本研究中，我们描述了一种使用脂肪酸盐油酸钠在分化型HepaRG细胞中诱导肝泡性脂肪变性的详细方案，并介绍了脂质积聚的检测与定量方法，包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像、细胞荧光分析、油红O染色以及定量PCR。
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摘要
摘要
肝脂肪变性是一种代谢功能障碍，由肝细胞内甘油三酯脂滴的积聚引起。过量脂肪积聚可导致非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）， 该疾病具有潜在可逆性，但也可能发展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），并最终进展为肝硬化和肝细胞癌（HCC）。目前，肝细胞内脂质积聚与NASH进展、不可逆性肝损伤、纤维化、肝硬化乃至HCC之间的分子机制仍不明确。为此，已开发出多种体外和体内模型，以阐明导致NAFLD的病理过程。在本研究中，我们描述了一种诱导肝泡状脂肪变性的细胞模型，该模型由DMSO诱导分化的 HepaRG 人肝细胞系组成，并使用脂肪酸盐油酸钠进行处理。事实上，经油酸钠处理的 HepaRG 细胞在细胞质中积聚脂滴，并表现出典型的脂肪变性特征。这种体外人源模型为体内小鼠模型以及原代人肝细胞提供了一种有价值的替代方案。我们还比较了多种用于定量和评估 HepaRG 细胞脂质积聚的方法，包括油红O染色、流式细胞术Bodipy检测、通过qPCR进行的代谢相关基因表达分析，以及相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像。CARS成像结合了拉曼光谱的化学特异性（一种在材料科学领域广泛应用的化学分析技术）与高速、高分辨率非线性光学显微技术的优势，能够精确量化脂质积聚及脂滴动态变化。建立高效的体外泡状脂肪变性诱导模型，结合准确的脂质积聚定量与表征方法，有望通过识别分子标志物实现NAFLD的早期诊断，并推动新型治疗策略的开发。
引言
肝脂肪变性定义为肝内甘油三酯脂滴中脂肪积聚，且脂肪含量至少占肝脏重量的5%。长期的肝内脂质蓄积是一种潜在可逆的过程，但可能导致肝脏代谢功能障碍、炎症以及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的进展，而NAFLD是全球许多地区慢性肝病的主要病因1,2。NAFLD是一种多因素疾病，可能发展为更具侵袭性的非酒精性脂肪性肝炎（NASH），后者可进一步进展为肝硬化，并在少数患者中发展为肝细胞癌（HCC）1,3。目前尚无获批的针对NAFLD的特异性治疗方法，饮食与生活方式干预的联合策略仍是NAFLD和NASH管理的基石4,5,6。
分子非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病过程中导致肝脂肪变性的潜在机制仍有待阐明7在此背景下，已开发出多种小鼠模型用于研究人类脂肪变性疾病的进展。这些模型种类繁多，各具优缺点，包括基因修饰、营养干预以及化学诱导模型，亦有结合多种方法的复合模型。经基因改造（转基因或基因敲除）的小鼠可自发形成肝....
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方案
1. 培养基与试剂的制备
- 增殖培养基：在William's E培养基中添加GlutaMAX、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、5 μg/mL胰岛素和0.5 μM氢化可的松半琥珀酸酯。
- 分化培养基：在William's E培养基中添加GlutaMAX、10% FBS、1%青霉素/链霉素、5 μg/mL胰岛素、50 μM氢化可的松半琥珀酸酯和2% DMSO。
- 冻存培养基：在增殖培养基中添加10% DMSO。
- 油酸钠：用99%甲醇溶解至100 mM浓度，搅拌过夜，于-20 °C保存。
- 油红O：配制储备液。称取0.35 g油红O，溶于100 mL异丙醇中，搅拌过夜，经0.2 µm滤膜过滤后，室温保存。配制工作液：取6 mL油红O储备液与4 mL ddH2O混合，室温静置20分钟，再用0.2 µm滤膜过滤。为获得理想的染色效果并避免背景干扰，强烈建议进行充分过滤。
- Bodipy（505/515）：将Bodipy（505/515）染料溶于DMSO中，配制成100 µM的储备液，避光保存于-20 °C，使用时稀释至终浓度为100 nM。
- 为CARS实验获取透明玻璃底培养皿。
2. HepaRG 细胞的解冻、扩增与冻存
- 将液氮冻存的HepaRG细胞放入37 °C水浴中快速解冻，直....
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结果
本方案描述了一种通过油酸钠处理诱导并表征DMSO分化HepaRG细胞中泡状脂肪变性的高效方法（图1A）。
HepaRG 细胞的分化。
为了有效诱导分化，必须将增殖期细胞以低密度（2.5 × 104 个细胞/cm2）接种于增殖培养基中。在低密度接种条件下，细胞活跃分裂，并呈现细长的未分化形态（图 1B）。细胞应在增殖培养基中培养 7 天，直至达到 100% 汇合度（图 1C）。经 2% DMSO 处理后，细胞开始分化，形成典型的肝细胞样克隆，周围环绕胆管上皮样细胞（图 1D）。分化的 HepaRG 细胞表达肝细胞特异性标志物，如白.......
