本文介绍了一种制备成人人类脑组织游离式脑片培养的实验方案。该方案是广泛使用的膜插件脑片培养法的一种改进，操作简便且成本较低，适用于开展旨在揭示与年龄相关脑疾病中神经退行性变机制的短期检测实验。
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本文内容
摘要
摘要
器官型（或称脑片）培养已被广泛用于在体外模拟中枢神经系统的部分功能。尽管脑片培养在神经科学研究中具有巨大潜力，但利用成年神经系统组织制备此类培养的研究仍然较少，尤其是来自人类受试者的组织。使用成年人类组织制备脑片培养特别有助于加深对人类神经病理机制的理解，因为这些组织具有成熟人脑特有的生物学特性，而这些特性在通常来源于啮齿类动物（尤其是新生个体）的脑片中并不存在。本实验方案描述了如何利用接受切除性脑手术的活体人类供体所获取的脑组织，制备短期、自由漂浮式脑片培养。文中还介绍了维持此类培养以及开展生化和细胞生物学检测的操作流程。代表性结果表明，在体外培养第4天（DIV4）时，人脑皮层典型的分层结构仍得以保留，并可观察到主要神经细胞类型的正常存在。此外，在受到毒性刺激（H2O2）时，DIV4的脑片表现出显著的细胞死亡，表明该模型可作为细胞死亡检测的有效平台。该方法相较于广泛使用的膜插件法更为简便且成本较低，主要推荐用于研究与年龄相关脑疾病背后的神经退行性机制的短期检测。最后，尽管本方案专注于使用因药物难治性颞叶癫痫接受手术治疗的患者所获取的皮层组织，但本文认为，来自其他脑区或病理状态的组织也可考虑作为制备类似自由漂浮脑片培养的来源。
引言
在研究中使用人类样本无疑是研究人类脑部病理的极佳选择，现代技术为利用患者来源组织进行可靠且符合伦理的实验开辟了新途径。诸如从成人脑组织制备的器官型/脑片培养等方法，已被越来越多地应用于光遗传学1、电生理学2,3,4,5、可塑性6,7,8,9、神经毒性/神经保护10,11,12,13、细胞治疗14、药物筛选15,16,
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方案
用于实验的活体成人脑组织来自接受切除性神经外科手术治疗药物难治性颞叶癫痫的患者（图1A）。所有操作均经巴西圣保罗大学里贝朗普雷图医学院附属临床医院伦理委员会批准（编号：17578/2015），患者（或其法定监护人）均已知情并签署知情同意书。脑组织由巴西圣保罗大学里贝朗普雷图医学院附属临床医院癫痫外科中心（CIREP - Clinics Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Brazil）的神经外科团队采集。
1. 材料的灭菌
注意：所有材料和溶液在使用前必须灭菌。
- 将所有手术器械和振动切片机切片材料（刀片夹具、样本盘、缓冲液托盘）在干热灭菌器中于 180 °C 灭菌 4 小时。
- 对温度敏感的材料或设备，采用紫外线或γ射线照射进行灭菌。
- 培养基和溶液通过高压灭菌或经 0.22 µm 孔径滤膜过滤灭菌。
2. 溶液的配制
- 配制15–20 mL运输液：50% v/v Hank's平衡盐溶液（HBSS），pH 7.4，50% v/v用于维持出生后及成年脑神经元的基礎培养基（
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结果
评估培养脑片质量和健康状况的一个关键方面是观察预期的神经细胞类型（包括神经元和胶质细胞）是否存在及其典型形态。在体外培养第4天（DIV4）的脑片中，通过神经元免疫标记观察到人脑皮层典型的分层结构（图2D）。此外，也观察到了小胶质细胞和星形胶质细胞的预期存在（图2B,C）。这些结果表明，无论是手术取材/样本处理过程，还是短期体外培养，均未对组织结构造成显著影响。与先前研究结果一致，NeuN免疫反应性在DIV0与DIV4之间未发生明显改变32。根据这些结果，游离式培养方式结合脑片厚度减少至200 µm（相较于使用膜插件时常用的300–400 µm），有助于氧气和营养物质更好地扩散至脑片内部细胞层，而这一点此前已被证明对维持培养脑片的健康至关重要39,40。
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讨论
本方案提供了一种制备游离式短期脑片培养的替代方法，适用于成人人类新皮层脑片的培养。该脑片培养方案可用于（但不限于）光遗传学1,44,45、电生理学2,3,4,5、短期可塑性46,47、长期可塑性48,49、神经毒性/神经保护10,11,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到圣保罗研究基金会（FAPESP，资助号 25681-3/2017，授予 A.S.）、巴西高等教育人员改善协调机构（CAPES，授予 A.F. 的博士后奖学金 PNPD/INCT-HSM 及授予 N.D.M. 的博士前奖学金）以及法埃帕（FAEPA）的支持。G.M.A. 获得圣保罗研究基金会（FAPESP，硕士奖学金 2018/06614-4）的资助。N.G.C. 持有巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）研究奖学金。我们感谢患者及其家属为本研究捐献切除的组织样本。我们谨向圣保罗大学里贝朗普雷图医学院附属临床医院的住院医师、护士、技术人员以及 CIREP 团队表示感谢，他们在研究过程的各个阶段提供了帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-丙醇 | Merck | 1096341000 | |
| 丙烯酰胺/双丙烯酰胺，30% 溶液 | Sigma Aldrich | A3449 | |
| 琼脂糖 | Sigma Aldrich | A9539 | |
| 过硫酸铵 | Sigma | A3678-25G | |
| 两性霉素 B | Gibco | 15290-018 | |
| 抗 ERK2 抗体（兔源） | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | 以含 2.5% BSA 的溶液按 1:1,000 稀释 |
