使用自动化工作站进行质谱分析的血浆样本制备

摘要

本文介绍了一种用于基于质谱的定量蛋白质组学分析的自动化血浆蛋白质消化方法。在本方案中，蛋白质变性、还原、烷基化及胰蛋白酶消化反应中的液体转移和孵育步骤得到了简化并实现自动化。制备一块具有理想精密度的96孔板大约需要五小时。

摘要

蛋白质组学中用于质谱分析的样品制备需要通过酶切将蛋白质消化为肽段混合物。该过程涉及多个孵育和液体转移步骤，以实现蛋白质的变性、还原、烷基化和酶切。将此流程应用于自动化工作站可提高效率并降低变异系数，从而为不同样品类型之间的统计学比较提供更可靠的数据。我们此前已报道过一种自动化的蛋白质组样品制备流程¹。本文中，我们报告了一种更高效且更可控的流程的开发，具有以下优势：1）通过合并试剂，将液体转移步骤从九步减少至六步；2）采用具有多通道的96孔移液头进行选择性吸头移液，缩短移液时间；3）最多可达45个板位的配置提高了潜在通量；4）系统的完全封闭设计改善了温度和环境控制，并降低了样品或试剂污染的风险；5）向每个样品中添加稳定同位素标记的肽段以及β-半乳糖苷酶蛋白，可在整个流程中实现过程监控和质量控制。这些硬件和工艺改进为基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质和肽段定量提供了良好的重复性，并提高了板内和板间精密度（变异系数低于20%）。在96孔板中对96个样品进行完整消化的整个流程可在约5小时内完成。

引言

基于质谱（MS）的蛋白质和肽段定量正越来越多地被用作基础研究和临床实验室中血浆分析的一种生物分析工具^2，3。随着质谱技术因其能够在单次质谱运行中定量数百种肽段的能力，成为靶向特定肽段序列以定量蛋白质或修饰蛋白质的首选方法，相关的仪器设备和信息学工具也迅速发展⁴。样品制备是任何蛋白质组学分析的基础。在质谱分析之前，生物样品中的蛋白质通常需要经过变性、还原、烷基化、胰蛋白酶消化成肽段以及脱盐等步骤⁵。烷基化可阻断半胱氨酸，防止发生不受控的修饰，并确保所有半胱氨酸具有相同的质量。随后加入胰蛋白酶将蛋白质消化为肽段。这些步骤中的每一步都需要优化，而整个过程传统上由人工操作完成，容易引入分析误差。

传统的生物标志物开发流程主要包括两个过程：采用鸟枪法蛋白质组学进行全局性蛋白质发现，以建立深入的蛋白质清单⁶，以及采用靶向蛋白质组学进行验证与确证，旨在实现高精度和高通量的蛋白质定量⁷。无论采用何种质谱（MS）方法，样品制备流程均相同，其核心是通过酶解将蛋白质裂解为肽段混合物。根据 Van Eyk 和 Sobhani⁸ 的建议，为有效推动发现阶段的生物标志物进入临床应用检测，需要建立一种能够对发现型和靶向型检测均实现准确、精确且可重复分析的方法。实现样品制备的自动化将有助于提升向高通量分析转化的效率。手动操作方法通常会引入超出美国食品药品监督管理局（FDA）在修订版《生物分析方法验证指南》中规定的可接受限值的分析误差，该指南涵盖生物标志物和诊断检测^2,9。为促进需要制备和分析数千份生物样本的生物标志物研究，建立一种快速、高准确度且无需人工干预的质谱蛋白质样品制备流程十分必要。质谱样品制备步骤繁多，易引入误差，且过程繁琐耗时。

在我们改进的方法中，自动化工作站被编程以执行所有必要的血浆样本制备步骤，总共分为6步（图1），以确保：1）液体转移的准确性；2）反应在一致的时间启动和终止；3）反应在受控温度（即孵育器）下进行；4）所有反应均实现均匀混合。我们还引入了外源性质量控制蛋白和内标物（稳定同位素标记的肽段标准品），以确保在96孔板格式下基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质和肽段定量具有高质量和可重复的通量。若包括试剂制备，手工处理96个样本所需的工时和总计约1,000,000次移液操作需在单个离心管中完成。自动化显著减少了人工操作时间和人为干预次数。

