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方法文章

成人脑组织短期游离式脑片培养

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DOI：

10.3791/59845

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2019年11月5日

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1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

本文内容

摘要

本文介绍了一种制备成人人类脑组织游离式脑片培养的实验方案。该方案是广泛使用的膜插件脑片培养法的一种改进，操作简便且成本较低，适用于开展旨在揭示与年龄相关脑疾病中神经退行性变机制的短期检测实验。

摘要

器官型（或称脑片）培养已被广泛用于在体外模拟中枢神经系统的部分功能。尽管脑片培养在神经科学研究中具有巨大潜力，但利用成年神经系统组织制备此类培养的研究仍然较少，尤其是来自人类受试者的组织。使用成年人类组织制备脑片培养特别有助于加深对人类神经病理机制的理解，因为这些组织具有成熟人脑特有的生物学特性，而这些特性在通常来源于啮齿类动物（尤其是新生个体）的脑片中并不存在。本实验方案描述了如何利用接受切除性脑手术的活体人类供体所获取的脑组织，制备短期、自由漂浮式脑片培养。文中还介绍了维持此类培养以及开展生化和细胞生物学检测的操作流程。代表性结果表明，在体外培养第4天（DIV4）时，人脑皮层典型的分层结构仍得以保留，并可观察到主要神经细胞类型的正常存在。此外，在受到毒性刺激（H2O2）时，DIV4的脑片表现出显著的细胞死亡，表明该模型可作为细胞死亡检测的有效平台。该方法相较于广泛使用的膜插件法更为简便且成本较低，主要推荐用于研究与年龄相关脑疾病背后的神经退行性机制的短期检测。最后，尽管本方案专注于使用因药物难治性颞叶癫痫接受手术治疗的患者所获取的皮层组织，但本文认为，来自其他脑区或病理状态的组织也可考虑作为制备类似自由漂浮脑片培养的来源。

引言

在研究中使用人类样本无疑是研究人类脑部病理的极佳选择，现代技术为利用患者来源组织进行可靠且符合伦理的实验开辟了新途径。诸如从成人脑组织制备的器官型/脑片培养等方法，已被越来越多地应用于光遗传学1、电生理学2,3,4,5、可塑性6,7,8,9、神经毒性/神经保护10,11,12,13、细胞治疗14、药物筛选15,16,17、遗传学与基因编辑12,18,19,20等多种研究范式中，作为更深入理解成年期神经系统疾病的重要策略。

理解人类脑部疾病机制依赖于需要大量受试者的实验策略。相比之下，在脑片培养的情况下，尽管获取人类样本仍然困难，但单个皮质样本可制备多达50个脑片，从而通过增加每个采集组织的重复次数和检测数量，部分克服了需要招募多名志愿者的限制21。

已有多种关于脑类器官/脑片培养的实验方案被报道，包括经典的ocular drafts22,23、滚筒培养管法24,25,26、半透膜界面法27,28,29,30以及游离漂浮式脑片培养法31,32。根据实验设计的具体需求，每种技术各有其优缺点。在某些情况下，采用来自成人人类大脑的短期游离漂浮式脑片培养，相较于Stoppini等人27所使用的方法更具优势；因为尽管在评估培养方法时，细胞在体外的长期存活通常是一个主要关注点，但在许多实验中，仅需较短时间的培养即可满足需求12,31,32,33,34,35。在此类条件下，游离漂浮式培养的优势在于操作更简便、成本更低，且相较于在培养中维持2至3周以上的脑片，更能准确地模拟原始人类脑组织的状态。

尽管脑片培养在神经科学领域具有巨大潜力，但利用成年神经系统组织制备此类培养的研究仍然较少，尤其是在人类受试者中。本文介绍了一种利用接受切除性脑手术的活体人类供体所获取的脑组织来制备自由漂浮脑片培养的实验方案。文中详细描述了维持培养以及利用这些脑片进行生物化学和细胞生物学检测的操作步骤。该方案已被证实对于分析与成年期相关神经病理机制研究中的细胞活力和神经元功能具有重要价值。

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方案

用于实验的活体成人脑组织来自接受切除性神经外科手术治疗药物难治性颞叶癫痫的患者（图1A）。所有操作均经巴西圣保罗大学里贝朗普雷图医学院附属临床医院伦理委员会批准（编号：17578/2015），患者（或其法定监护人）均已知情并签署知情同意书。脑组织由巴西圣保罗大学里贝朗普雷图医学院附属临床医院癫痫外科中心（CIREP - Clinics Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Brazil）的神经外科团队采集。

