使用胶原酶E从小鼠结肠中分离固有层单个核细胞

摘要

本实验方案的目的是通过胶原酶对组织进行酶消化，分离结肠固有层中定居的单个核细胞。该方案可高效地分离单个核细胞，获得单细胞悬液，进而可用于可靠的免疫表型分析。

摘要

肠道是体内免疫细胞数量最多的器官。小肠和大肠的免疫系统负责监控外源性抗原的暴露，并调节对强效微生物来源免疫刺激物的反应。因此，肠道在多种疾病中成为免疫失调和炎症的主要靶器官，这些疾病包括但不限于克罗恩病和溃疡性结肠炎等炎症性肠病、骨髓移植（BMT）后移植物抗宿主病（GVHD），以及多种过敏性和感染性疾病。小鼠胃肠道炎症和结肠炎模型被广泛用于研究胃肠道并发症，并在临床前阶段优化预防和治疗策略。通过从肠道中分离并进行免疫细胞表型分析，从这些模型中获得的数据对于深入理解免疫机制至关重要，可进一步应用于改善胃肠道及全身性炎症性疾病。本报告描述了一种高效分离结肠单个核细胞（MNC）的实验方案，该方法采用混合硅基密度梯度界面法。该方法可稳定地分离出大量活的白细胞，同时最大限度减少杂质碎片的污染，从而为后续通过流式细胞术或其他方法进行免疫表型分析提供良好基础。

引言

尽管胃肠道（GI）道主要负责食物中营养物质的消化和重吸收，但其黏膜及黏膜下免疫系统还在维持血管、淋巴和神经系统以及多种其他器官的完整性方面发挥着核心作用¹。由于胃肠道免疫系统持续暴露于食物来源的异源抗原、共生细菌或入侵性病原体，因此在胃肠道健康和全身健康中均具有重要影响^1,2。因此，胃肠道免疫系统必须维持一种精细的平衡：既要对非致病性抗原产生耐受，又要对致病性抗原作出适当反应^1,2。当这种耐受与防御之间的平衡被打破时，可能引发局部或全身性的免疫失调和炎症反应，导致多种疾病的发生^1,2,3。

肠道容纳了体内至少70%的淋巴细胞⁴。大多数初级免疫反应均涉及肠道中的三个免疫站点之一：1）派尔集合淋巴结（Peyer’s Patches），2）上皮内淋巴细胞（Intraepithelial lymphocytes, IEL）以及3）固有层淋巴细胞（lamina propria lymphocytes, LPL）。这些结构均由复杂的相互关联的免疫细胞网络组成，能够对肠道内的正常免疫挑战迅速作出反应⁵。固有层为结构疏松的结缔组织，位于黏膜肌层上方的黏膜固有层内，构成肠道黏膜的支架结构，包含绒毛支架、血管系统、淋巴引流系统、黏膜神经系统以及众多固有免疫和适应性免疫细胞亚群^6,7,8,9。LPL主要由CD4⁺和CD8⁺ T细胞组成，其比例约为2:1，此外还包括浆细胞以及髓系来源的细胞，如树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞⁶。

人们日益关注肠道免疫失调和炎症在各种疾病状态中的作用。克罗恩病和溃疡性结肠炎等疾病均表现出不同程度的结肠炎症^10,11,12。此外，接受异基因骨髓移植（allo-BMT）的患有骨髓或免疫系统恶性或非恶性疾病的患者可能发展出多种形式的结肠炎，包括：1）BMT前预处理方案引起的直接毒性；2）BMT后因免疫抑制导致的感染；以及3）由供体来源T细胞在BMT后对组织中的供体同种异体抗原发生反应所引发的移植物抗宿主病（GVHD）^13,14,15。所有这些BMT后的并发症均会导致肠道免疫微环境发生显著改变^16,17,18。本方案提出的方法可稳定评估小鼠结肠中免疫细胞的聚集情况，当应用于BMT后的小鼠受体时，能够高效检测参与移植耐受的供体与受体来源的免疫细胞^19,20。其他引起肠道炎症的原因还包括恶性肿瘤、食物过敏或肠道微生物组的破坏。本实验方案可用于获取这些临床前小鼠模型中结肠的肠道单个核细胞，并通过适当修改，也可用于分离小肠中的白细胞。

