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小鼠动脉粥样硬化的定量分析

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DOI：

10.3791/59828

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2019年6月12日

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Medicine Unit, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute for Molecular Medicine, University of Southern Denmark (SDU)

本文内容

摘要

动脉粥样硬化的小鼠模型是研究分子水平致病通路的有用工具，但需要对病变发展进行标准化定量。本方案描述了一种优化的方法，用于测定主要动脉血管（包括主动脉根部、主动脉弓和头臂动脉）中的病变大小。

摘要

心血管疾病是全球最主要的死亡原因。大多数病例的根本病因是动脉粥样硬化，而动脉粥样硬化在一定程度上是一种慢性炎症性疾病。实验性动脉粥样硬化研究已阐明了胆固醇和炎症在疾病进程中的作用，这推动了多项成功的临床试验，使用药物干预手段减轻动脉粥样硬化的临床表现。对疾病小鼠模型进行严谨且受控良好的实验，有助于进一步阐明尚未完全理解的疾病发病机制。标准化的病变分析对于减少实验变异性和提高可重复性至关重要。检测主动脉根部、主动脉弓和无名动脉（头臂动脉）的病变大小，是动脉粥样硬化实验研究中常见的终点指标。本方案提供了一种在同一小鼠中对上述所有部位动脉粥样硬化病变进行评估的技术操作描述。当实验材料有限时（例如在鉴定基因修饰动物模型时常遇到的情况），该方案尤为实用。

引言

心血管疾病是全球最主要的死亡原因，其中缺血性心脏病和中风占每四例死亡中的一个1。大多数病例由动脉粥样硬化引起，该疾病以脂质沉积斑块在大中型动脉中缓慢积聚为特征，并伴有慢性炎症迹象2。该疾病通常在数十年内无明显症状，直到斑块破裂或侵蚀引发动脉血栓，导致缺血性组织损伤。

正常的动脉由三层结构组成：内膜层含有内皮细胞和稀疏分布的平滑肌细胞，中膜层含有平滑肌细胞和弹性板层，外膜层则由疏松结缔组织包裹3。低密度脂蛋白（LDL）在内膜层的滞留会促进动脉粥样硬化的发生4。脂蛋白的积聚和修饰导致其在动脉内膜中聚集并被滞留5。滞留且被修饰的脂蛋白引发炎症反应6。在血流紊乱的动脉分支部位，内皮细胞开始表达黏附分子（如VCAM-1），从而招募循环中的单核细胞及其他白细胞7。浸润的单核细胞分化为巨噬细胞，吞噬脂质后转变为巨噬细胞泡沫细胞8。

自20世纪80年代中期以来，动脉粥样硬化在小鼠模型中的研究日益频繁。C57BL/6是这些研究中最常用的近交系小鼠品系，也是大多数基因修饰小鼠品系的遗传背景9。该品系建立于20世纪20年代10，其基因组于2002年发表11。小鼠模型实验具有多项优势：种群繁殖速度快、饲养空间利用率高，且近交可减少实验变异性。该模型还允许进行遗传操作，例如靶向基因敲除和外源基因插入。这些技术已推动了对疾病病理生理机制的新认识，并发现了新的治疗靶点12。

野生型 C57BL/6 小鼠天然对动脉粥样硬化具有抗性。它们循环中的胆固醇主要存在于高密度脂蛋白（HDL）中，即使饲喂高脂高胆固醇饮食，也不会形成复杂的动脉粥样硬化病变13。因此，载脂蛋白 E 基因敲除（Apoe-/-）且背景为 C57BL/6 的高胆固醇血症小鼠被用作动脉粥样硬化的实验模型14,15。ApoE 的缺失会损害肝脏对残余脂蛋白的摄取，严重扰乱脂质代谢。在 Apoe-/- 小鼠中，循环胆固醇主要存在于极低密度脂蛋白（VLDL）颗粒中，且这些小鼠在普通饲料饮食下即可形成复杂的动脉粥样硬化斑块。

Ldlr-/- 小鼠可模拟家族性高胆固醇血症患者中观察到的动脉粥样硬化发展过程16。Ldlr-/- 小鼠需要喂食西方型饮食才能发展出动脉粥样硬化17。西方型饮食模拟人类的食物摄入，通常含有 0.15% 的胆固醇。低密度脂蛋白（LDL）受体可识别载脂蛋白 ApoB100 和 ApoE，并通过内吞作用介导 LDL 颗粒的摄取。LDL 受体对于肝脏从循环中清除 LDL 至关重要，而造血细胞中的 LDL 受体表达则不影响该过程。这为将 Ldlr+/+ 细胞移植至高胆固醇血症的 Ldlr-/- 受体小鼠体内，并评估动脉粥样硬化的发展提供了可能。骨髓嵌合体常被用于研究造血细胞在实验性动脉粥样硬化中的作用。然而，骨髓移植可能影响动脉粥样硬化斑块的大小和组成，从而使结果的解释变得不明确。