| 抗 pERK 抗体（鼠源） | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | 以含 2.5% BSA 的溶液按 1:1,000 稀释 |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Bradford 1x 染色试剂 | BioRad | 500-0205 | |
| EDTA | Sigma | T3924 | 用于 RIPA 缓冲液 |
| 葡萄糖 | Merck | 108337 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Hank's 平衡盐溶液 | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| 盐酸 | Merck | 1003171000 | |
| 过氧化氢（H2O2） | Vetec | 194 | |
| 鼠 IgG，HRP 标记全抗体（抗小鼠） | GE | NA931-1ML | |
| NaCl | Merck | 1064041000 | 用于 RIPA 缓冲液 |
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| 脱脂奶粉（Molico） | Nestlé | 用于膜封闭 | |
| PBS 缓冲液 pH 7.2 | Laborclin | 590338 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma Aldrich | P4333 | |
| 氯化钾 | Merck | 1049361000 | |
| Prime Western Blotting 检测试剂 | GE | RPN2232 | |
| 兔 IgG，HRP 标记全抗体（抗兔） | GE | NA934-1ML | |
| SDS | Sigma | L5750 | 用于 RIPA 缓冲液 |
| TEMED | GE | 17-1312-01 | |
| 噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT） | Sigma Aldrich | M5655 | |
| Tris | Sigma | T-1378 | 用于 RIPA 缓冲液 |
| 吐温 X-100 | Sigma | X100 | 用于 RIPA 缓冲液 |
| 超纯水 | Millipore | 无菌水，来源于 MilliQ 水纯化系统 | |
| 仪器与材料 | |||
| 24 孔板 | Corning | CL S3526 | 平底带盖 |
| Amersham Potran Premium（硝酸纤维素膜） | GE | 29047575 | |
| 碳酰气混合气 | White Martins | 95% O2，5% CO2 | |
| CO2 培养箱 | New Brunswick Scientific | CO-24 | 切片孵育条件：5% CO2，36ºC |
| 酶标仪 | Molecular Devices | ||
| 微量离心管 | Greiner | 001608 | 1.5 mL 微量离心管 |
| 电动研磨杵 | Kimble Chase | ||
| 塑料勺 | 大小相当于甜品勺 | ||
| 剃须刀片 | Bic | 铬铂金材质，用于振动切片机切片 | |
| 手术刀片 | Becton Dickinson (BD) | 编号 24 | 用于组织切片；建议使用相同或更小尺寸 |
| 超级胶水（Loctite Super Bonder） | Henkel | 成分：氰基丙烯酸乙酯；2-丙烯酸；6,6'-二叔丁基-2,2'-亚甲基二对甲酚；均聚物 | |
| 振动切片机 | Leica | 14047235612 - VT1000S | |
| 免疫组织化学所用材料/设备名称 | |||
| 抗 NeuN 抗体（鼠源） | Millipore | MAB377 | 以磷酸盐缓冲液按 1:1,000 稀释 |
| 抗 GFAP 抗体（鼠源） | Merck | MAB360 | 以磷酸盐缓冲液按 1:1,000 稀释 |
| 抗 Iba1 抗体（兔源） | Abcam | EPR16588 - ab178846 | 以磷酸盐缓冲液按 1:2,000 稀释 |
| 生物素标记抗小鼠 IgG 抗体（H+L） | Vector | BA-9200 | |
| DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
| Entellan | Merck | 107960 | |
| 乙醇 | Merck | 1.00983.1000 | |
| 明胶 | Synth | 00G1002.02.AE | 用于载玻片包被 |
| 切片机 | Leica | SM2010R | 配备冷冻台（BFS-10MP，Physiotemp），设定为 -40ºC |
| 正常驴血清 | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | 158127 | |
| 兔 IgG，HRP 标记全抗体（抗兔） | GE | NA934-1ML | |
| 载玻片（Star Frost） | Knittel Glaser | 明胶包被载玻片 | |
| 蔗糖 | Vetec | 60REAVET017050 | |
| Vectastain ABC HRP 试剂盒（过氧化物酶，标准型） | Vector | PK-4000, Kit Standard | |
| 二甲苯 | Synth | 01X1001.01.BJ |
参考文献
- Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
- Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophy....
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