该方法旨在通过将哺乳动物肿瘤细胞异种移植到血管带有荧光标记的斑马鱼胚胎中，建立体内肿瘤血管生成模型。通过成像观察异种移植的肿瘤及其相关血管，可定量评估血管生成反应。
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本文内容
摘要
摘要
肿瘤血管生成是抗癌治疗的关键靶点，本方法旨在提供一种新的体内研究该过程的模型。通过将哺乳动物肿瘤细胞植入受精后两天的斑马鱼胚胎的卵黄周隙，随后在移植后最多两天的实验终点观察并测量血管生成反应的程度，从而建立斑马鱼异种移植模型。该方法的主要优势在于能够精确量化斑马鱼宿主对移植物的血管生成反应，从而深入分析参与该反应的分子机制以及宿主与肿瘤各自所起的作用。移植后的胚胎可接受多种处理，例如与潜在的抗血管生成药物共孵育，以研究抑制肿瘤血管生成的策略。此外，还可对血管生成反应进行活体成像，以观察更为动态的细胞过程。由于实验技术相对简便、斑马鱼维护成本低廉且实验周期短，该模型在开发调控肿瘤血管生成策略方面具有重要应用价值。
引言
血管生成是癌症的经典特征之一，也是抗癌治疗的靶点1,2。为了研究这一过程，已通过将哺乳动物肿瘤细胞植入小鼠等动物体内建立了癌症异种移植模型3。此外，还开发了斑马鱼异种移植模型，该模型将肿瘤细胞植入受精后2天（dpi）的斑马鱼体内，可导致斑马鱼血管迅速向异种移植物内生长4。
本方案描述了一种体内斑马鱼胚胎肿瘤异种移植模型，可对整个异种移植区域的血管生成反应进行精确定量。该方法使研究者能够在体内检测肿瘤血管生成反应背后的分子机制。斑马鱼的遗传可操作性使得宿主对血管生成的贡献可以被探究，而选择不同的肿瘤细胞系则可同时研究肿瘤自身对血管生成的作用5,6,7。此外，由于斑马鱼幼体对小分子具有通透性，因此可使用特定信号通路抑制剂，或通过药物文库筛选，以鉴定新型的肿瘤血管生成抑制剂8,9,10,
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方案
1. 显微注射针的制备
- 打开微电极拉制仪，并设置以下参数（已针对材料表中所列的微电极拉制仪型号进行校准）：加热值 680；拉力 75；速度 40；时间 55；气压：530。
- 将一根硼硅酸盐玻璃毛细管固定在微电极拉制仪上，拉制毛细管以制成两根针状电极。根据需要重复此步骤以制备更多电极。
2. 用于移植的细胞培养
注意：使用本实验方案时，可将任何哺乳动物癌细胞系植入斑马鱼胚胎中作为异种移植。然而，不同细胞系所诱导的血管生成反应存在较大差异5,11,12。已有研究表明，B16-F1 小鼠黑色素瘤细胞可在斑马鱼胚胎中诱导强烈的血管生成反应11，因此适用于本方案。
- 在37 °C条件下，使用添加了胎牛血清（FBS）至终浓度10%（v/v）以及青霉素/链霉素（每种抗生素终浓度均为100 μg/mL）的MEM-α培养基，在75 cm2培养瓶中培养B16-F1细胞。
- 从95–100%融合度的75 cm2
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结果
通过在接种后6、24和48小时对单个异种移植瘤进行成像，可计算不同时相点的血管生成反应，如图1A-C所示。在接种后24至48小时观察到最强的血管生成反应，移植物血管化水平在接种后约2天达到峰值（图1A-C）。从接种后20.75小时至46小时，典型B16-F1异种移植瘤血管生成反应的时间推移视频见补充视频1。该视频通过对按照本方案接种至2天龄kdrl:EGFP胚胎中的异种移植瘤进行成像生成。穿过异种移植瘤生长的血管形成扭曲的网络结构，血管尺寸与形态不规则，这是哺乳动物肿瘤中异常血管网络的典型特征20。本模型中的血管生成反应源于共同主静脉向异种移植瘤出芽的血管，而此前研究报道的血管来源为肠下静脉4。血管来源的差异是由于我们将异种移植瘤植入卵黄周腔.......