1. 材料的灭菌

注意：所有材料和溶液在使用前必须灭菌。

  1. 将所有手术器械和振动切片机切片材料（刀片夹具、样本盘、缓冲液托盘）在干热灭菌器中于 180 °C 灭菌 4 小时。
  2. 对温度敏感的材料或设备，采用紫外线或γ射线照射进行灭菌。
  3. 培养基和溶液通过高压灭菌或经 0.22 µm 孔径滤膜过滤灭菌。

2. 溶液的配制

  1. 配制15–20 mL运输液：50% v/v Hank's平衡盐溶液（HBSS），pH 7.4，50% v/v用于维持出生后及成年脑神经元的基礎培养基（材料表），添加10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（Hepes）、3 mg/mL葡萄糖和33 µg/mL庆大霉素。
    注意：运输液必须在样本采集前至少冷藏并充氧（以碳合气鼓泡）20分钟。
  2. 配制300 mL切片液（在HBSS中添加10 mM HEPES和3 mg/mL葡萄糖），并将其置于冰箱中冷却至初现结晶状态。
  3. 配制20 mL培养基：用于维持出生后及成年脑神经元的基礎培养基（材料表），添加1% L-谷氨酰胺衍生物（材料表）、2%神经细胞培养添加剂（材料表）、1%青霉素/链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B。

3. 设置切片装置

注意：由于手术室内样本采集的操作复杂性，建议在同事协助下进行本方案。

  1. 在装有加盐冰块的容器中，将切片液置于碳酰气混合物（95% O2，5% CO2）持续通气条件下孵育至少 20 分钟，再投入使用。
  2. 制备一块 3% 琼脂糖块（约 2 cm × 2 cm × 2 cm），并用瞬干胶将其粘附于振动切片机的样品盘上，以便在切片过程中为组织样本提供额外的机械支撑（图 1E）。
  3. 设置振动切片机的切片参数：切片厚度为 200 µm，振动频率为 100 Hz，切片速度为 0.5–1.0 mm/s。
  4. 将振动切片机的缓冲液托盘固定至切片机底座，并加入冰块，以确保在加入切片液和样本前以及整个切片过程中保持低温状态。

4. 样本采集

注意：在本方案中，人新皮质组织在手术室采集后被运送至实验室。

警告：处理人类样本时，应遵循机构制定的适当安全规程。

  1. 设置运输装置（图1C），该装置包括：一个装有碳氧混合气体的便携式气瓶，连接至压力/流量阀，用于控制气体输出，并通过硅胶管将气体输出端连接至运输容器；一个运输容器，通常为带有穿孔盖子的50 mL锥形离心管，用于气体输入，内含运输溶液；以及用于运输过程中样品冷却的冰。
  2. 立即采集并运送样本（图1B）至实验室。将样本浸入冰冷的运输溶液中（持续用碳氧混合气体鼓泡）。

5. 切片

  1. 将样本转移至含有切片液的培养皿（100 mm × 20 mm）中，并使用精细的外科工具小心地尽可能去除样本中残留的脑膜（图1D）。
  2. 根据实验设计所需的特定特征，选择最佳的样本取向，并使用24号手术刀片修整出一个平坦的表面，作为粘附于样本盘上的底面。
  3. 使用一次性塑料勺和精细的画笔从培养皿中取出组织碎片，并用滤纸吸去多余的液体（通过毛细作用干燥，避免滤纸直接接触组织碎片）。
  4. 使用速干胶将组织固定在振动切片机的样本盘上，确保组织牢固粘附于盘面并与琼脂糖块接触（图1E）。
  5. 将已正确固定组织的振动切片机样本盘放入盛有切片液的缓冲槽中，切片液在整个过程中必须持续通气鼓泡。
  6. 将刀架固定到位，并确保剃刀刀片牢固安装。
  7. 切片液必须完全覆盖样本和刀片后，方可开始切片（图1F）。
  8. 将样本切成200 µm厚的切片。
    注意：尽管某些振动切片机能自动完成切片，但在切片过程中密切观察并微调切片速度有助于获得更高质量的切片。弃去最初不规则的切片。
  9. 将切片从缓冲槽转移至盛有切片液的培养皿中，修剪松散的边缘和多余的白质，使皮质与白质的比例约为70%∶30%。