已开发出携带额外遗传修饰的多种 Apoe-/- 和 Ldlr-/- 小鼠变体，用于研究疾病的特定过程18。其中一个例子是人源 APOB100转基因 Ldlr-/-（HuBL）小鼠，其携带全长的人APOB100基因19,20。这类小鼠在普通饲料饮食条件下即可发展为高胆固醇血症和动脉粥样硬化。然而，复杂动脉粥样硬化斑块的形成至少需要六个月，因此较短的实验方案通常采用西方饮食21。其血浆胆固醇的大部分存在于低密度脂蛋白（LDL）颗粒中，这使得HuBL小鼠的脂蛋白谱比Apoe-/-和Ldlr-/-小鼠更接近人类的致动脉粥样硬化性脂质异常特征。HuBL小鼠还允许将人载脂蛋白B（apoB）作为自身抗原进行相关研究22。

动脉粥样硬化的小鼠模型可形成具有人类疾病共同特征的复杂动脉粥样硬化斑块。然而，这些斑块对破裂及其引发的心肌梗死具有较强的抵抗性。动脉粥样硬化性血栓形成仅偶有检出，且在实验上难以评估23,24,25。尽管已开发出一些特殊的斑块破裂模型，但该实验领域仍缺乏一种可靠且可重复的用于评估斑块稳定剂的模型。

动脉粥样硬化的定量方法在文献中有多种报道。近年来的研究工作试图对动物实验的设计、实施和报告进行标准化26。研究人员根据各自实验室的条件采用不同的偏好和技术。大多数研究项目在某种程度上具有独特性，需要对实验方案进行一定的修改。由于该疾病的多因素特性，不同项目之间的最佳对照各不相同。局部条件差异以及缺乏标准化可能导致疾病发展过程中观察到的差异，从而阻碍该研究领域的进展。实验变异性差异也意味着统计效能的计算需要基于在本地条件下进行的预实验研究。

建议在血管树的多个部位进行动脉粥样硬化程度的定量分析。本方案描述了如何在单只小鼠中同时获取主动脉根部、主动脉弓和无名动脉的检测结果，并保留其余胸腹主动脉用于其他分析。采用血管内面展平制备法可快速定量主动脉弓中富含脂质的斑块。若标本展示得当，也可对无名动脉中的病变负荷进行定量分析。而耗时较长的主动脉根部横切面切片则可提供多个切片，用于对斑块成分进行详细评估。