使用检索词“intestine AND immune cell AND isolation”在PubMed中进行检索，可发现超过200篇描述从小肠消化以提取免疫细胞的方法的文献。然而，针对结肠进行类似的文献检索时，却未发现明确界定的、专门从结肠中分离免疫细胞的实验方案。这可能是因为结肠具有更多的肌层和间质层，使其比小肠更难实现完全消化。与现有方案不同，本方案专门使用来自Clostridium histolyticum的胶原酶E（Collagenase E），而不使用其他细菌来源的胶原酶（如胶原酶D或胶原酶I）。我们证明，采用本方案可在不添加抗聚集试剂（如乙二胺四乙酸钠盐（EDTA）、Dispase II和脱氧核糖核酸酶I（DNAse I））的情况下，有效消化结肠组织，同时保持所分离肠道单个核免疫细胞（MNC）的质量^21,22,23。本方案经过优化，可从小鼠结肠中稳定、重复地提取出高活性的MNC，适用于后续定向研究，也可用于结肠免疫学研究，或经适当修改后用于小肠的研究^24,25。

方案

所有研究均在经迈阿密大学米勒医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准的啮齿类动物研究方案下进行，该委员会符合美国实验动物科学协会（AALAS）制定的兽医标准。

1. 溶液的配制

1. 如表1所述，配制结肠缓冲液、100%二氧化硅密度分离介质、66%二氧化硅密度分离介质、44%二氧化硅密度分离介质、胶原酶E消化缓冲液和FACS缓冲液。
   1. 在实验前一天配制结肠缓冲液，并于4 °C过夜保存。
   2. 在实验前一天配制100%二氧化硅密度分离介质，并于4 °C过夜保存；实验当天早晨将其置于室温下解冻。
   3. 在细胞分离当天早晨，使用室温的100%二氧化硅密度分离介质和结肠缓冲液配制66%和44%二氧化硅密度分离介质。
   4. 称取适量来源于Clostridium histolyticum的胶原酶E，并在实验前夜于-20 °C保存。次日早晨，将其溶解于适当体积的结肠缓冲液中，制成胶原酶消化缓冲液。实验当天所有使用胶原酶消化缓冲液的孵育步骤，均需预先将溶液在37 °C预热。
2. 在整个实验流程中，设置一台离心机参数为20 °C、转速859 x g，并关闭刹车（减速度为0），用于梯度离心；另设一台离心机参数为4 °C、转速859 x g，采用标准减速度，用于洗涤步骤。

2. 收集结肠

1. 通过 CO₂ 窒息法处死小鼠，并采用 AALAC 认可的确认方法进行验证。
2. 将小鼠置于仰卧位，用 70% 乙醇喷洒毛发。使用大型组织剪沿中线做垂直切口，暴露完整的腹膜。
3. 使用精细解剖剪切开腹膜。用镊子将小肠推向一侧，暴露降结肠。轻轻向上牵拉降结肠，以充分暴露直肠段结肠。在骨盆深部切断远端直肠，将整个结肠作为一个整体解剖并取出，从远端直肠至盲肠帽。
4. 将结肠转移至含有 20 mL 冰冷结肠缓冲液的 50 mL 聚丙烯管中。

3. 清洁结肠

1. 将结肠置于湿润的纸巾上，用剪刀或镊子的钝端轻轻按压肠壁，以挤出固体粪便。
2. 将结肠放入培养皿中，使用带有18 G钝头填充针的10 mL注射器，注入10 mL预冷的结肠缓冲液冲洗肠道。
3. 将结肠转移至用结肠缓冲液润湿的纸巾上，用剪刀的尖端去除肠系膜和脂肪组织。
4. 将结肠放入盛有5–10 mL预冷结肠缓冲液的培养皿中，手动轻轻搅动以清洗残留的结肠内容物，重复2–3次。
5. 在盛有新鲜预冷结肠缓冲液的培养皿中，从肌肉较发达的直肠端向近端结肠纵向剪开结肠，得到一块矩形的开放状结肠组织。弃去原有液体，并重新加入干净的预冷结肠缓冲液。
6. 通过在培养皿中剧烈旋转晃动结肠组织，每次用5–10 mL预冷结肠缓冲液洗涤，共洗涤3次，每次更换缓冲液。
7. 将矩形结肠组织放在用结肠缓冲液润湿的纸巾上，先水平切开，再切成小片段（3 mm × 3 mm 的组织块）。
8. 用精细镊子小心夹取结肠片段，放入装有20 mL预冷结肠缓冲液的50 mL聚丙烯离心管中。
9. 每次用20 mL结肠缓冲液，剧烈旋转离心管30秒，对结肠片段进行3次洗涤。每次震荡后，让组织片段自然沉降至管底。每次洗涤后倾倒或用真空抽吸去除上清液，注意防止组织片段在抽吸过程中丢失。
   注意：每次洗涤后无需更换离心管。