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讨论
该实验方案的第一步关键操作是肿瘤细胞的移植。必须将细胞注射到一个合适的位置，以确保异种移植瘤能够在胚胎中成功植入，同时避免引起胚胎水肿。若注射位置过于靠前，细胞可能移向心脏，阻塞血流并导致水肿；而注射位置过于靠后，则会导致异种移植瘤植入不良。为避免前部注射，建议将注射针从前向后穿过卵黄囊，使针尖在注射时朝向远离心脏的方向。为避免后部注射，应将细胞注入卵黄囊圆形区域前半部分的适当位置。此外，细胞必须注射在卵黄囊腹侧而非侧方，因为侧方位置较难观察和后续成像。当研究人员对该操作较为熟练后，每天可完成约200至300枚胚胎的异种移植。由于样品安装和成像耗时较长，血管生成反应的成像过程所需时间更多；使用标准激光扫描共聚焦显微镜，大约需要一小时才能完成15至20个异种移植样本的成像。
第二个关键步骤是使用3D图像分析软件测量移植物的血管化。需要通过肿瘤体积进行定量，因为通过显微注射难以获得大小一致的异种移植瘤。必须仔细校准软件协议的设置，并在所有实验中保持一致使用，以获得准确且无偏倚的定量结果。设定荧光强度的最低阈值（针对肿瘤体积和肿瘤血管体积）是该步骤的重要组成部分，因为它使方案能够正确区分.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Alhad Mahagaonkar先生对奥克兰大学斑马鱼设施的管理，以及奥克兰大学医学院生物医学影像研究单元在延时共聚焦显微镜技术方面的协助。本研究得到了新西兰卫生研究理事会项目资助（14/105）、新西兰皇家学会Marsden基金项目资助（UOA1602）和奥克兰医学研究基金会项目资助（1116012）的支持，以上资助均授予J.W.A.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 空气压缩缸 | BOC | 011G | 异种移植 |
| B16-F1 细胞 | ATCC | 细胞培养 | |
| BD Matrigel LDEV-无（细胞外基质混合物） | Corning | 356235 | 异种移植 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Warner Instruments | G100T-4 | 外径 = 1.00 mm，内径 = 0.78 mm，长度 = 10 cm，用于细胞注射 |
| 细胞培养皿，直径 35 mm | Thermofisher NZ | NUN153066 | 鱼类饲养 |
| 细胞培养皿，直径 100 mm | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | 鱼类饲养 |
| 细胞培养瓶，75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | 细胞培养 |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | 细胞标记，储存浓度（10 mM 溶于 DMSO），工作浓度（0.2 μM 溶于无血清培养基） |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D8418 | 药物处理，细胞标记 |
| E3 培养基（60 倍浓缩液，溶于 2 L 水中） 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O，用 NaOH 调节 pH 至 7.2 | 实验室自制 [1] | 鱼类饲养 | |
| 乙基-3-氨基苯甲酸甲酯甲磺酸盐（Tricaine） | Sigma-Aldrich | E10521 | 异种移植，成像 |
| 滤芯吸头，1,000 μL | VWR | 732-1491 | 多个步骤中使用 |
| 滤芯吸头，200 μL | VWR | 732-1489 | 多个步骤中使用 |
| 滤芯吸头，10 μL | VWR | 732-1487 | 多个步骤中使用 |
| 荧光显微镜 | Leica | MZ16FA | 胚胎制备 |
| 胎牛血清（新西兰来源） | Thermofisher Scientific | 10091148 | 细胞培养 |
| 手套 | 任意商业品牌 | 多个步骤中使用 | |
| 血细胞计数板（改进型 Neubauer 计数室） | HawksleyVet | AC1000 | 异种移植 |
| Heraeus Multifuge X3R 离心机 | Thermofisher Scientific | 75004500 | 细胞培养，细胞标记 |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | 细胞标记，储存浓度（1 mg/ml 溶于 DMSO），工作浓度（6 μg/ml 溶于无血清培养基） |
| 低熔点超纯琼脂糖 | Thermofisher Scientific | 16520050 | 成像 |
| 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | 异种移植 |
| 亚甲蓝 | Sigma-Aldrich | M9140 | 鱼类饲养 |
| Microloader 0.5-20 μL 加样吸头（用于填充微毛细管） | Eppendorf | 5242956003 | 异种移植 |
| 微量移液器 | 任意商业品牌 | 多个步骤中使用 | |
| 微电极拉制仪 P-87 | Sutter Instruments | 异种移植 | |
| 显微镜培养箱 | Okolab | 延时成像 | |
| 微波炉 | 任意商业品牌 | 成像 | |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | M3516 | 异种移植 |
| 最低必需培养基（MEM）-α | Thermofisher Scientific | 12561056 | 细胞培养 |
| MPPI-2 压力注射仪 | Applied Scientific Instrumentation | 异种移植 | |
| Narishige 显微操作器 | Narishige Group | 异种移植 | |
| Nikon D Eclipse C1 共聚焦显微镜 | Nikon | 成像 | |
| N-苯基硫脲（PTU） | Sigma-Aldrich | P7629 | 鱼类饲养 |
| PBS | Gibco | 10010023 | 细胞培养 |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140122 | 细胞培养 |
| S1 移液器辅助器 | Thermoscientific | 9501 | 细胞培养 |
| 血清移液管，10 mL | Corning | 4488 | 细胞培养 |
| 血清移液管，25 mL | Corning | 4489 | 细胞培养 |
| 血清移液管，5 mL | Corning | 4485 | 细胞培养 |
| 血清移液管，2 mL | Corning | 4486 | 细胞培养 |
| Terumo 针头，22 G | Amtech | SH 182 | 鱼类饲养 |
| 组织培养箱 | Thermofisher Scientific | HeraCell 150i | 细胞培养 |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | 药物处理 | |
| 移液管，3 mL | Mediray | RL200C | 鱼类饲养 |
| 胰蛋白酶/EDTA (0.25%) | Life Technologies | T4049 | 细胞培养 |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11295-10 | 鱼类饲养 |
| Volocity 软件 (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | 图像分析 |
参考文献
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Rese....
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重印与许可
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