方案

1. 自动化液体处理系统的编程

1. 从文件菜单创建新方法（文件 | 新方法)
   注意：请按给定顺序完成各步骤。斜体字体表示需在 Biomek 软件中输入的文本。有关移液技术和模板的信息，请联系作者。
2. 在起始步骤中输入起始步骤变量及其对应的值，如所列 表1.
3. 为选择性吸头移液设置列。对于步骤 1.3-1.7，点击 设置全局 工具栏下的步骤 控制步骤 并将其拖动到方法中。
   1. 使用 设置全局 步骤，设定值 =第一列 可变的 第一列_全局，值 =最后一列 可变 最后一列_全局，值 =最后一列-第一列+1 至变量 列，和数值 =列数*8 可变 孔.
   2. 选择 脚本 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。按照所示输入 VB 脚本 图2.
4. 设置混合液的体积 设置全局 和溶液。
   1. 使用 设置全局 步骤，将相应值设置为体积混合变量，如下所示 表2.
   2. 点击 如果 工具栏下的步骤 控制步骤 并将其拖动至方法中。在条件中输入 自动进样器.
   3. 在 然后，点击 设置全局 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。
   4. 使用 设置全局 步骤，设定值 =(流动相*色谱柱)+10 可变 流动相孔.
   5. 在……之下 否则, 点击 的 设置全局 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。
   6. 使用 设置全局 步骤，设置值 =0 至变量 流动相孔
5. 配置引导式耗材设置（GLS）
   1. 点击 工作台编辑器 工具栏下的步骤 实用工具. 创建一个新的甲板以对应甲板布局中的设计 图3 并将其标记为 Deck 1。
   2. 单击 引导式设置 工具栏下的步骤 设置 & 设备 并将其拖动至方法中。按照图示，将甲板位置中的耗材类型进行拖放。 表3随后，按照下表所示填写表格中的标签 表3 以及 图4 （设置引导设置）
6. 设置移液尖端计数的步骤
   1. 点击 定义实验流程 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。将程序命名为 TipCount.
   2. 点击 实验方案 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。按照所示输入 VB 脚本 图5 （吸头计数脚本）
   3. 点击 如果 工具栏下的步骤 控制步骤 并将其拖动到方法中。
   4. 在特定条件下，类型 TL5 = 0.
   5. 在 然后，点击 移动耗材 工具栏下的步骤 设置 & 仪器操作步骤 并将它拖动到方法中。从工作区移动实验器具 TL5 至 TR3 单击 移动耗材 工具栏中的步骤，位于 设置 & 设备步骤 并将它拖动到方法中。从工作区移动实验器具到 TL2 到 TL5 最后，单击 移动耗材 工具栏下的步骤 设置 & 设备步骤 并将其拖动至方法中。从工作区移动实验器具 BC90 到 TL2
7. 定义培养箱操作程序
   1. 点击 定义实验步骤 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。将该操作步骤命名为 孵育器
   2. 输入类型 半衰期 作为变量名称和 1800 作为默认值。
   3. 输入类型 NextTemp 作为变量名称和 22 作为默认值
   4. 输入类型 温度 作为变量名 60 默认值
   5. 单击 增强型移动耗材 工具栏下的步骤 设置 & 仪器步骤 并将其拖动至方法中。移动实验耗材从 P11 到 INHECO1
   6. 单击 运行程序 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。将程序命名为 TipCount
   7. 点击 INHECO 孵育 工具栏下的步骤 整合 并将其拖动至方法中。输入 INHECO1 用于在指定位置使用设备， =半衰期 孵育 =Temp 用于 °C 以及 3 用于 °C 目标温度。选择 孵育期间振荡 选项和 轨道 (顺时针）振荡模式。对于设置，输入 1.00 毫米，左右方向 6.6 每秒数次 1.00 毫米向前和向后 6.6 每秒数次
      注意：确保已安装 INHECO 培养箱软件。
   8. 点击 INHECO 孵育 工具栏下的步骤 整合 并将其拖动到方法中。输入 INHECO1 用于在指定位置使用设备， =半程时间 孵育 =Temp 用于 °C 以及 3 用于 °C 目标温度。选择 孵育时振荡 选项和 轨道 (逆时针）振荡模式。设置参数时，输入 1.00 毫米，左右方向 6.6 每秒数次 1.00 毫米前后移动 6.6 每秒数次
   9. 点击 暂停 工具栏下的步骤 设置 & 设备步骤 并将其拖动至方法中。暂停整个系统 1 s.
   10. 点击 定义实验步骤 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。将程序命名为 孵育器。
   11. 单击 INHECO 孵育 工具栏下的步骤 整合 并将其拖动到方法中。输入 INHECO1 用于在指定位置使用设备， 1 孵育 =NextTemp 用于 °C 以及 3 用于 °C 目标温度
8. Orbital 操作程序定义
   1. 点击 增强型移动耗材 工具栏下的步骤 设置 & 设备步骤 并将它拖动到方法中。从工作区移动实验器具到 P11 至 Orbital1
   2. 单击 运行程序 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动至方法中，选择步骤 TipCount
   3. 点击 设备操作 工具栏下的步骤 设置 & 仪器步骤 并将其拖动至方法中。选择设备 OritalShaker0，命令 TimedShake。输入振荡速度 1000, 达到最高速度所需时间 2, 摇晃时间 30.
   4. 点击 增强型移动耗材 工具栏下的步骤 设置 & 设备步骤 并将其拖动到方法中。移动实验器具 Orbital1 至 P11.
9. 设置第一个混合液
   1. 点击 选择移液头 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到方法中。选择重新排列位置 TL4。
   2. 单击 INHECO 孵育 工具栏下的步骤 整合 并将其拖动至方法中。输入 INHECO1 用于在指定位置使用设备， 1 孵育，孵育时间为 60 用于 °C 以及 3 用于 °C 目标温度
   3. 单击 循环 工具栏下的步骤 控制步骤 并将其拖动至“选择吸头”步骤中的方法内。输入 列 作为变量 =第一列 作为开始， =最后一列 作为结束，并 1 作为增量。
   4. 点击 选择吸头，装载吸头 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环步骤内的方法中。从下拉菜单中选择 BC90 Tips、TL5 位置和 TL2 备用 Tips 位置。选择单列(s)，并输入 1.