方案

所有动物实验均需获得伦理机构的批准。

1. 小鼠处死与主动脉显微解剖

  1. 通过 CO 处死小鼠2 窒息并记录体重。
  2. 用70%乙醇喷洒小鼠以避免毛发污染样本。将小鼠置于仰卧位。从胸骨上切迹开始，使用梅奥剪沿中线切开，切口几乎延伸至耻骨联合。
    警告： 高浓度乙醇易燃，可能引起严重眼刺激。请采取预防措施。
  3. 使用23 G针头经胸壁进行心脏穿刺以放血处死小鼠。该操作通常可获得 750 µL 从20周龄小鼠采集血液。通常将一半血量收集至三钾EDTA抗凝管中，另一半收集至血清管或锂肝素抗凝管中。轻轻翻转混匀各管，并于室温下保存，待进一步处理。
  4. 使用梅奥剪刀沿中线剪开壁层腹膜以打开腹腔。用组织镊夹住剑突，并在两侧向外侧剪开腹膜，继续切开膈肌。
    1. 使用梅奥剪刀尽可能从侧方剪开肋骨，以打开胸腔。这将在后续解剖主动脉时为手术器械提供足够的操作角度。
  5. 在右心耳处做一切口以供灌注液流出。将27 G针头从心尖部位插入，并朝向头侧方向推进。保持针头固定于左心室，缓慢灌注10 mL冰冻磷酸盐缓冲液（PBS），持续至少2分钟。观察肝脏颜色变化，逐渐变浅。
    注意： 某些方案采用多聚甲醛灌注，但这会干扰多种后续应用，例如淋巴细胞的免疫组织化学分析。因此，本方案中不进行多聚甲醛灌注固定。
  6. 使用解剖镊和解剖剪分离目标器官（如淋巴结、脾脏、肝脏、肠道、腹股沟脂肪垫、肾脏等）。
  7. 在心脏右侧切断气管和食管，注意勿损伤主动脉弓。切断膈肌及连接内脏与后腹膜的结构，保留心脏、主动脉和肾脏原位。将肺脏和内脏向尾侧折叠并用纱布覆盖，以开始腹主动脉旁淋巴结和腹主动脉的后腹膜显微解剖。
  8. 在体视显微镜下以6倍放大倍数开始显微解剖。用Dumont镊子提起主动脉分叉周围的组织，并在张力下用Vannas剪刀进行剪切，开始解剖主动脉分叉。
    1. 继续向头侧解剖腹主动脉。切断主动脉的腹部分支，并通过膈肌上的主动脉裂孔游离主动脉近端。
      注意： 显微解剖需要通过体视显微镜实现精确的手眼协调，这需要经过一定练习才能掌握。
  9. 去除覆盖胸主动脉的脂肪组织。仔细在胸腺背侧进行分离，游离主动脉弓及其分支。尽可能向远端解剖胸腔内的颈动脉。在特殊情况下，可进行颈部解剖以包括颈动脉分叉部分。
  10. 用去离子水、RNase 去污染溶液、70% 乙醇和 PBS 依次冲洗器械，以在切割主动脉前进行清洁。用镊子夹住心尖部位将心脏提起。在靠近心脏的位置剪断主动脉，并将整个心脏放入含有 PBS 的离心管中。在继续处理及冷冻包埋主动脉根部之前，心脏可在冰上保存数小时。
  11. 根据主动脉弓进行切割 图1A将主动脉弓放入含有1 mL 4%甲醛的离心管中，4℃过夜固定 4 °C标本可采用此方法保存数年，之后再进行针插和分析。
    警告： 甲醛可能致癌，引起过敏性皮肤反应，吞食后有害。应按要求使用个人防护装备。
  12. 解剖剩余的降主动脉，并将其置于RNA稳定溶液中或进行速冻，以用于后续的RNA分析或其他应用。优化工作流程以尽量减少解剖时间，对于避免RNA过度降解至关重要。
  13. 将血液采集管（步骤1.3中收集的）放入离心机。以1,500 x g离心分离血浆和血清管 g 室温下静置15分钟。小心将血浆和血清转移至微量离心管中，于-80℃保存。80 °C同时收集EDTA和肝素抗凝的血浆或血清，可为多种下游应用提供可能。
  14. 将心脏置于软木板上，腹面朝上。用针穿过心尖将心脏固定在软木板上。用解剖镊夹住心脏基部。
    1. 使用手术刀沿左右心耳之间的连线方向切除心脏顶端的2/3部分，手术刀应保持一定倾斜角度 20° 矢状面中向尾侧 20° 横断面中向颅侧图1B).
  15. 将主动脉根部包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，包埋剂应包裹组织但不渗入组织内部。将心脏基底部浸入OCT包埋剂中，用镊子轻轻挤压心脏，使OCT填充主动脉根部并排出任何气泡。
  16. 将样本转移至装有OCT的冷冻模具底部，确保主动脉根部与模具底部表面垂直。将包埋好的心脏置于干冰上冷冻。将样本储存于密封袋中，保存在-80 °C 直至按照本方案第3节进行冷冻切片。

显示解剖状态下主动脉根部、耳廓和主要动脉的心脏解剖图和照片。
图 1：原位心脏与主动脉弓。 （A）去除肺、气管、食管和胸腺后，在显微图像中显示一只20周龄雌性Apoe-/-小鼠在普通饮食条件下的原位主动脉弓，比例尺 = 2 mm。虚线指示切割主动脉弓及其分支的位置。（B）心脏与主动脉的示意图。红色虚线表示在冷冻包埋主动脉根部前切割心脏的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 主动脉弓和无名动脉的 en face 分析