6. 培养

注意：此步骤需在层流柜内的无菌环境中进行。

  1. 在24孔板中每孔加入600 µL培养基，在接种组织切片前，于36 °C、5% CO2条件下孵育至少20分钟。
  2. 使用画笔将一个组织切片接种至每孔中（图1G）。
  3. 若培养板中有未使用的孔，请向其中加入400 µL无菌水。
  4. 将培养板置于36 °C、5% CO2条件下孵育。
    注意：首次更换培养基的时间应在接种后8–16小时之间，具体时间取决于组织切片的大小。
  5. 向先前配制的10 mL培养基中添加脑源性神经营养因子（BDNF），使其终浓度为50 ng/mL。
    注意：在最初的8–16小时内，每孔使用600 µL培养基进行孵育，以避免营养耗竭和酸化，因为此阶段培养基消耗速度较快。从下一步开始，每孔培养基体积调整为400 µL。
  6. 从每孔中移除333 µL用过的培养基，并加入133 µL新鲜的含BDNF培养基。
  7. 此后每隔24小时重复换液操作，每次更换三分之一体积的用过的培养基，补充等量的新鲜含BDNF培养基。

7. 评估培养切片的健康状态、形态和功能

注意：为了在代表性结果中示例性地诱导细胞死亡，某些切片接受了24小时的氧化应激诱导剂H2O2处理。步骤7.1.2和7.1.3描述了使用H2O2诱导细胞死亡的方法。

  1. 细胞活力
    注意：评估受刺激脑片培养物中神经毒性/神经保护作用的一种简单直接的方法是采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法36，该方法通过比较处理样本与正常条件下代谢活跃细胞的百分比来进行检测。
    1. 在超净工作台中，更换三分之一的培养基为新鲜培养基。
    2. 从30% H2O2储备液中，向每孔加入适量H2O2，以达到预定的终浓度（30 mM或300 mM）。
      注意：H2O2在每日更换培养基后添加，以确保在施加刺激前提供充足的营养供应。
    3. 将培养板在36 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
      注意：在H2O2处理（或其他感兴趣的毒性刺激）后，以下步骤描述了通过MTT法测定细胞活力的过程。
    4. 向每孔加入40 µL MTT溶液，使其终浓度为0.5 mg/mL。
    5. 将培养板在36 °C、5% CO2条件下孵育3小时。
    6. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤脑片，并转移至微量离心管中。
    7. 用移液器小心吸除残留液体。
    8. 称量含有脑片的微量离心管，以确定每个脑片的质量（这对归一化吸光度读数至关重要）。
      注意：如有需要，样本在此阶段可冷冻保存（-20 °C），以备后续处理。
    9. 使用电动研磨杵在200 µL异丙醇/HCl中匀浆脑片。
    10. 在室温（RT）下以2600 × g离心2分钟。
    11. 收集上清液，并在540 nm处测定吸光度。
  2. KCl诱导的神经元去极化
    注意：通过Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路蛋白ERK的磷酸化水平，可用于定量分析神经元对KCl诱导去极化的反应37。
    1. 在超净工作台中，将培养基替换为300 µL预先平衡至36 °C的HBSS。
    2. 将HBSS替换为300 µL预先平衡至36 °C的新鲜HBSS。
    3. 将培养板在36 °C、5% CO2条件下孵育15分钟。
    4. 将HBSS替换为300 µL新鲜HBSS或80 mM KCl去极化溶液（均预热至36 °C），并在36 °C、5% CO2条件下继续孵育15分钟。