   5. 单击 选择移液头并吸取 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环步骤内的方法中。选择 BCDeep96Round 耗材类型和试剂板位置。输入体积 =第一混合液，从柱中抽吸 1 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
   6. 点击 选择移液头分配 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将它拖动到循环步骤内的方法中。选择 BCDeep96Round 耗材类型和试剂板位置。输入体积 =第一混合液，向第几列进行分液 =col 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
   7. 点击 选择移液头卸载 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环步骤内的方法中。选择将移液头卸载至 TR1。
10. 设置样品
    1. 点击 如果 工具栏下的步骤 控制步骤 并将其拖动到方法中。输入 样品板 作为条件。
    2. 在……之下 然后，点击 选择吸头 装载吸头 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动至方法中。从下拉菜单中选择 BC90 Tips、TL5 位置和 TL2 备用 Tips 位置。选择单列（Single Column(s)）并输入 =tipcolumns.
    3. 点击 选择移液吸头 吸液 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到方法中。选择 Greiner96RoundPS 耗材类型和样品位置，输入体积 =样本，从柱中吸取 第一列 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    4. 点击 选择吸头分配 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到方法中。选择 BCDeep96Round 耗材类型和反应板位置。输入体积 =样本，向列中分配 = 第一列 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    5. 点击 选择移液头卸载 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到方法中。选择将移液头卸载至 TR1。
    6. 实验结束后 如果 步骤，点击 运行程序 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。选择程序“孵育器”。输入 半衰期 作为变量名称和 1800 作为默认值。输入 NextTemp 作为变量名称和 22 作为默认值。输入 温度 作为变量名称和 60 作为默认值。
11. 设置半胱氨酸封闭步骤
    1. 点击 循环 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动至“选择吸头”步骤中的方法内。输入 列 作为变量 第一列 作为开始， =最后一列 作为结束和 1 作为增量。
    2. 在 循环，点击 选择移液头 加载移液头 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动至方法中。从下拉菜单中选择 BC90 Tips、TL5 位置以及 TL2 备用 Tips 位置。选择单列（Single Column(s)）并输入 1.
    3. 点击 选择吸头 吸液 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 BCDeep96Round 耗材类型和试剂板位置。输入体积 =CysteineMix，列中吸取 2 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    4. 单击 选择移液头分配 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 BCDeep96Round 实验耗材类型 以及 反应板位置输入体积 = CysteineMix，按列分配 = 列 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    5. 点击 选择移液管尖卸载 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到方法中，随后在其中选择 卸载 将吸头移至 TR1。
    6. 实验结束后 如果 循环，单击 运行程序 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动至方法中。选择程序“孵育器”。输入 半衰期 作为变量名称和 300 作为默认值。输入 NextTemp 作为变量名称和 43 作为默认值。输入 温度 作为变量名称和 25 默认值
12. 配置第二混合液
    1. 点击 循环 工具栏下的步骤 控制步骤 并将其拖动到“选择吸头”步骤中的方法内。输入 列 作为变量 =第一列 作为开始， =末列 作为结束和 1 作为增量
    2. 在循环下方，单击 选择吸头，装载吸头 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动至方法中。从下拉菜单中选择 BC90 Tips、TL5 位置以及 TL2 备用 Tips 位置。选择单列（Single Column(s)）并输入 1.
    3. 点击 选择吸头 吸液 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 BCDeep96Round 耗材类型和试剂板位置。输入体积 =SecondMix，从列中吸取 3 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    4. 单击 选择吸头分配 工具栏中下方的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 BCDeep96Round 耗材类型和反应板位置。输入体积 = 第二混合液，按列分配液体 = 列 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    5. 点击 选择移液头卸载 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到方法中，然后选择将移液头卸载至 TR1。
    6. 实验结束后 如果 循环，单击 运行程序 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动至方法中。选择程序“Orbital”。
    7. 点击 暂停 工具栏下的步骤 设置 & 仪器步骤 并将其拖动至方法中。暂停整个系统 1 s.
13. 设置胰蛋白酶添加步骤
    1. 单击 环 工具栏下的步骤 控制步骤 并将其拖动至“选择吸头”步骤中的方法内。输入 列 作为变量 =第一列 作为开始， =最后一列 作为结束和 1 作为增量。