  1. 准备用于主动脉弓正面分析的固定垫。将一段石蜡膜折叠八次，制成一个25 mm × 25 mm的平整表面。用黑色电工绝缘胶带包裹，为主动脉提供深色背景。在固定垫背面贴上标签，并使用铅笔写上小鼠编号（普通墨水笔的字迹会在染色过程中消失）。
  2. 将主动脉弓转移至固定垫上，并在其上方滴加一滴PBS。在体视显微镜下开始清除残留的外膜周围脂肪组织。
    1. 使用Vannas剪刀和Dumont镊子轻轻剥离所有周围的脂肪组织，避免操作或损伤主动脉。苏丹IV可使脂肪组织明显着色，因此在此步骤中彻底清除所有脂肪组织至关重要。
      注意：始终确保主动脉保持湿润，必要时可补充PBS。
  3. 通过将Vannas剪刀插入主动脉腔内在冠状面切开主动脉，以暴露内膜表面。从升主动脉弓的外弯处远端开始切开，并继续切开包括无名动脉在内的分支。保留降主动脉胸段的背侧部分。
    1. 切开内弯处，并将主动脉展开以显示内膜表面。
      注意：此步骤需要精细的操作技能，需经过一定练习才能掌握。
  4. 使用微型昆虫针的钝端将展开的主动脉弓固定在固定垫上。使用微型Castroviejo持针器放置固定针。针插入后轻轻向外弯曲，避免接触标本。将主动脉平整地固定在垫上，切勿拉伸标本。将固定好的主动脉弓朝下存放于盛有PBS的培养皿中，4 °C保存。
    注意：本方案可在此处暂停。
  5. 配制苏丹IV工作液。取1 g苏丹IV粉末、100 mL 70%乙醇和100 mL丙酮，混匀于棕色瓶中，轻轻搅拌10分钟。溶液无需过滤，若避光室温保存，可使用数月。若染色效果不理想，可重新配制溶液并再次染色。
    注意：丙酮为易燃液体，可能引起严重眼刺激。应储存于通风良好处，操作时采取预防措施。
  6. 在实验台上准备五个培养皿：一个盛有70%乙醇，一个盛有苏丹IV工作液，两个盛有80%乙醇，一个盛有PBS。
    1. 将固定垫放入第一个盛有70%乙醇的培养皿中（主动脉弓朝下），冲洗标本5分钟。随后将标本转移至苏丹IV工作液中，染色7分钟。
    2. 接着用80%乙醇漂洗两次，每次3分钟，以脱去正常内膜表面的染色。脱色时间可根据需要调整以优化结果。最后用PBS漂洗，然后将标本放回原始培养皿中。
  7. 使用连接数字相机的体视显微镜（10倍放大）拍摄显微图像。将标本浸没于PBS中拍照时，使用小金属重物（20 mm × 10 mm × 5 mm）将固定垫压在培养皿底部。在主动脉旁放置标尺，用于图像校准。
  8. 使用图像分析软件（例如ImageJ）测定病变面积和总内膜表面积。由于缺乏明确的解剖标志来界定主动脉弓，通常从升主动脉起始处测量至第一对肋间动脉分支处（图2A）。使用软件中的面积定量功能，手动圈选整个主动脉弓内膜区域。
    注意：    病变定量应采用盲法进行，建议由第二位研究者复核结果。
    1. 在ImageJ中选择多边形选区工具，通过连续点击圈选整个主动脉弓区域。然后在“分析”菜单中选择“测量”，结果窗口将显示总主动脉弓面积。
    2. 接着，选择自由手绘选区工具，按住Alt键圈选主动脉弓内所有苏丹IV染色的斑块。在“分析”菜单中点击“测量”，结果窗口将显示无病变的主动脉弓面积。
    3. 通过从总主动脉弓面积中减去无病变面积，再除以总主动脉弓面积，计算相对病变面积。
  9. 小心地将锁骨下动脉和颈动脉展开固定，以便对无名动脉内的病变进行定量分析（图2A）。锁骨下动脉和颈总动脉内的病变定量通常非常困难，且无明确意义。
    1. 在ImageJ中按住Shift键，使用多边形选区工具圈选无名动脉的两部分。在“分析”菜单中点击“测量”，结果窗口将显示无名动脉总面积。
    2. 接着选择自由手绘选区工具，按住Alt键圈选无名动脉内的所有斑块。在“分析”菜单中点击“测量”，结果窗口将显示无病变的无名动脉面积。
    3. 通过从无名动脉总面积中减去无病变面积，再除以无名动脉总面积，计算相对病变面积。

血管血流实验；微流控系统，切片图像，组织模式分析。
图 2：动脉粥样硬化病变的定量分析。（A）一只20周龄雄性人源APOB100转基因Ldlr-/-（HuBL）小鼠，经西方饮食喂养十周后，取其主动脉弓，展开固定，并用苏丹IV染色以显示富含脂质的斑块。显微图像中白色虚线标出了整个主动脉弓的表面积，比例尺 = 2 mm。黄色虚线标出了无名动脉的总表面积。（B）一只20周龄雄性Ldlr-/-小鼠，经西方饮食喂养八周后，取其主动脉根部在主动脉窦上方400 µm处的横截面，显微图像显示结果，比例尺 = 500 µm。黑色虚线标出了整个血管区域，油红O染色显示定位于动脉内膜的动脉粥样硬化病变区域。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 主动脉根部的冷冻切片

  1. 将冷冻切片机温度设置为 -20 °C 以及切片厚度至 10 µm将含有主动脉根部的OCT包埋块安装在样本架上，使心室组织朝外。开始切片时，微调切面方向，使其与样本架平行。
  2. 去除多余的包埋剂OCT，以便更轻松地收集切片并避免褶皱。由于心脏基底部已在模具中正确放置，此时主动脉根部应垂直于刀片。
  3. 收集初始的对照切片至普通载玻片上，这些切片将被弃用。首个切片应仅包含心肌组织。继续推进切片过程 200 µm 此时，收集切片并用光学显微镜检查进展。
  4. 当接近左心室流出道时，需逐一检查 100 µm 在显微镜下观察。当首次观察到血管壁的迹象时，应放慢操作速度 50 µm.
    注意： 当首个主动脉瓣尖出现时，即为切片收集的零点。准确判断瓣尖出现的位置可能较为困难，但精确定位对于同一区域病变的比较至关重要。
  5. 将标本向零点牙尖倾斜，以使切面与另外两个牙尖对齐。这对于获得主动脉的真实横截面至关重要。绘制主动脉根部示意图，标出所见的各个牙尖，并逐一计数 10 µm 从零点开始切割的部分
    1. 当第二个牙尖出现时，再次将样本轻轻倾斜，使其远离该牙尖，以便使样本与第三个牙尖对齐。牙尖之间的高度差不应超过 50 µm从该层面开始在载玻片上收集切片 90 µm 及以后。
    2. 根据载玻片规划收集切片 图3可从以下开始收集切片 190 µm 如果主动脉根部直径超过 50 µm 倾斜，以留出更多空间使根部保持笔直对齐。继续切片直至达到相应水平面 800 µm 从零点开始。如果在此水平仍可见斑块，可扩大采集范围 1,000 µm.
      注意： 一种简化的载玻片整理方法被展示于 补充图1，这可能会提高切片速度。最佳的切片方案应根据具体的研究计划来确定。
  6. 采集后立即固定组织样本。
    1. 用4%甲醛固定用于油红O染色和胶原蛋白天狼星红染色的切片10分钟。用去离子水冲洗，干燥后室温保存，待后续进行本方案的第4步。若载玻片需立即进行油红O染色且仍处于湿润状态，可将其置于60%异丙醇中1分钟，以加速干燥过程。
      警告： 异丙醇是一种易燃液体，可引起严重眼刺激，并可能引起嗜睡或头晕。应储存于通风良好的场所，操作时采取预防措施。
    2. 将用于免疫组织化学或免疫荧光的切片置于冰冻纯丙酮中固定 10 分钟，室温下干燥 30 分钟。将切片保存于 -20 °C.

