持辐射计读数稳定在约 270 μW/cm。2 （± 10 μW）
8. MED 手术步骤：暴露
- 使用秒表实施 MED 时间表。在激活紫外光源之前，先移除第一个孔径遮盖。同时启动光源和秒表，并根据下表中基于 FST 的规定时间，依次移除 Cuff 2 上的各个孔径遮盖。
- 在移除每个孔径遮盖的时刻，将辐射计平行于皮肤表面并朝向灯管放置，记录此时的辐射计读数。如果距离发生变化，应调整皮肤与灯管之间的距离，确保辐射计读数再次为 270 (± 10) μW/cm2。
- 让技术人员监控受试者手臂，以确保位置保持一致。特别地，若手臂发生旋转（许多受试者在放松时会出现此情况），需重新调整手臂位置。每次调整后，需重新确认辐射计读数为 270 μW/cm2（± 10 μW）。
- 按照表 1中剂量时间表规定的精确时间关闭光源。不要停止秒表，因为在光源关闭后 7 分钟需立即采集另一组分光光度计读数，具体操作如下所述。
9. 暴露后7分钟读数
- 在关闭光源后的第7分钟，准确记录Cuff 2中每个孔径的最终分光光度计读数。在照射程序结束后立即采集数据的目的有两个：首先，确认受试者对紫外线辐射无不良反应；其次，评估初始反应，这些反应在某些情况下可能较轻微，但与基线（照射前）数值相比具有可测量的差异。若在7分钟后出现红斑加重，很可能是热效应所致，而非红斑反应。
注意： 若在照射后7分钟内出现对紫外线辐射的不良反应，可能与日光性荨麻疹的最小荨麻疹剂量有关，这是一种获得性光敏感性皮肤病。在进行最小红斑剂量（MED）实验前应预先评估是否存在光敏感性皮肤病，患有此类疾病的受试者应被排除。然而，若在测试过程中任何时间点观察到此类反应，应立即终止照射程序。 - 紫外线照射后，Cuff 2可能特别难以取下。必要时可使用医用级粘合剂溶剂，以减少取下Cuff 2时受试者的不适。体毛较多或皮肤特别敏感的受试者可在缓慢移除贴片时，于Cuff 2边缘下方涂抹橄榄油或酒精类粘合剂去除剂，以助于操作。取下Cuff 2后，受试者皮肤上可能残留粘合剂，也可使用橄榄油或医用粘合剂溶剂将其清除。
- 在受试者结束照射实验离开前，提醒其不要清洗标记部位，且不得在照射区域涂抹任何乳液或润肤产品。
10. 随访预约：袖带3应用
- 在受试者到达之前，根据制造商的规格校准分光光度计。
- 准备3号袖带，移除所有开孔覆盖物（保留贴片中央部分的白色蜡纸背衬）。将3号袖带放置于受试者手臂上时，移除贴片两侧翼片的白色蜡纸背衬。利用受试者前臂上的解剖标志，将3号袖带置于与前两个贴片相同的位置。
- 依次对六个开放开孔中的每一个进行读数。此外，目视检查每个开孔，并记录每个开孔处是否存在红斑反应的视觉证据（皮肤发红或粉红表示出现红斑）。在永久记录分光光度计读数后，必要时使用溶剂去除3号袖带。
- 为进一步提高受试者的舒适度和安全性，提供4–6支一次性烧伤凝胶或芦荟胶，并告知受试者，如果暴露部位出现瘙痒或不适，可将其视为晒伤，并使用这些或类似的非处方产品进行处理。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
所展示的时间安排 表1 是一种新型剂量方案，该方案经计算设计，旨在使每次FST的暴露事件中点（即光圈3或4）平均达到MED。该计算方案的基础如下。
既往研究已证实，对于FST 2个体，UVB波段辐射的中位MED为每平方厘米66.9毫瓦（mW）2，77.429 mW/cm2 FST 3 为 85.0，FST 4 为 85.016. 假设UVB能量恒定， 270 μW/cm2，我们将该常数外推至时间域，以基于这些中位数值确定在给定剂量方案的中点处捕获最小红斑剂量（MED）所需的秒数，适用于每种Fitzpatrick皮肤类型（FST）。我们进一步引入了一种递增式方案，使得每个光圈（2至6号）接收的能量比前一个增加25%，其原理类似于MED测试中常用的递增比率系列。尽管目前尚无FST 5和6型皮肤的MED参考范围，但我们通过将FST 2至4型之间的参考范围差异进行外推，计算出用于递增时间序列乘法的常数，从而理论上估算出这些皮肤类型个体达到MED...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
如本文所述，精确实施MED检测可能相较于其他已广泛使用的基于实验室的炎症刺激方法具有多项优势。例如，抽吸水疱法17,18,19通过在皮肤上形成充满液体的水疱，随后用注射器抽吸，以直接获取细胞因子微环境。尽管皮肤水疱法是研究皮肤免疫学和炎症的常用工具20，且在获取稀有细胞群体和蛋白质方面可能尤为有效21，但此类操作需要专业人员，并且通常对受试者具有高度侵入性和不适感，因而难以在研究对象中普遍应用，同时带来伦理和实际操作上的挑战。类似地，表浅炎症刺激方法（如辣椒素乳膏诱导的血管扩张）虽可有效激发皮肤炎症，但对局部炎症反应（红斑）的量化依赖于人工描记和主观评分，易引入误差，从而降低了该方法在实验室中的可靠性。
在光疗环境中，确定最小红斑剂量（MED）的目的是为了计算个体在接受UVB光疗时的起始辐射剂量。然而，...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
本研究的作者声明不存在任何利益冲突，包括财务方面的利益冲突。
致谢
本工作获得了弗吉尼亚理工学院理学院发现基金的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔剂量测试贴片（“Cuff”） | Daavlin | ||
| 医用级粘合剂溶剂 | |||
| 非反光防紫外线织物 | |||
| 辐射计 | SolarLight | Model 6.2 UVB Meter | |
| 一次性芦荟或烧伤凝胶 | |||
| 分光光度计 | Konika-Minolta | CM-2600D | |
| 秒表 | |||
| 紫外线灯 – Fiji Sun | Sperti | 发射光谱 280 nm–400 nm，约 25% UVB | |
| 防紫外线护目镜（2副） | |||
| 防紫外线套袖 | |||
| 白色棉质手套（2副） |
参考文献
- Magnus, I. A. Dermatological Photobiology: Clinical and Experimental Aspects. Blackwell Scientific Publications. , J. B. Lippincott. (1976).