    2. 在……之下 循环，点击 选择移液头 加载移液头 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动至方法中。从下拉菜单中选择 BC90 吸头、TL5 位置以及 TL2 备用吸头位置。选择单列（Single Column(s)）并输入 1.
    3. 点击 选择移液吸头 吸液 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 BCDeep96Round 耗材类型和试剂板位置。输入体积 胰蛋白酶，从柱中吸取 4 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    4. 单击 选择吸头分配 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 BCDeep96Round 耗材类型和反应板位置。输入体积 胰蛋白酶，按列分配 = col 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    5. 点击 选择移液尖头卸载 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到方法中，然后选择将移液头卸载至 TR1。
    6. 实验结束后 如果 循环，单击 运行程序 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。选择程序“孵育器”。输入 半衰期 作为变量名称和 3600 作为默认值。输入 NextTemp 作为变量名称和 25 作为默认值。输入 温度 作为变量名称和 43 作为默认值
    7. 点击 INHECO 孵育 工具栏下的步骤 整合 并将其拖动到方法中。确保已安装 INHECO Incubator 软件。输入 INHECO1 用于在指定位置使用设备， 1 孵育 25 用于 °C 以及 5 用于 °C 目标温度
14. 设置淬灭反应
    1. 点击 循环 工具栏下的步骤 控制步骤 并将其拖动至“选择吸头”步骤中的方法内。输入 列 作为变量 =第一列 作为起始点， =最后一列 作为结束和 1 作为增量。
    2. 在 循环，点击 选择移液头 加载移液头 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动至方法中。从下拉菜单中选择 BC90 Tips、TL5 位置和 TL2 备用 Tips 位置。选择单列（Single Column(s)）并输入 1.
    3. 点击 选择移液头并吸取 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 BCDeep96Round 耗材类型和试剂板位置。输入体积 淬灭，从柱中吸取 5 和行 1从下拉菜单中选择一种优化的技术。
    4. 点击 选择吸头分配 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 BCDeep96Round 耗材类型 以及 反应板位置输入体积 淬灭，按列分配 = 列 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    5. 点击 选择移液尖头卸载 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到方法内 然后. 选择将吸头卸载至 TR1。
    6. 实验结束后 如果 循环，单击 运行程序 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动至方法中。选择步骤 轨道.
    7. 点击 暂停 工具栏下的步骤 设置 & 仪器操作步骤 并将其拖动至方法中。暂停整个系统 1 s.
    8. 点击 暂停 工具栏下的步骤 设置 & 仪器步骤 并将其拖动到方法中。选择 暂停整个系统并显示此消息输入信息“离心后继续”。
15. 为自动进样器设置样品板
    1. 点击 如果 工具栏下的步骤 控制步骤 并将其拖动到方法中，位于 选择移液头 步骤。类型 自动进样器 作为条件。
    2. 在 然后，点击 环 工具栏下的步骤 控制步骤 并将其拖动到方法中。输入 列 作为变量 =第一列 作为开始， =最后一列 作为结束和 1 作为增量。
    3. 在……之下 循环，点击 选择移液吸头 装载移液吸头 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动至方法中。从下拉菜单中选择 BC230 Tips、TL6 位置和 TL2 备用 Tips 位置。选择单列（Single Column(s)）并输入 1.
    4. 点击 选择吸头 吸液 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 BCDeep96Round 实验耗材类型 以及 试剂板位置输入体积 =MobilePhase，从柱中吸取 6 以及行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    5. 点击 选择吸头分配 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 Bio_RadPCR96 耗材类型和自动进样器板位置。输入体积 流动相，按列分配 = col 和行 1从技术下拉菜单中选择一种优化的技术。
    6. 点击 选择移液管尖卸载 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到方法中，位于 然后选择将移液头弃至 TR1。
    7. 实验结束后 如果 循环，点击 运行程序 工具栏下的步骤 质控步骤 并将其拖动到方法中。选择步骤 TipCount.
    8. 点击 选择移液头 加载移液头 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动至方法中。从下拉菜单中选择 BC90 Tips、TL5 Location 和 TL2 backup Tips Location。选择单列（Single Column(s)），并输入 =tipcolumns.
    9. 点击 选择吸头 吸液 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到循环内的方法中。选择 BCDeep96Round 实验耗材类型 以及 反应板位置输入体积 =消化转移，从柱中吸取 =firstcolumn 和行 1从下拉菜单中选择一种优化的技术。
    10. 点击 选择吸头分配 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将它拖动到循环内的方法中。选择 Bio_RadPCR96 耗材类型和自动进样器板位置。输入体积 流动相，按列分配液体 =第一列 和行 1从下拉菜单中选择一种优化的技术。
    11. 单击 选择移液吸头并卸载 工具栏下的步骤 液体处理步骤 并将其拖动到方法内部 然后选择将吸头卸载至 TR1。选择吸头步骤至此结束。
    12. 保存并命名该方法。