油红O、天狼猩红、免疫组织化学切片；甲醛、丙酮固定的示意图。
图3：主动脉根部连续切片的切片排布方案。 在对主动脉根部进行冷冻切片时，应收集升主动脉前800 µm范围内每间隔10 µm的切片。为满足不同实验应用的需求，需系统性地安排切片的排布。病变成分分析通常包括使用油红O染色检测脂质，以及使用天狼猩红染色检测胶原。其余切片则收集后用丙酮固定，用于免疫组织化学和免疫荧光染色。本图经Gisterå等30修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 主动脉根部动脉粥样硬化病变的油红O染色与定量分析

  1. 通过将1 g油红O溶解于100 mL异丙醇中，制备饱和油红O溶液。将溶液置于避光瓶中，在室温下搅拌1小时。饱和溶液可保存数月。
    注意：建议为油红O染色配备专用实验器材，因为接触过该溶液的器材难以彻底清洗。
  2. 取75 mL饱和油红O溶液与50 mL去离子水混合，配制工作液。室温静置10分钟，再通过定性滤纸过滤。
  3. 将载玻片浸入油红O工作液中染色20分钟，随后用自来水冲洗5分钟。
  4. 为便于组织观察，使用Mayer苏木精染色1分钟，再用温自来水冲洗5分钟。此时所有细胞核应呈蓝色，可根据实际情况调整染色时间以优化结果。
  5. 使用水溶性封片介质（例如Kaiser甘油明胶）封片。使用前将Kaiser甘油明胶加热至40 °C使其呈流动状态。由于封片介质为水基，无需预先干燥载玻片。加盖盖玻片时需小心，避免产生气泡。
    注意：Kaiser甘油明胶含有苯酚，可能引起遗传缺陷。请按要求佩戴个人防护装备。
  6. 使用连接于光学显微镜的相机采集数字显微图像。通常在50倍放大倍数下可清晰观察到整个血管壁及病变边界。保存高分辨率图像，建议采用TIFF（标记图像文件格式）。
  7. 使用计算机辅助图像分析软件系统进行病变面积分析。油红O是一种溶脂性偶氮染料，可特异性染色中性脂质，使动脉粥样硬化斑块呈现鲜明的红色，有助于病变的定量分析。
    注意：    病变定量应采用盲法分析，建议由第二位研究者复核所得结果。
    1. 在图像分析软件中使用面积定量功能，通过圈选主动脉血管壁的外弹力板边界来定义总血管面积（图2B）。在ImageJ中，选择多边形选区工具，通过连续点击圈定区域，然后在“分析”菜单中选择“测量”，总血管面积将显示在结果窗口中。
    2. 继续定量血管内膜层中的动脉粥样硬化病变，该区域由内弹力板和管腔边界界定。通常瓣膜小叶上的病变不纳入测量范围27。在ImageJ中，按住Alt键并使用自由手绘选区工具圈选所有斑块，然后在“分析”菜单中选择“测量”，病变未累及的血管面积将显示在结果窗口中。
    3. 通过从总血管面积中减去无病变区域面积，再将差值除以总血管面积，计算相对病变面积。
      注意：应根据所用放大倍数在图像分析软件中校准结果，以获得以平方微米（µm²）为单位的绝对病变面积。
  8. 在图像分析软件中使用颜色阈值功能，定义病变中油红O染色阳性区域，计算油红O阳性区域占总病变面积的百分比。
    1. 在ImageJ中，按住Shift键使用自由手绘选区工具圈选全部病变区域。在“分析”菜单中选择“测量”，总病变面积将显示在结果窗口中。
    2. 在“编辑”菜单中选择“清除外部区域”。在“图像”菜单中将图像类型转换为8位。
    3. 在“图像”菜单的“调整”子菜单中选择“阈值”，设定红色阈值以标记油红O阴性区域，点击“应用”。在“处理”菜单的“二值化”子菜单中选择相应选项，将图像转换为二值图像。
      注意：油红O染色效果常因批次不同而存在差异。因此，颜色阈值分析仅建议在同一染色批次内进行。结果报告时应同时说明阈值的确定与标准化方法。
    4. 在“分析”菜单中选择“分析颗粒”，点击“确定”。油红O阴性病变的总面积将显示在摘要窗口中。通过从总病变面积中减去油红O阴性面积，再除以总病变面积，计算油红O阳性区域的相对比例。