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讨论
本方案描述了如何分化HepaRG细胞，以及如何通过油酸钠处理诱导细胞发生泡状脂肪变性（图1A）。事实上，与其他人肝细胞癌（HCC）细胞系相比，HepaRG细胞系表现出成人人类肝细胞的特征，是体外培养的原代人肝细胞的一种有价值的替代模型13,14,15。HepaRG细胞系已被广泛应用于肝脏细胞毒性研究、药物代谢研究以及病毒学研究15,16,22。
与 HepaRG 细胞相比，其他肝细胞癌（HCC）细胞系（如 HepG2、HUH7、HUH6 和 Hep3B）的代谢能力较低，缺乏大量肝特异性功能
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢法国里昂INSERM U871的Christian Trepo教授慷慨提供HepaRG细胞。我们感谢Rita Appodia在行政事务上的帮助。本研究由意大利教育大学研究部（MIUR- Ministero dell’istruzione, dell'università e della ricerca，项目编号FIRB 2011–2016 RBAP10XKNC）以及罗马Sapienza大学（项目编号C26A13T8PS；C26A142MCH；C26A15LSXL）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hyclone HyClone 胎牛血清 II | GE Healthcare | SH30066 | |
| William’s E 培养基（含 GlutaMAX ） | Thermofisher | 32551087 | |
| 青霉素/链霉素 | SIGMA | P4333 | |
| 胰岛素 | SIGMA | I9278 | |
| 氢化可的松半琥珀酸酯 | SIGMA | H2270 | |
| DMSO，二甲基亚砜 | SIGMA | D2438 | |
| 油酸钠 | SIGMA | O7501 | |
| 甲醇 | SIGMA | 179337 | |
| 异丙醇 | SIGMA | 278475 | |
| BODIPY 505/515 | Thermofisher | D3921 | |
| PBS | Thermofisher | 14190-250 | |
| 甲醛溶液 | SIGMA | 252549 | |
| 无RNA酶的DNA酶I | Promega | M198A | |
| 玻璃底培养皿 | Willco Wells | GWST-5040 | |
| 油红O溶液 | SIGMA | O625 | |
| CellTiter 96 AQueous One 溶液 | Promega | G3582 | |
| q-PCR 引物名称 | 序列 | ||
| ACACB 正向引物 | CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA | ||
| ACACB 反向引物 | CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG | ||
| β-actin 正向引物 | GCACTCTTCCAGCCTTCCT | ||
| β-actin 反向引物 | AGGTCTTTGCGGATGTCCAC | ||
| 白蛋白 正向引物 | TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG | ||
| 白蛋白 反向引物 | AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC | ||
| ALDOB 正向引物 | GCATCTGTCAGCAGAATGGA | ||
| ALDOB 反向引物 | TAGACAGCAGCCAGGACCTT | ||
| APOB 正向引物 | CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG | ||
| APOB 反向引物 | CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA | ||
| APOC3 正向引物 | CTCAGCTTCATGCAGGGTTA | ||
| APOC3 反向引物 | GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG | ||
| CPT1A 正向引物 | TCATCAAGAAATGTCGCACG | ||
| CPT1A 反向引物 | GCCTCGTATGTGAGGCAAAA | ||
| CYP2E1 正向引物 | TTGAAGCCTCTCGTTGACCC | ||
| CYP2E1 反向引物 | CGTGGTGGGATACAGCCAA | ||
| CYP3A4 正向引物 | CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT | ||
| CYP3A4 反向引物 | TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA | ||
| GAPDH 正向引物 | TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | ||
| GAPDH 反向引物 | AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC | ||
| GPAM 正向引物 | TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT | ||
| GPAM 反向引物 | ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA | ||
| IL6 正向引物 | CCTGAACCTTCCAAAGATGGC | ||
| IL6 反向引物 | ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG | ||
| PDK4 正向引物 | ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC | ||
| PDK4 反向引物 | TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG | ||
| PLIN2 正向引物 | TTGCAGTTGCCAATACCTATGC | ||
| PLIN2 反向引物 | CCAGTCACAGTAGTCGTCACA | ||
| PLIN4 正向引物 | AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC | ||
| PLIN4 反向引物 | GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC | ||
| SCD 正向引物 | TCTAGCTCCTATACCACCACCA | ||
| SCD 反向引物 | TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC | ||
| SLC2A1 正向引物 | TGCTCATCAACCGCAACGAG | ||
| SLC2A1 反向引物 | CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG | ||
| 18S 正向引物 | CGCCGCTAGAGGTGAAATTC | ||
| 18S 反向引物 | TTGGCAAATGCTTTCGCTC |
参考文献
- Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
- Byrne, C. D., Targher, G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology. 62 (1), Suppl ....
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重印与许可