2. 准备样本、实验器具和试剂

1. 将5 µL混合的健康人血浆转移至聚丙烯96孔深孔板中。
   注意：本方案所用试剂和耗材详见材料表。本研究使用购入的TPCK处理的胰蛋白酶，并针对其优化了酶与底物的比例及孵育时间。若使用其他级别的胰蛋白酶（如测序级重组胰蛋白酶），则需对酶与底物的比例及孵育时间进行测试和优化。

3. 操作流程

1. 双击软件图标。
2. 在 方法 选项卡下，选择 归位所有轴，以校准并准备自动化液体处理仪。确保工作站的所有注射器中无可见气泡。
3. 在 文件 菜单下，选择 打开 | 方法。
4. 选择相应的方法（图6）。
5. 点击绿色三角形的 运行 图标以启动方法。
6. 若希望在方法结束后制备自动进样器板，请在 输入“Autosampler”所用的值 提示中输入“true”，然后点击 确定。若不制备自动进样器板，则输入“false”，然后点击 确定。
7. 在 输入“firstcolumn”所用的值 提示中输入“1”，然后点击 确定。
8. 在 输入“lastcolumn”所用的值 提示中输入“12”，然后点击 确定。
   注：此步骤与步骤4.7共同指示工作站对96孔板的12列进行消化处理，从而使用板上所有孔进行消化反应。
9. 若使用样品板且每孔样品体积至少为20 µL，请在 输入“SamplePlate”所用的值 提示中输入“true”，然后点击 确定。若不使用样品板，则输入“false”，然后点击 确定。
   注：若不使用样品板，需向反应板的每个对应孔中加入5 µL样品。
10. 按照“引导式耗材设置”窗口中的指示操作，并点击 继续。
    注：下一个窗口描述了需准备的“试剂板”布局（图7，补充表1）。以下体积将被分装至1 mL深孔圆底96孔板中每一列的8个孔中：
    第1列：540 µL 反应混合液1。
    第2列：50 µL 半胱氨酸封闭液。
    第3列：730 µL 反应混合液2。
    第4列：130 µL 胰蛋白酶。
    第5列：130 µL 终止溶液。
    第5列：1090 µL 流动相溶液（若用户在步骤6中输入“true”）。
11. 点击 下一步，下一个窗口将提示样品板中每孔所需分装的最小体积（20 µL）。若用户在涉及样品板的提示中输入了“false”（步骤9），系统将提示用户向反应板中每孔加入5 µL样品。
12. 点击 下一步。
    注：下一个窗口提示必须在自动化液体处理仪的甲板上放置一个空的90 µL吸头盒。
13. 再次点击 下一步，按照指定和图示（图8）布置自动化液体处理仪的甲板，包括试剂板、反应板、样品板、自动进样器板、6个满的90 µL吸头盒、1个空的90 µL吸头盒，以及1个满的230 µL吸头盒。
14. 点击 完成 以开始方法运行。
    注：点击 完成 后，用户不得伸手进入自动化液体处理仪内部，否则将“触发光幕”并导致仪器因安全机制而停止运行。
15. 在 离心后继续 提示下，取出反应板并在3,000 rpm下离心30分钟。
16. 离心完成后，将反应板放回自动化液体处理仪中原来的位置，并点击 继续。
    注：方法完成后，自动化液体处理仪将再次停止。若用户在步骤6中输入“true”，可将自动进样器板从工作站中取出，并置于液相色谱仪的自动进样器中进行分析。

4. 液相色谱-串联质谱（LC-MSMS）

1. 使用配备C18 2.1 mm x 100 mm、3.5 µm色谱柱的高流速HPLC分离肽段，流速为0.25 mL/min，并在三重四极杆质谱仪上进行在线分析。
   注意：肽段消化完成后，针对机器人制备样品的靶向LC-MSMS定量分析方法将在下文简要描述LC-MSMS之后详细说明¹。
2. 将色谱柱柱温箱温度设置为40 °C。使用缓冲液A（2%乙腈，98%水，0.1%甲酸）和缓冲液B（95%乙腈，5%水，0.1%甲酸）作为两种流动相。
3. 上样后，用5% B平衡色谱柱5分钟。在30分钟内以线性梯度从5% B升至35% B洗脱肽段。
   1. 在加载下一个样品前，通过用98% B冲洗10分钟，再用5% B冲洗5分钟，对色谱柱进行再生。
   2. 对于在线分流，使用两相切换阀在柱后流出液进入离子源之前将其导向废液。
4. 处理MRM数据。

结果

在自动化工作站上进行的蛋白质组学样品制备流程改编自我们先前的自动化方案，并结合了针对白蛋白（选定的血浆蛋白）和β-半乳糖苷酶（β-gal，一种用于质量控制的外源性蛋白）的稳健LC-SRM-MS检测方法¹。样品处理完成后，在三重四极杆液相色谱-质谱仪上进行SRM检测，靶向血清白蛋白和β-半乳糖苷酶。通过各跃迁反应的SRM信号变异系数（CV）来评估自动化消化流程的重复性。