    5. 将脑片从培养板转移至微量离心管中。此步骤中，脑片可在-20 °C下保存，以备后续处理。
    6. 用150 µL放射免疫沉淀裂解缓冲液（RIPA缓冲液：50 mM Tris-HCl；150 mM NaCl；1 mM EDTA；1%非离子型表面活性剂；0.1%十二烷基硫酸钠；pH 7.5）制备组织提取物。在4 °C下以16000 × g离心10分钟，收集上清液，并采用Bradford法测定总蛋白浓度。
    7. 将30 µg总蛋白上样至12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶中。
    8. 电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。
    9. 用含5%脱脂奶粉和0.1% Tween的TBS封闭膜后，在4 °C下与鼠抗-pERK抗体（1:1,000）孵育16小时。洗涤后，在室温下与兔抗-ERK1/2抗体（1:1,000）孵育2小时。
    10. 在室温下与相应的HRP标记二抗孵育1小时。
    11. 使用合适的HRP底物显色。
  3. 形态学评估
    注意：除细胞存活率和功能评估外，分析组织形态同样重要。需注意，对培养脑片进行再切片是获得尽可能多高质量材料用于形态学分析的关键步骤。
    1. 脑片的固定、冷冻保护与再切片
      1. 将含培养基的孔中脑片转移至含有PBS的新24孔板中。
      2. 吸除PBS，加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA）。在加入PFA前应确保脑片保持平整。在4 °C下过夜孵育。
      3. 小心吸除PFA溶液，加入1 mL 30%蔗糖溶液。在4 °C下孵育48小时。
      4. 将冷冻切片机设定为-40 °C。
      5. 在切片机载物台上制备蔗糖基底，用于放置脑片（图2A）。待其完全冻结后，小心切去部分冻结的蔗糖，形成一个平整表面以放置脑片。
      6. 将每片脑片置于拉伸的塑料膜上，并用画笔将组织展平。
      7. 将展平的脑片一次性转移至冻结的蔗糖基底上。
        注意：脑片一旦接触冻结的蔗糖基底便无法再移动。此转移步骤需谨慎操作。
      8. 让脑片静置5–10分钟，使其充分冻结。
      9. 将脑片切成30 µm厚的切片。
      10. 将30 µm切片转移至含有PBS的培养皿中。
      11. 根据实验设计选择最合适的组织学流程进行后续操作。
        注意：30 µm切片可直接用于漂浮免疫组织化学染色，或贴附于载玻片上进行进一步组织学分析，或保存于防冻液中（-20 °C）。
    2. 免疫组织化学
      注意：不同实验室的免疫组织化学和免疫荧光标准操作流程可能有所不同。本实验所用方案的详细版本可参见Horta等人的研究38。用于图2中免疫染色的主要抗体包括：神经元核抗原（NeuN，成熟健康神经元标志物）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，星形胶质细胞标志物）、钙结合蛋白离子化（Iba-1，小胶质细胞标志物）。
      1. 将脑片在封闭液（如含2%正常驴血清的PBS）中孵育40分钟。
      2. 在4 °C、轻度振荡条件下与一抗过夜孵育。
      3. 用PBS洗涤后，在室温下轻度振荡条件下与生物素标记的二抗孵育120分钟。
      4. 用PBS洗涤后，在室温下与亲和素-过氧化物酶偶联物孵育120分钟（材料表）。
      5. 使用DAB + 0.04%硫酸镍铵显色。
      6. 将染色切片贴附于明胶包被的显微镜载玻片上，自然晾干。经乙醇脱水、二甲苯透明，最后用封片剂（材料表）封片，加盖盖玻片并成像。