- Grundmann-Kollmann, M., et al. Phototherapy for atopic eczema with narrow-band UVB. Journal of the American Academy of Dermatology. 40 (6), Pt 1 995-997 (1999).
- Honigsmann, H. Phototherapy for psoriasis. Clinical and Experimental Dermatology. 26 (4), 343-350 (2001).
- Heckman, C. J., et al. Minimal Erythema Dose (MED) testing. Journal of Visualized Experiments. (75), e50175(2013).
- Kroenke, K., et al. Physical symptoms in primary care. Predictors of psychiatric disorders and functional impairment. Archives of Family Medicine. 3 (9), 774-779 (1994).
- Coelho, S. G., et al. Non-invasive diffuse reflectance measurements of cutaneous melanin content can predict human sensitivity to ultraviolet radiation. Experimental Dermatology. 22 (4), 266-271 (2013).
- Fitzpatrick, T. B. The validity and practicality of sun-reactive skin types I through VI. Archives of Dermatology. 124 (6), 869-871 (1988).
- Matts, P. J., Dykes, P. J., Marks, R. The distribution of melanin in skin determined in vivo. British Journal of Dermatology. 156 (4), 620-628 (2007).
- Eilers, S., et al. Accuracy of self-report in assessing Fitzpatrick skin phototypes I through VI. JAMA Dermatology. 149 (11), 1289-1294 (2013).
- Daniel, L. C., Heckman, C. J., Kloss, J. D., Manne, S. L. Comparing alternative methods of measuring skin color and damage. Cancer Causes, Control. 20 (3), 313-321 (2009).
- Ravnbak, M. H., Philipsen, P. A., Wulf, H. C. The minimal melanogenesis dose/minimal erythema dose ratio declines with increasing skin pigmentation using solar simulator and narrowband ultraviolet B exposure. Photodermatology Photoimmunology & Photomedicine. 26 (3), 133-137 (2010).
- Miller, S. A., et al. Evidence for a new paradigm for ultraviolet exposure: a universal schedule that is skin phototype independent. Photodermatology Photoimmunology & Photomedicine. 28 (4), 187-195 (2012).
- Pershing, L. K., et al. Reflectance spectrophotometer: The dermatologists' sphygmomanometer for skin phototyping. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1633-1640 (2008).
- Kollias, N., Baqer, A., Sadiq, I. Minimum Erythema Dose Determination in Individuals of Skin Type-V and Type-Vi with Diffuse-Reflectance Spectroscopy. Photodermatology Photoimmunology & Photomedicine. 10 (6), 249-254 (1994).
- Treesirichod, A., Chansakulporn, S., Wattanapan, P. Correlation Between Skin Color Evaluation by Skin Color Scale Chart and Narrowband Reflectance Spectrophotometer. Indian Journal of Dermatology. 59 (4), 339-342 (2014).
- Gambichler, T., et al. Reference limits for erythema-effective UV doses. Photochemistry and Photobiology. 82 (4), 1097-1102 (2006).
- Kool, J., et al. Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins. Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).
- Clark, K. E., Lopez, H., Abdi, B. A., et al. Multiplex cytokine analysis of dermal interstitial blister fluid defines local disease mechanisms in systemic sclerosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 73(2015).
- Rosenkranz, M. A., et al. A comparison of mindfulness-based stress reduction and an active control in modulation of neurogenic inflammation. Brain Behavior and Immunity. 27 (1), 174-184 (2013).
- Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response. Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).
- Holm, L. L., et al. A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (138), 57554(2018).
- Seitz, J. C., Whitmore, C. G. Measurement of erythema and tanning responses in human skin using a tri-stimulus colorimeter. Dermatologica. 177 (2), 70-75 (1988).
- Henriksen, M., Na, R., Agren, M. S., Wulf, H. C. Minimal erythema dose after multiple UV exposures depends on pre-exposure skin pigmentation. Photodermatology Photoimmunology & Photomedicine. 20 (4), 163-169 (2004).
- Stamatas, G. N., Zmudzka, B. Z., Kollias, N., Beer, J. Z. In vivo measurement of skin erythema and pigmentation: new means of implementation of diffuse reflectance spectroscopy with a commercial instrument. British Journal of Dermatology. 159 (3), 683-690 (2008).
- Latreille, J., et al. Influence of skin colour on the detection of cutaneous erythema and tanning phenomena using reflectance spectrophotometry. Skin Research and Technology. 13 (3), 236-241 (2007).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