4. 胶原酶消化 1

1. 向50 mL聚丙烯锥形管中已清洗的结肠片段加入20 mL胶原酶消化缓冲液。
2. 将封闭的50 mL管置于37 °C的恒温振荡摇床中，设置转速为2 × g，振荡60分钟。确保组织片段在振荡过程中持续运动；如有必要，可逐步提高转速，以防止任何组织片段沉降至管底。

5. 制备基于二氧化硅的分离介质梯度

1. 使用100%硅胶基密度分离介质和结肠缓冲液，在20 °C（室温）下配制66%和44%的硅胶基密度分离介质。
2. 将5 mL的66%硅胶基密度分离介质分别倒入3个独立的15 mL聚丙烯管中。每段结肠准备3根管。此步骤形成梯度分离程序中的高密度底层，后续将叠加低密度分离介质以建立分离梯度。
3. 于20 °C保存，待用。

6. 收集第一次消化的上清液

1. 胶原酶消化1步骤完成后，使用25 mL血清移液管仅收集上清液，并将上清液通过置于洁净50 mL聚丙烯锥形管上的40 μm孔径滤布细胞筛进行过滤。注意避免吸入任何存在的组织碎片。
   注意：将试管中任何残留的可见组织碎片保留下来，这些组织碎片将进行第二次胶原酶消化（步骤8）。

7. 终止胶原酶消化缓冲液

1. 用预冷的结肠缓冲液（Colon Buffer）将50 mL聚丙烯管完全充满。
   注意：胶原酶在37 °C时具有活性，因此使用预冷缓冲液可使其失活。
2. 在4 °C下以800 × g离心5分钟。
   1. 通过真空抽吸弃去上清液。用25 mL新鲜结肠缓冲液重悬细胞，并在800 × g离心5分钟。
   2. 将沉淀物重悬于少于1 mL的新鲜预冷结肠缓冲液中。
   3. 将50 mL聚丙烯锥形管置于冰上。

8. 胶原酶消化 2

1. 使用步骤 6.1 中保留的剩余组织碎片，重复步骤 4（第一次消化）。

9. 消化后的组织解离 2

1. 使用10 mL注射器通过18 G钝端针头，在试管和注射器之间用力来回冲洗组织碎片。
2. 至少重复此冲洗操作7-8次，持续进行直至肉眼不可见明显的组织碎片或残渣。

10. 过滤细胞

1. 将组织解离悬液通过40 μm孔径的滤膜细胞筛，滤入一个洁净的50 mL聚丙烯管中。
2. 用10 mL预冷的结肠缓冲液冲洗滤膜细胞筛，以回收滤膜中截留的细胞。

11. 终止胶原酶消化

1. 用预冷的结肠缓冲液将50 mL聚丙烯离心管加至液面齐平。
   注意： 结肠缓冲液的温度至关重要，以确保终止胶原酶活性。
2. 在 4 °C 条件下以 800 x 转速离心 g 5 分钟。
3. 通过真空抽滤弃去上清液。
4. 用25 mL新鲜预冷的结肠缓冲液重悬洗涤, 4 °C、800 x g 条件下离心 g 5 分钟。
5. 通过真空抽吸弃去上清液。
6. 将胶原酶消化1（第7步）中重悬的沉淀物与其对应第11.4步的试管合并。
7. 重复步骤 11.4（洗涤和离心）。

12. 基于二氧化硅的密度分离介质梯度分离

注意：请尽快完成步骤 12 至 18，以确保快速终止胶原酶活性。

1. 在完成步骤11.7后，每根结肠样本的沉淀物用24 mL的44%二氧化硅密度分离介质重悬，总体积为24 mL。
2. 使用10 mL血清移液管，将步骤12.1中制备的介质缓慢地分层加入步骤5.2准备好的三根试管（内含66%二氧化硅密度分离介质）中，每管8 mL。分层过程中应保持44%密度分离介质稳定且缓慢的流速，以避免破坏界面。
3. 使用天平或平衡装置，仔细平衡所有离心管在离心桶中的重量。
4. 将离心管在20 °C下以859 × g离心20分钟，离心机不启用刹车功能。离心结束后需等待转子完全停止后再取出离心管，注意避免扰动梯度界面处的细胞。