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结果

评估培养脑片质量和健康状况的一个关键方面是观察预期的神经细胞类型（包括神经元和胶质细胞）是否存在及其典型形态。在体外培养第4天（DIV4）的脑片中，通过神经元免疫标记观察到人脑皮层典型的分层结构（图2D）。此外，也观察到了小胶质细胞和星形胶质细胞的预期存在（图2B,C）。这些结果表明，无论是手术取材/样本处理过程，还是短期体外培养，均未对组织结构造成显著影响。与先前研究结果一致，NeuN免疫反应性在DIV0与DIV4之间未发生明显改变32。根据这些结果，游离式培养方式结合脑片厚度减少至200 µm（相较于使用膜插件时常用的300–400 µm），有助于氧气和营养物质更好地扩散至脑片内部细胞层，而这一点此前已被证明对维持培养脑片的健康至关重要39,40。

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讨论

本方案提供了一种制备游离式短期脑片培养的替代方法，适用于成人人类新皮层脑片的培养。该脑片培养方案可用于（但不限于）光遗传学1,44,45、电生理学2,3,4,5、短期可塑性46,47、长期可塑性48,49、神经毒性/神经保护10,11,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到圣保罗研究基金会（FAPESP，资助号 25681-3/2017，授予 A.S.）、巴西高等教育人员改善协调机构（CAPES，授予 A.F. 的博士后奖学金 PNPD/INCT-HSM 及授予 N.D.M. 的博士前奖学金）以及法埃帕（FAEPA）的支持。G.M.A. 获得圣保罗研究基金会（FAPESP，硕士奖学金 2018/06614-4）的资助。N.G.C. 持有巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）研究奖学金。我们感谢患者及其家属为本研究捐献切除的组织样本。我们谨向圣保罗大学里贝朗普雷图医学院附属临床医院的住院医师、护士、技术人员以及 CIREP 团队表示感谢，他们在研究过程的各个阶段提供了帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-丙醇Merck1096341000
丙烯酰胺/双丙烯酰胺，30% 溶液Sigma AldrichA3449 
琼脂糖Sigma AldrichA9539
过硫酸铵SigmaA3678-25G
两性霉素 BGibco15290-018
抗 ERK2 抗体（兔源）Santa Cruz Biotecnologysc-154以含 2.5% BSA 的溶液按 1:1,000 稀释
抗 pERK 抗体（鼠源）Santa Cruz Biotecnologysc-7383以含 2.5% BSA 的溶液按 1:1,000 稀释
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
牛血清白蛋白Sigma AldrichA7906
Bradford 1x 染色试剂BioRad500-0205
EDTASigmaT3924用于 RIPA 缓冲液
葡萄糖Merck108337
GlutamaxGibco35050-061
Hank's 平衡盐溶液Sigma AldrichH1387-10X1L
HEPESSigma AldrichH4034
盐酸Merck1003171000
过氧化氢（H2O2）Vetec194
鼠 IgG，HRP 标记全抗体（抗小鼠）GENA931-1ML
NaClMerck1064041000用于 RIPA 缓冲液
Neurobasal AGibco10888-022
脱脂奶粉（Molico）Nestlé用于膜封闭
PBS 缓冲液 pH 7.2Laborclin590338
青霉素/链霉素Sigma AldrichP4333
氯化钾Merck1049361000
Prime Western Blotting 检测试剂GERPN2232
兔 IgG，HRP 标记全抗体（抗兔）GENA934-1ML
SDSSigmaL5750用于 RIPA 缓冲液
TEMEDGE17-1312-01
噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT）Sigma AldrichM5655
TrisSigmaT-1378用于 RIPA 缓冲液
吐温 X-100SigmaX100用于 RIPA 缓冲液
超纯水Millipore无菌水，来源于 MilliQ 水纯化系统
仪器与材料
24 孔板CorningCL S3526平底带盖
Amersham Potran Premium（硝酸纤维素膜） GE29047575
碳酰气混合气White Martins95% O2，5% CO2
CO2 培养箱New Brunswick ScientificCO-24切片孵育条件：5% CO2，36ºC
酶标仪Molecular Devices
微量离心管Greiner0016081.5 mL 微量离心管
电动研磨杵Kimble Chase
塑料勺大小相当于甜品勺
剃须刀片Bic铬铂金材质，用于振动切片机切片
手术刀片Becton Dickinson (BD)编号 24用于组织切片；建议使用相同或更小尺寸
超级胶水（Loctite Super Bonder）Henkel成分：氰基丙烯酸乙酯；2-丙烯酸；6,6'-二叔丁基-2,2'-亚甲基二对甲酚；均聚物
振动切片机 Leica14047235612 - VT1000S
免疫组织化学所用材料/设备名称
抗 NeuN 抗体（鼠源）Millipore MAB377以磷酸盐缓冲液按 1:1,000 稀释
抗 GFAP 抗体（鼠源）MerckMAB360以磷酸盐缓冲液按 1:1,000 稀释
抗 Iba1 抗体（兔源）AbcamEPR16588 - ab178846以磷酸盐缓冲液按 1:2,000 稀释
生物素标记抗小鼠 IgG 抗体（H+L）VectorBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
EntellanMerck107960
乙醇Merck1.00983.1000
明胶Synth00G1002.02.AE用于载玻片包被
切片机LeicaSM2010R配备冷冻台（BFS-10MP，Physiotemp），设定为 -40ºC
正常驴血清Jackson Immuno Research017-000-121
多聚甲醛Sigma Aldrich158127
兔 IgG，HRP 标记全抗体（抗兔）GENA934-1ML
载玻片（Star Frost）Knittel Glaser明胶包被载玻片
蔗糖Vetec60REAVET017050
Vectastain ABC HRP 试剂盒（过氧化物酶，标准型）VectorPK-4000, Kit Standard
二甲苯Synth01X1001.01.BJ

参考文献

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