我们自动化了5 μL血浆样本的消化过程中的试剂添加和混合步骤，并在仪器平台内置孵育器中使用胰蛋白酶孵育2小时。为评估重复性，使用多通道移液头（96针）将5 μL混合血浆样本分配至反应板的多个孔中。为监控过程一致性，我们在还原和烷基化反应之前加入了β-半乳糖苷酶蛋白（β-gal蛋白）。该自动化蛋白质组学样品制备流程采用一种稳健的液相色谱-选择反应监测-质谱（LC-SRM-MS）检测方法进行验证，检测目标包括血浆中丰度最高的白蛋白以及用于质量控制的β-gal蛋白。从处理后的血浆白蛋白和 spiked 的β-gal蛋白中监测了三种β-gal肽段和两种白蛋白肽段（表4）。

为了节省时间并简化操作流程，我们将使用自动化工作站向反应体系中添加/混合/孵育试剂及反应混合物的液体转移步骤，从原有的九步流程减少至六步流程（图1）。整个蛋白质组学工作流程包含两个实验部分：自动化样品制备和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。首先，我们通过自动进样器板中同一消化孔连续进样八次，评估了LC-MS/MS选择反应监测（SRM）数据采集的精密度。自动化样品制备流程的精密度通过总蛋白质组学SRM工作流程的变异系数百分比（%CV）减去LC-MS/MS的%CV计算得出（图9B）。在自动化工作站上优化后的血浆蛋白消化流程中，外源添加的β-半乳糖苷酶蛋白（β-gal）的实验制备精密度%CV低于11.4%（平均为10.0%），最丰富的内源蛋白人血清白蛋白的%CV低于14.9%（平均为9.9%）（图9）。如预期所示，人血清白蛋白和β-gal蛋白均获得了良好的信号强度（图9C）。

针对每一步移液和液体转移操作，均进行了特定优化。为监测液体转移步骤的精密度，我们在三个独立的试剂转移步骤（反应混合液1、半胱氨酸阻断剂和反应混合液2）中分别加入了稳定同位素标记（SIL）的肽段标准品，分别对应内源性人血清白蛋白蛋白和外源性β-半乳糖苷酶蛋白（图10）。通过采集这五种SIL肽段的MRM信号，以监测自动化液体转移步骤的精密度。来自反应混合液1步骤的两种肽段DDNPNLPR^和GDFQFNISR^（^代表N15标记的氨基酸）的平均%CV值介于1.8%至11.2%之间；来自半胱氨酸阻断剂步骤的一种肽段IDPNAWVER^的平均%CV值介于6.6%至8.8%之间；来自反应混合液2步骤的两种肽段WVGYGQDSR^和LVNEVTEFAK^的平均%CV值介于6.2%至11.9%之间（图10）。

为验证自动化蛋白质组学样品制备工作流程的重复性，我们评估了人血清白蛋白、外源性β-半乳糖苷酶以及另外40种血浆蛋白在多个蛋白质和多个实验日之间的重复性。我们在三天内处理了21个重复样品（混合的正常人血浆），样品在孔板中的位置如图11A所示。日内变异系数（CV）由同一天制备的21个孔的数据计算得出。40种蛋白质的平均日内%CV范围为4%–20%（图11B）。为评估基于孔板的自动化工作流程是否存在边缘效应，根据特定列和行中的孔位计算了%CV（列与行位置图见图12A）。所有列和行配置中的MRM信号强度相似，%CV范围为3%–22%（图12B）。

总之，优化后的自动化工作流程可在不到五小时内完成96个样本的均一化处理，并具有出色的实验精密度。为适配自动化工作流程，我们选用的试剂具有可忽略的非特异性副反应、在环境光照下稳定、适用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，并可分装后冷冻保存。

图1：样本制备工作流程示意图。 列出了主要的6个液体转移步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：吸头装载脚本。 此处显示了 VB Script 的详细信息。该脚本规定了吸头装载的条件。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：自动化工作站台面布局。 台面包括1x1 ALPs、吸头装载ALPs、废料桶、吸头清洗区、帕尔帖模块和一个孵育器。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4：试剂板的属性。 显示的是通过引导式耗材设置访问试剂板耗材时所需的属性。请根据图中所示，选择相应的列并输入对应的变量。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：吸头计数脚本。 该脚本有助于跟踪甲板上吸头的数量。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：血浆样本消化与分装方法的概览。 液体处理仪方法中的试剂计算、耗材设置及液体操作步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：试剂板布局。 图示为血浆消化和自动进样器准备所需的化学试剂，分布于试剂板实验耗材中的位置。该图已根据一份技术说明¹⁰修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