结果

在动脉粥样硬化的小鼠模型中，最显著的病变通常发生在主动脉根部和主动脉弓。本方案描述了在同一小鼠中对主动脉根部、主动脉弓以及头臂动脉的动脉粥样硬化进行定量分析的方法。胸主动脉降支和腹主动脉中可测量的病变仅出现在疾病进展较严重的动物中。在本方案中，这些部位不用于动脉粥样硬化负荷的分析，而是保存下来用于后续的mRNA水平或其他分析。主动脉根部动脉粥样硬化病变的连续切片通常以图表形式展示，其中纵轴（y轴）表示病变大小，横轴（x轴）表示距主动脉窦的距离28。真正的横切面对于准确量化病变大小至关重要。斜切会导致病变大小被高估，仅20°的倾斜角度就可能使绝对病变表面积被高估15%29。然而，通过计算病变面积占血管总横截面积的比例，可使结果对切片过程中可能存在的角度差异不那么敏感（图4A）。通常，检测组间差异的合适统计方法为常规双因素方差分析（ANOVA）。随后进行Bonferroni事后检验，以确定特定层面的差异。Fisher最小显著性差异法也可作为ANOVA的后续检验方法，它可降低II类统计错误的发生概率，但未对多重比较进行校正。此外，计算曲线下面积或每只小鼠的平均病变大小，并将数据以点图形式呈现，有助于进一步直观展示组内个体间的变异情况（图4B）。

油红O是一种脂溶性亮红色偶氮染料，可对中性脂质进行染色，而细胞膜中的极性脂质不会被染色。油红O染色可用于新鲜、冷冻或福尔马林固定的样本，但由于石蜡包埋样本在脱蜡过程中脂质已被去除，因此不适用于此类样本。可通过计算油红O阳性区域占总病变区域的比例，对病变部位的脂质积聚进行定量分析（图4C）。苏木精可使细胞核呈现蓝色染色，有助于观察斑块形态。左右冠状动脉通常从主动脉窦起始处约250 µm的位置分出27，该区域常出现最显著的病变。该部位的横切面通常作为代表性结果展示（图4D）。

动脉粥样硬化分析图；病灶大小、根部百分比；组织学图像；Cd4-Cre 小鼠模型。
图 4：主动脉根部的动脉粥样硬化病变。 （A）将接受西方饮食喂养 8 周、28 周龄的雄性骨髓嵌合体进行评估，以确定 Smad7 缺陷型 T 细胞对动脉粥样硬化发展的影响。实验组 Ldlr-/- 嵌合体接受 Cd4-Cre+Smad7fl/fl 骨髓移植，对照组接受 Cd4-Cre+Smad7fl/+ 骨髓移植。该图显示了从主动脉窦起始位置 100–800 µm 范围内连续 8 个切面的动脉粥样硬化病灶面积定量结果，以病灶占血管总表面积的比例表示（Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/-，n=6；Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/-，n=9；双因素方差分析，Bonferroni 事后检验；图中数据表示为均值 ± 标准误，大括号表示菌株间比较的显著性水平）。（B）合并的点状图与柱状图显示主动脉根部切面的平均动脉粥样硬化病灶面积（Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/-，n=6；Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/-，n=9；Student t 检验）。（C）病灶中 Oil Red O 染色阳性区域所占比例（Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/-，n=4；Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/-，n=6；Student t 检验，ns=无显著差异）。（B–C）每个点代表一只小鼠，柱状图表示均值 ± 标准误。（D）代表性显微图像，显示距主动脉窦 300 µm 处主动脉根部中性脂质的 Oil Red O 染色（红色），放大倍数为 50 倍，比例尺 = 500 µm。*p ≤ 0.05，***p ≤ 0.001。本图经 Gisterå 等人31 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

Oil Red O 可用于整体剥离主动脉的染色，但本方案采用另一种方便的脂溶性偶氮染料——Sudan IV。Sudan IV 通过染色脂质、甘油三酯和脂蛋白，以橙红色清晰显示动脉粥样硬化斑块。在主动脉弓整体标本的代表性图像中去除深色背景，可增强视觉效果（图 5A）。通常情况下，组内病变大小呈正态分布，因此组间统计学检验可采用 Student’s t 检验。点图可同时展示每只小鼠的个体数据及均值，并用于组间比较，是一种直观展示结果的有效方式（图 5B-C）。由于血管树不同部位的组内变异通常存在差异，一般需要分别进行功效分析。通过熟练掌握实验技术并标准化操作流程，可避免不必要的变异。获得具有统计学意义的结果固然重要，但同时也必须考虑所观察差异的生物学意义。