13. 从密度梯度界面收集单个核细胞

1. 观察梯度界面（靠近5 mL刻度处），通常可见一条1-2 mm厚的白色条带（含有单个核细胞，MNC）。
   注意：可能观察到或未观察到白色条带。然而，单个核细胞位于此界面处，通常会使梯度界面变得浑浊，降低其透明度。
2. 使用真空抽吸法吸除并弃去上层梯度液顶部7 mL，以便更方便地用移液器接触界面层。
3. 通过持续的手动吸力并配合稳定旋转手腕的动作，将界面层的细胞收集至一个洁净的50 mL聚丙烯圆锥形离心管中。收集至两层梯度之间的界面清晰且具有折光性（无细胞残留）为止。
4. 用50 mL预冷的FACS缓冲液填充收集管，在4 °C条件下以800 × g 离心5分钟。
5. 通过真空抽吸去除上清液，并将沉淀物重悬于1 mL FACS缓冲液中。
6. 使用适当的死细胞排除方法，按1:2稀释比例在血细胞计数板上进行细胞计数。
7. 对接收的新鲜分离的结肠单个核细胞进行FACS染色或其他检测。

结果

在使用小鼠结肠疾病模型时，能够对结肠中单个核细胞（MNC）内参与炎症过程的多种免疫细胞亚群进行定量和定性评估具有重要意义。通过本方案获得的MNC单细胞悬液，可稳健且可重复地实现此类表型特征分析。为验证该分离方法在不同实验条件下的适用性，我们采用此方法获取了结肠MNC，并对接受异基因骨髓移植后伴有（图1 和图2，异基因BMT）和无显著免疫介导结肠损伤（图2A，同基因BMT）的小鼠所分离的细胞进行了多参数流式细胞术分析。

流式细胞术及数据分析用于比较使用胶原酶E或胶原酶D进行细胞分离时，凋亡和坏死淋巴细胞亚群的比例，同时考察是否联合DNase 1处理的影响。流式细胞术所用的设门策...

讨论

本可视化实验方案描述了耐受性良好的结肠单个核细胞（包括固有层淋巴细胞，LPL）分离方法。由于该方案在评估移植后小鼠严重结肠炎模型中进行了优化，此类模型存在大量炎症性细胞因子和组织损伤，导致所获得的单个核细胞（MNC）存活率较低，因此我们预计这些方法可推广应用于其他需要对结肠MNC进行表型分析的研究场景。这些应用包括但不限于：在炎症性肠病小鼠模型中评估结肠炎症、研究靶向结肠炎治疗的免疫应答，以及由感染性病原体引发的结肠炎研究。此外，我们对健康小鼠（同基因型骨髓移植小鼠）进行细胞分离的数据表明，该分离流程无需明显的炎症浸润即可实现MNC分离物中免疫细胞的检测。事实上，在未经处理的健康小鼠（非骨髓移植小鼠）中也获得了类似结果（数据未显示）。

本方案中有几个关键步骤与其他已发表的方法不同，这些步骤有助于实现高产量和高细胞活性。例如，优化来源于Clostridium histolyticum的胶原酶E活性（最终活性水平为100 U/mL），可在长期实验中对不同批次的酶进行一致的计算²⁶。胶原蛋白家族共有28种不同成员， collectively 构成了...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 mm 培养皿	Thermo Scientific	150288
1x PBS	Corning	21-040-CV
10x PBS	Lonza BioWhittaker	BW17-517Q
10 mL 一次性血清移液管	Corning	4100
10 mL 注射器	Becton Dickinson	302995
15 mL 非无菌锥形管	TruLine	TR2002
18 G 钝头针	Becton Dickinson	305180
25 mL 一次性血清移液管	Corning	4250
40 μm 孔径细胞筛	Corning	352340
50 mL Falcon 管	Corning	21008-951
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A4503-1KG
固定缓冲液	Biolegend	420801
E. coli 来自溶组织梭菌的胶原酶 E	Sigma	C2139
EDTA，0.5 M 无菌溶液	Amresco	E177-500ML
胎牛血清	Thermo /Fisher Scientific -HyCLone	SV30014.03
HEPES	GE Healthcare-HyClone	SH30237.01
Percoll	GE Healthcare-Life Sciences	1708901
RPMI 培养基	Corning	17-105-CV
叠氮化钠	VWR Life Science Amresco	97064-646
台盼蓝	Lonza BioWhittaker	17-942E