本实验方案的目的是通过胶原酶对组织进行酶消化，分离结肠固有层中定居的单个核细胞。该方案可高效地分离单个核细胞，获得单细胞悬液，进而可用于可靠的免疫表型分析。
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本文内容
摘要
摘要
肠道是体内免疫细胞数量最多的器官。小肠和大肠的免疫系统负责监控外源性抗原的暴露，并调节对强效微生物来源免疫刺激物的反应。因此，肠道在多种疾病中成为免疫失调和炎症的主要靶器官，这些疾病包括但不限于克罗恩病和溃疡性结肠炎等炎症性肠病、骨髓移植（BMT）后移植物抗宿主病（GVHD），以及多种过敏性和感染性疾病。小鼠胃肠道炎症和结肠炎模型被广泛用于研究胃肠道并发症，并在临床前阶段优化预防和治疗策略。通过从肠道中分离并进行免疫细胞表型分析，从这些模型中获得的数据对于深入理解免疫机制至关重要，可进一步应用于改善胃肠道及全身性炎症性疾病。本报告描述了一种高效分离结肠单个核细胞（MNC）的实验方案，该方法采用混合硅基密度梯度界面法。该方法可稳定地分离出大量活的白细胞，同时最大限度减少杂质碎片的污染，从而为后续通过流式细胞术或其他方法进行免疫表型分析提供良好基础。
引言
尽管胃肠道（GI）道主要负责食物中营养物质的消化和重吸收，但其黏膜及黏膜下免疫系统还在维持血管、淋巴和神经系统以及多种其他器官的完整性方面发挥着核心作用1。由于胃肠道免疫系统持续暴露于食物来源的异源抗原、共生细菌或入侵性病原体，因此在胃肠道健康和全身健康中均具有重要影响1,2。因此，胃肠道免疫系统必须维持一种精细的平衡：既要对非致病性抗原产生耐受，又要对致病性抗原作出适当反应1,2。当这种耐受与防御之间的平衡被打破时，可能引发局部或全身性的免疫失调和炎症反应，导致多种疾病的发生1,2,3。
肠道容纳了体内至少70%的淋巴细胞4。大多数初级免疫反应均涉及肠道中的三个免疫站点之一：1）派尔集合淋巴结（Peyer’s Patches），2）上皮内淋巴细胞（Intraepithelial lymphocytes, IEL）以及3）固有层淋巴细胞（lamina propria....
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方案
所有研究均在经迈阿密大学米勒医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准的啮齿类动物研究方案下进行，该委员会符合美国实验动物科学协会（AALAS）制定的兽医标准。
1. 溶液的配制
- 如表1所述，配制结肠缓冲液、100%二氧化硅密度分离介质、66%二氧化硅密度分离介质、44%二氧化硅密度分离介质、胶原酶E消化缓冲液和FACS缓冲液。
- 在实验前一天配制结肠缓冲液，并于4 °C过夜保存。
- 在实验前一天配制100%二氧化硅密度分离介质，并于4 °C过夜保存；实验当天早晨将其置于室温下解冻。
- 在细胞分离当天早晨，使用室温的100%二氧化硅密度分离介质和结肠缓冲液配制66%和44%二氧化硅密度分离介质。
- 称取适量来源于Clostridium histolyticum的胶原酶E，并在实验前夜于-20 °C保存。次日早晨，将其溶解于适当体积的结肠缓冲液中，制成胶原酶消化缓冲液。实验当天所有使用胶原酶消化缓冲液的孵育步骤，均需预先将溶液在37 °C预热。
- 在整个实验流程中，设置一台离心机参数为20 °C、转速859 x g，并关闭刹车（减速度为0），用于梯度离心；另设一台离心机参数为4 °C、转速859 x g，采用标准减速度，用于洗涤步....
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结果
在使用小鼠结肠疾病模型时，能够对结肠中单个核细胞（MNC）内多种参与炎症过程的免疫细胞亚群进行定量和定性评估具有重要意义。通过本方案获得的单细胞悬液可对MNC进行稳定且可重复的表型分析。为验证该分离方法在不同实验条件下的适用性，我们采用此方法获取了结肠MNC，并对经骨髓移植（BMT）后存在（图1 和图2，异基因BMT）或不存在（图2A，同基因BMT）显著免疫介导结肠损伤的小鼠分离细胞进行了多参数流式细胞术分析。
流式细胞术及数据分析用于比较使用胶原酶E或胶原酶D进行细胞分离时，联合或不联合DNase 1处理条件下凋亡与坏死淋巴细胞亚群的比例。流式细胞术中所用的设门策略见下文 .......
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讨论
本可视化实验方案描述了耐受性良好的结肠单个核细胞（包括固有层淋巴细胞，LPL）分离方法。由于该方案在评估移植后小鼠严重结肠炎模型中进行了优化，此类模型存在大量炎症性细胞因子和组织损伤，导致所获得的单个核细胞（MNC）存活率较低，因此我们预计这些方法可推广应用于其他需要对结肠MNC进行表型分析的研究场景。这些应用包括但不限于：在炎症性肠病小鼠模型中评估结肠炎症、研究靶向结肠炎治疗的免疫应答，以及由感染性病原体引发的结肠炎研究。此外，我们对健康小鼠（同基因型骨髓移植小鼠）进行细胞分离的数据表明，该分离流程无需明显的炎症浸润即可实现MNC分离物中免疫细胞的检测。事实上，在未经处理的健康小鼠（非骨髓移植小鼠）中也获得了类似结果（数据未显示）。
本方案中有几个关键步骤与其他已发表的方法不同，这些步骤有助于实现高产量和高细胞活性。例如，优化来源于Clostridium histolyticum的胶原酶E活性（最终活性水平为100 U/mL），可在长期实验中对不同批次的酶进行一致的计算26。胶原蛋白家族共有28种不同成员， collectively 构成了.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究得到了资助项目 #1K08HL088260 和 #1R01HL133462-01A1（NHLBI）（A.B.P.、H.N.、S.J.）以及儿科研究Batchelor基金会（D.M.、H.N.、S.J.、A.A.H.、A.B.P.）的支持。本研究中使用的C57BL/6和BALB/c小鼠由本机构繁育，或由Jackson Labs和Taconic提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 60 mm 培养皿 | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL 一次性血清移液管 | Corning | 4100 | |
| 10 mL 注射器 | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15 mL 非无菌锥形管 | TruLine | TR2002 | |
| 18 G 钝头针 | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL 一次性血清移液管 | Corning | 4250 | |
| 40 μm 孔径细胞筛 | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon 管 | Corning | 21008-951 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A4503-1KG | |
| 固定缓冲液 | Biolegend | 420801 | |
| E. coli 来自溶组织梭菌的胶原酶 E | Sigma | C2139 | |
| EDTA，0.5 M 无菌溶液 | Amresco | E177-500ML | |
| 胎牛血清 | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI 培养基 | Corning | 17-105-CV | |
| 叠氮化钠 | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| 台盼蓝 | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
参考文献
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation<....
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重印与许可
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