HuBL 与 BT1xHuBL 动脉病变的比较；病变百分比的柱状图。
图 5：主动脉弓和头臂动脉中的动脉粥样硬化病变。（A）来自喂食西方饮食十周、20 周龄小鼠的主动脉弓代表性俯视显微图像，脂质沉积斑块经苏丹 IV 染色（呈橙色），整体显示。比例尺 = 2 mm。以人源APOB100 转基因Ldlr-/-（HuBL）小鼠作为对照组，实验组为携带针对 LDL 的反应性 T 细胞的 TCR 转基因小鼠（BT1）与HuBL小鼠杂交所得后代。（B）主动脉弓中的动脉粥样硬化病变（HuBL n = 10，BT1xHuBL n = 12；Student’s t-检验）。（C）头臂动脉中的动脉粥样硬化病变（HuBL n = 8，BT1xHuBL n = 9；Student’s t-检验）。（B–C）每个点代表一只小鼠，条形图显示均值 ± 标准误（SEM）。*p ≤ 0.05。该图改编自 Gisterå 等人32。请点击此处查看此图的放大版本。

补充图1：主动脉根部连续切片的替代性载玻片排列方式。 一种简化的系统性载玻片排列方法，用于收集主动脉根部的切片。该收集方案适用于脂质的油红O染色以及免疫组织化学或免疫荧光染色。未设置专门用于胶原蛋白染色的天狼星红染色载玻片。请点击此处下载该文件。

讨论

心血管疾病是全球主要的致死原因，亟需新的预防措施2。该疾病的鼠类模型为研究其病理生理机制和实验性治疗提供了全面的平台13。可靠的病变面积定量分析对于这一研究方法至关重要。然而，不同实验室之间的定量方法存在差异。自20世纪80年代以来，标准化和优化工作一直在持续进行13,27,33,34。主动脉根部已成为量化实验性动脉粥样硬化最常用的部位。通过斑块的横切面可实现不同组间斑块体积的比较。对于主动脉较大节段的病变定量，则更倾向于采用展平（en face）制备法。展平法能够直观显示斑块数量，并实现对斑块面积覆盖率的定量分析，但无法反映斑块厚度。在血管树的不同部位获得一致的结果，有助于证实所观察到差异的生物学意义。在不同部位评估动脉粥样硬化的发展情况，可揭示可能存在的部位特异性效应。移植造血细胞对动脉粥样硬化发展的影响可在高胆固醇血症的Ldlr-/-嵌合体小鼠中进行评估。然而，全身照射会影响动脉粥样硬化进程，并表现出部位特异性效应：主动脉根部的动脉粥样硬化病变更为显著，而在主动脉弓处则观察到病变发展减少35。

重要的是，在实验性动脉粥样硬化的研究中，不仅需要关注病灶大小，病灶组成也是一个关键参数。人类疾病表现已与多种斑块特征相关联36。通过对主动脉根部进行连续切片，可获得多个切片，用于对斑块组成进行细致分析。人类斑块破裂的特征包括纤维帽较薄、平滑肌细胞稀少、胶原含量低以及斑块内存在炎症迹象36。尽管在小鼠动脉粥样硬化模型中斑块破裂属于罕见事件，但评估斑块稳定性的标志物仍具有重要参考价值。转化医学研究方法可验证来自小鼠模型的机制性发现，并揭示人类疾病的重要特征31。动脉粥样硬化斑块的炎症状态可通过免疫组织化学染色检测VCAM-1、MHC II类分子、巨噬细胞和淋巴细胞来确定30。一些实验方案采用主动脉弓或头臂动脉冠状面的纵切片来测量动脉粥样硬化病灶的大小和组成37。然而，这种替代方法仅能提供少量切片用于分析，限制了其应用范围。