图8：自动化工作站平台上的实验耗材布局图。 图示为液体处理系统进行血浆蛋白消化方法时的平台布局。该图改编自一份技术说明¹⁰。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 9：总蛋白质组学工作流程的精密度由工作站 CV 和靶向 LC MS/MS CV 共同构成。
监测了来自 β-gal 和白蛋白的五种肽段，展示了每种肽段的色谱图及其保留时间（A）；精密度数据来自 30 个孔/样本的代表性实验处理结果，计算了总蛋白质组学工作流程、LC MS/MS 分析以及自动化样品处理各环节的 CV%（B）。总体而言，消化后的肽段信号良好，范围从 1×10⁵ 到 1×10⁸。 请点击此处查看该图的放大版本。

图10：液体转移步骤精密度的测定。 在特定步骤的试剂中加入合成肽段，通过总%CV评估自动液体转移的精密度。实验基于30个孔/样本，减去由8次重复LC-MS/MS进样测定的%CV值。请点击此处查看该图的放大版本。

图11：基于42种蛋白质MRM分析的自动化蛋白质组样品制备工作流程的多日重复性。 （A）连续三天的反应板布局图，每天向21个孔中各加入5 µL血浆。其中3个孔加入5 µL水作为阴性/空白对照。（B）左侧为190个MRM跃迁（包含75种肽段和42种蛋白质）的平均强度，右侧为根据每天21个孔的消化结果计算出的每个MRM跃迁的%CV值。请点击此处查看该图的放大版本。

图12：孔位特定位置（列与行位置）的重复性。 （A）显示了带有板图的列与行位置。 （B）来自单块板消化实验中指定孔位的列和行位置特异性 MRM 信号的平均强度（左）及其 cv%（右）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图13：技术编辑器界面截图。 针对每个移液模板，需定义液面感应、凝块检测、穿刺、液体类型、通用设置、吸液、分配、混匀和校准的参数。本实验方案中所使用的模板与技术详见补充表2。请点击此处查看该图的放大版本。

变量	变量	值	描述
Autosampler	Boolean	TRUE	使用自动进样器
Betagal	Integer	5	Betagal 体积
BG1	Integer	0.8	BG1 体积
BG2	Integer	0.8	BG2 体积
BG3	Integer	0.8	BG3 体积
CysteinBlocker	Integer	1.25	半胱氨酸阻断剂体积
CysteineBuffer	Integer	0.45	半胱氨酸缓冲液体积
Denaturant	Integer	5	变性剂体积
DigestTransfer	Integer	10	消化转移体积
First Buffer	Integer	25.9	第一缓冲液体积
First Column	Integer	1	第一列
HSA1	Integer	0.8	HSA1 体积
HSA2	Integer	0.8	HSA2 体积
lastcolumn	Integer	12	最后一列
MobilePhase	Integer	90	流动相体积
Quench	Integer	10	淬灭柱
ReducingAgent	Integer	5	还原剂柱
Sample	Integer	5	样品柱
SamplePlate	Boolean	TRUE	使用样品板
SecondBuffer	Integer	58.4	第二缓冲液体积
Trypsin	Integer	10	胰蛋白酶柱

表1：起始步骤变量

数值	变量
=FirstBuffer+Denaturant+ReducingAgent+Betagal+BG1+HSA1	FirstMix
=CysteineBlocker+CysteineBuffer+BG2	CysteineMix
=SecondBuffer+BG3+HSA2	SecondMix
=(FirstMix*Columns)+30	FirstMixWell
= (CysteineMix*Columns)+20	CysteineWell
=(SecondMix*Columns)+10	SecondMixWell
=(Trypsin*Columns)+10	TrypsinWell
=(Quench*Columns)+10	QuenchWell
=(FirstMixWell*8)+100	FirstMixStock
=CysteineWell*8+20	CysteineMixStock
=(SecondMixWell*8)+100	SecondMixStock

表2：混合体积变量

类型	名称	位置	深度	属性	使用？
BCDeep96Round	试剂板	P5	1(顶部)	#	=not SamplePlate
BCDeep96Round	试剂板	P5	1(顶部)	#	=SamplePlate
BCDeep96Round	反应板	P11	1(顶部)		TRUE
Bio_RadPCR96*	样品	P9	1(顶部)		=SamplePlate
Bio_RadPCR96*	自动进样器板	P10	1(顶部)		=Autosampler
BC90	空板		1(顶部)		TRUE
BC90			1(顶部)		TRUE
BC90			1(顶部)		TRUE
BC230			1(顶部)		=Autosampler
BC90			1(顶部)		=Columns>1
BC90			1(顶部)		=Columns>3
BC90			1(顶部)		=Columns>5
BC90			1(顶部)		=Columns>7
BC90			1(顶部)		=Columns>9
注： *：对应于96孔Bio-Rad板。 #：点击属性，然后按照图6所示输入体积变量。