本方案中的一个关键初始步骤是高效获取主动脉的能力。在显微镜下进行手眼协调操作需要练习，对于显微解剖以及后续固定主动脉弓均至关重要。本方案的下一个关键步骤是从主动脉根部连续切片。每只小鼠应收集80张连续切片，该过程需要高度专注和耐心。熟练的操作技术可显著加快上述流程。然而，动脉粥样硬化病变的定量分析仍是一项耗时的工作。未来，新技术、自动化处理以及小动物成像技术可能有助于实验性动脉粥样硬化的定量分析。动脉粥样硬化的发展进程缓慢，大多数小鼠模型的实验方案需要超过四个月才能完成13。因此，必须在研究终点以优化的方式收集主动脉。本方案提供了一套全面的方法，用于高效获取主动脉，并提出了一种多用途的处理方法，适用于主动脉根部、主动脉弓及无名动脉的病变定量分析。希望本方案能够减少实验变异性，提高结果的可靠性，并推动发现新的抗动脉粥样硬化治疗方法。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Göran K Hansson 实验性心血管研究团队所有往届成员，他们在过去二十五年中协助开发了本实验方案。我们特别感谢 Antonino Nicoletti、Xinghua Zhou、Anna-Karin Robertson 和 Inger Bodin 所做出的贡献。本研究工作得到了瑞典研究理事会项目资助 06816 和林奈支持 349-2007-8703、瑞典心脏-肺脏基金会、斯德哥尔摩县议会、Nanna Svartz 教授基金会、Loo 和 Hans Osterman 医学研究基金会、卡罗林斯卡学院研究基金会以及卡罗林斯卡学院老年疾病基金会的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮VWR Chemicals20066.296用于免疫组织化学切片的固定。
黑色绝缘胶带（50 mm 宽）任何专业零售商-用于制作主动脉弓的固定床。
离心机Eppendorf5417C台式微量离心机。
软木板任何专业零售商-用于在制备冷冻包埋主动脉根部时切割心脏。
冷冻切片机Thermo ScientificMicrom HM 560用于主动脉根部的连续冷冻切片。
去离子水--用于冲洗和溶液配制。
数码相机Leica MicrosystemsDC480510万像素CCD，用于获取主动脉弓和主动脉根部切片的高分辨率图像。
解剖剪刀（10 cm，直型）World Precision Instruments14393用于器官的一般解剖。
Dumont #5 镊子（11 cm，直型）World Precision Instruments500341用于主动脉的显微解剖。
70% 乙醇（v/v）VWR Chemicals83801.290高度易燃液体和蒸气，应储存于通风良好处，并保持低温。
无水乙醇 ≥99.8%VWR Chemicals20821.310高度易燃液体和蒸气，应储存于通风良好处，并保持低温。
4% 稳定化缓冲甲醛（pH 7.0）VWR Chemicals9713.1000吸入、皮肤接触或吞咽有害。
ImageJNIH-图像分析软件。
虹膜镊（10 cm，弯型，带齿）World Precision Instruments15915-G用作解剖镊。
异丙醇Merck1096341011易燃液体，可引起严重眼刺激，可能引起嗜睡或头晕。
Kaiser's 甘油明胶Merck1092420100含苯酚的水性封片介质，怀疑可导致遗传缺陷。
光学显微镜Leica MicrosystemsDM LB2用于切片过程中的观察以及油红O染色显微图像的记录。
Mayer's 苏木精Histolab1820不含水合氯醛的非毒性染色液，但可引起严重眼刺激。
梅奥剪刀（17 cm，直型）World Precision Instruments501751-G用于一般解剖。
微型Castroviejo持针器（9 cm，直型）World Precision Instruments503376用于固定主动脉弓。
微量离心管CorningMCT-175-C带 snaplock 盖的聚丙烯微量管。
Microlance 3 针头，23 号BD300800用于采血。
Microlance 3 针头，27 号BD302200用于小鼠灌注。
Microvette 500 µL，K3 EDTASarstedt20.1341.100用于采血。
Microvette 500 µL，锂肝素Sarstedt20.1345.100用于采血。
微型昆虫针，0.10 mmFine Science Tools26002-10用于固定主动脉弓。
油红OSigma-AldrichO0625未被归类为危险物质或混合物。
最佳切割温度（OCT）冷冻包埋剂Histolab45830用于组织包埋。
Parafilm MBemisPM992石蜡膜，用于制作主动脉弓的固定床。
培养皿（100 mm × 20 mm）任何细胞培养供应商-建议用作固定后主动脉的储存容器。
磷酸盐缓冲液（PBS）--小鼠灌注需使用无菌且无RNase的溶液。
定性滤纸（1001级）Munktell120006用于过滤油红O工作液（典型截留粒径 2–3 µm）。
RNAlater RNA稳定试剂Qiagen76106用于组织样本中RNA的稳定。
RNaseZap RNase去污染溶液InvitrogenAM9780一种表面去污染溶液，可接触即刻破坏RNase。
3号手术刀柄（13 cm）World Precision Instruments500236用于在制备冷冻包埋主动脉根部时切割心脏。
标准10号手术刀片World Precision Instruments500239用于在制备冷冻包埋主动脉根部时切割心脏。
体视显微镜Leica MicrosystemsMZ6用于解剖和表面平铺观察记录。
苏丹IVSigma-AldrichS4261未被归类为危险物质或混合物。
Superfrost Plus 显微镜载玻片Thermo ScientificJ1800AMNZ用于收集主动脉根部切片。
组织镊（15 cm）World Precision Instruments501741-G用于一般解剖。
Tissue-Tek 冷冻模具（10 mm × 10 mm × 5 mm）Sakura4565用于将主动脉根部包埋于OCT中。
Vannas 剪刀（8 cm，直型）World Precision Instruments503378用于主动脉的显微解剖。

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小鼠动脉粥样硬化的定量分析
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