表3：设置引导式配置

蛋白质 编号	肽段序列	Q1 质量 (Da)	Q3 质量 (Da)	时间 (min)	碎片离子	去簇电位	碰撞能量	碰撞池出口电位
sp|P00722|BGAL_ELOCI	GDFQFNISR	542.3	262.1	19.7	+2y2	61	21	8
		542.3	636	19.7	+2y5	61	25	12
		542.3	764.2	19.7	+2y6	61	25	18
	IDPNAWVER	550.3	436.1	18.1	+2y7+2	61	23	8
		550.3	871.2	18.1	+2y7	61	25	18
		550.3	774.2	18.1	+2y6	61	33	8
	WVGYGQDSR	534.3	782.1	12.1	+2y7	51	25	6
		534.3	562.1	12.1	+2y5	51	27	6
		534.2	505.2	12.1	+2y4	90	25	8
sp|P02768|ALBU_HUMAN	DDNPNLPR	470.8	596.2	9.2	+2y5	61	27	16
		470.8	499.3	9.2	+2y4	61	27	18
		470.8	710.4	9.2	+2y6	61	27	18
	LVNEVTEFAK	575.3	694.4	18.2	+2y6	73.1	29.6	18
		575.3	937.5	18.2	+2y8	73.1	29.6	18
		575.3	823.4	18.2	+2y7	73.1	29.6	18

表4：MRM参数

补充表1：试剂板 请点击此处下载该表格。

补充表 2：实验方案模板 请点击此处下载该表格。

讨论

质谱分析的样品处理需要对蛋白质进行变性、还原和烷基化以封闭半胱氨酸，以及通过胰蛋白酶消化将蛋白质切割成肽段。每一步化学或酶促反应都需要在指定时间启动，并在受控温度下进行，而该过程的每一步都涉及多个液体转移步骤，可能引入实验变异。自动化样品处理为此难题提供了解决方案。目前可用的液体处理系统能够以小于5%的准确度和精密度将试剂转移至96孔板中（具体取决于所使用的加样头和吸头类型），并可在14 °C至70 °C的受控温度下对样品进行孵育，必要时还可伴随振荡。我们采用自动化液体处理设备以96孔板格式对血浆样品进行SRM检测的处理。

血清、血浆及其他生物样本中的蛋白质复杂混合物内含有成千上万个蛋白酶切割位点；而每种蛋白质均有其独特的性质，影响切割位点的可及性以及所产生的肽段的稳定性。因此，不可能设计出一种对所有蛋白质均最优的样品处理流程。最佳替代方案是尽可能保持操作的一致性。

为了确保一致性，我们对自动液体处理仪执行的每一步移液操作进行了优化。首先，我们综合考虑了所需体积以及液体类型（血浆、水相或有机相）及其相应性质（黏度、内聚力和挥发性）、硬件（工作站移液头和板夹持臂）和耗材带来的限制。随后，我们调整了吸液时的速度和尾随气隙、分配时的速度和吹出体积，以及混合的力度和持续时间，并在必要时加入吸液和/或分配后的吸头触碰操作，以去除附着在吸头外表面的液体（图13，补充表1）。每种试剂中均加入了一种预先筛选过稳定性的独特稳定同位素标记肽（SIL肽），以便监测每一步液体处理操作的精密度。优化后，大多数 transitions 的过程变异系数（CV）低于10%，表明该自动化工作站具有良好的重复性（图9、图10、图11 和 图12）。

此处介绍的自动化工作流程与手动方法相比，可实现更稳定的一致性酶解，并提高了可重复性和通量（图9，图10）。该方法有望通过质谱技术提高生物标志物发现与验证的准确性和可靠性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
混合健康人血浆	Bioreclamation Inc.		文中测试的人血浆样本
乙腈，HPLC级	Thermo Fisher Scientific	A998SK1	LC MS/MS溶剂
大肠杆菌来源的β-半乳糖苷酶重组蛋白	Sigma-Aldrich	G3153-5MG	外源性对照蛋白
Biomek i7 自动化工作站	Beckman Coulter, Inc.		蛋白质组学样品制备工作站：Biomek自动化工作站未被设计或验证用于疾病或其他状况的诊断
Biomek i系列 230µL非无菌吸头	Beckman Coulter, Inc.	B85903	吸头，i7耗材
Biomek i系列 90µL非无菌吸头	Beckman Coulter, Inc.	B85881	吸头，i7耗材
FG，TPCK处理的胰蛋白酶试剂盒	Sciex	4445250	消化反应中使用的胰蛋白酶
硬壳96孔PCR板，低矮型，薄壁，带裙边，绿色/透明	Bio-Rad	#hsp9641	自动进样器板
正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	O9882-5G	消化过程中使用的去垢剂
聚丙烯96孔圆底深孔板，无菌	Beckman Coulter, Inc.	267007	试剂和消化反应板
Prominence UFLCXR 高效液相色谱系统	Shimadzu, Japan		高流速液相色谱系统
QTRAP 6500	SCIEX		质谱仪
水，HPLC级	Thermo Fisher Scientific	W54	LC MS/MS溶剂
Xbridge BEH30 C18 2.1 mm × 100 mm	Waters	186003564	LC MS/MS色谱柱