小鼠小肠上皮内淋巴细胞的活体成像

摘要

我们介绍了一种利用倒置旋转盘共聚焦显微镜对小鼠小肠进行活体成像，以观察表达GFP标记的γδ上皮内淋巴细胞（γδ IELs）的方法。该技术可实现对黏膜内活细胞长达4小时的动态追踪，可用于研究多种肠道免疫细胞与上皮细胞之间的相互作用。 

摘要

表达γδ T细胞受体的上皮内淋巴细胞（γδ IEL）在肠道上皮的免疫监视中发挥关键作用。部分由于γδ T细胞受体缺乏明确的配体，目前对γδ IEL活化调控机制及其在体内功能的理解仍然有限。这促使人们需要开发替代策略，以探究调控γδ IEL功能的信号通路以及这些细胞对局部微环境的响应能力。尽管普遍认为γδ IEL可限制病原体的易位，但活体成像技术的应用对于理解稳态条件下以及应对侵袭性病原体时IEL与上皮细胞相互作用的时间-空间动态至关重要。本文中，我们介绍了一种利用倒置转盘共聚焦激光显微镜对GFP标记的γδ T细胞报告小鼠小肠黏膜中IEL迁移行为进行可视化观察的实验方案。尽管该方法的最大成像深度相较于双光子激光扫描显微镜有所局限，但转盘共聚焦激光显微镜具有高速图像采集、光漂白和光损伤更少的优势。通过使用4D图像分析软件，可在实验干预后分析T细胞的监视行为及其与邻近细胞的相互作用，从而进一步揭示IEL在肠黏膜中的活化机制与功能特性。

引言

上皮内淋巴细胞（IEL）位于肠上皮内，分布在基底膜以及相邻上皮细胞之间的侧向细胞间隙中¹。每5–10个上皮细胞中约有一个IEL；这些IEL作为哨兵细胞，对广阔的肠上皮屏障进行免疫监视²。表达γδ T细胞受体（TCR）的IEL可占小鼠小肠总IEL群体的60%。在缺乏γδ T细胞的小鼠模型中的研究表明，这些细胞在应对肠道损伤、炎症和感染时具有显著的保护作用^3,4,5。尽管已成功构建Tcrd基因敲除小鼠模型⁶，但由于尚未明确γδ TCR所识别的配体，目前对γδ IEL生物学特性的理解仍十分有限⁷。因此，由于缺乏研究该细胞群体的有效工具，人们难以探究γδ TCR在生理和病理条件下激活及其功能的具体机制。为填补这一空白，我们开发了活体成像技术，用于可视化观察γδ IEL的迁移行为及其与邻近肠上皮细胞的相互作用，从而进一步揭示γδ IEL在体内对外界刺激的功能响应特性。

在过去十年中，活体成像技术极大地拓展了我们对肠道生物学多个方面所涉及的分子事件的理解，包括上皮细胞脱落

方案

所有研究均在经国际实验动物评估和认可委员会（AALAC）认证的设施中进行，并遵循罗格斯新泽西医学院比较医学资源部门批准的方案。

1. 小鼠准备

注意：以下操作步骤，包括动物准备和手术，将耗时30–40分钟。手术前，请打开显微镜，并将显微镜上的封闭式培养箱预热至37 °C。

1. 使用8至10周龄、背景为C57BL/6的TcrdEGFP小鼠进行实验，该小鼠由法国巴黎INSERM的Bernard Malissen提供。根据IACUC批准的操作规程，根据动物体重通过腹腔注射给予氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。通过呼吸频率（55–65次/分钟）²¹、脚趾夹捏反应及眼睑反射评估麻醉深度。
2. 当达到外科手术麻醉水平后，用胶带将小鼠后肢固定在加热垫上以维持体温，并可通过直肠温度计监测体温。若出现麻醉减退迹象（如呼吸频率增加、眨眼和/或眼睑反射引起的眼肌抽搐），则每次追加注射50 μL氯胺酮/赛拉嗪混合液，直至小鼠完全镇静。
3. 通过将50 µL Hoechst 33342（10 mg/mL）与315 µL 0.9%生理盐水混合配制核染料；根据小鼠体重，最终剂量为37.5 mg/kg（注射体积约为200 µL）。小鼠麻醉成功后，使用结核菌素注射器缓慢经眶后静脉窦注射Hoe....

结果

通过活体成像技术观察TcrdEGFP报告小鼠，我们先前已发现γδ型肠上皮内淋巴细胞（γδ IELs）表现出动态的监视行为：在稳态条件下，这些细胞沿基底膜迁移并进入侧向细胞间间隙（LIS），在上皮层中进行巡逻（图2，视频1）。

该方法还可用于评估特定细胞信号通路和/或受体的抑制如何影响γδ上皮内淋巴细胞（γδ IEL）的迁移行为。例如，白细胞介素（IL）-15是一种多效性细胞因子，对γδ IEL的稳态至关重要^23,24。为了确定通过IL-2Rβ受体的IL-15信号传导是否影响稳态下γδ IEL运动的动力学特征，我们在给予抗IL-2Rβ抗体（TM-β1）或同型IgG2b对照抗体后2小时，对TcrdEGFP报告小鼠进行了成像。彩色轨迹表示单个γδ IEL在30分钟内的迁移路径（图3A）。尽管在TM-β1处理的小鼠中，固有.......

讨论

活体显微技术的发展为观察难以接近的组织中亚细胞结构的重组^8,9,22、细胞间相互作用^12,25以及细胞迁移行为^{13,14,15,16,26}提供了前所未有的机会。长期以来，缺乏有效的工具用于研究γδ型肠上皮内淋巴细胞（γδ IELs）在体内的调控机制与功能^18,27，而活体成像技术的应用则为探究IEL.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 培养皿，No. 1.5 盖玻片	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 肼	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide 皮下注射针头 - 27 G	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD Slip Tip 无菌注射器 - 1 mL	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD 结核菌素注射器	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
解剖剪刀	Thermo Fisher Scientific	08-940
电凝器	Thermo Fisher Scientific	50822501
封闭式培养孵育室	OKOLAB		显微镜
眼科针，尺寸 #3；1/2 圆弧，锥形尖端，12 mm 弦长	Roboz	RS-7983-3
Hank's 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris（v. 9.2.1），含 Start、Track、XT 模块	Bitplane		软件
倒置显微镜 DMi8	Leica		显微镜
IQ3（v. 3.6.3）	Andor		软件
氯胺酮	Putney		麻醉剂
Kimwipes 擦镜纸	VWR	21905-026
McPherson-Vannas 剪刀 3”（7.5 cm）长，5 × 0.15 mm 直头锐利	Roboz	RS-5600
不可吸收外科缝线，丝线卷，黑色编织	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent 镊子 4.25”（11 cm）长，弯头光滑，尖端 1.2 mm	Roboz	RS-5228
Puralube Vet 软膏	Dechra		润滑性眼用软膏
转盘式 Yokogawa CSU-W1，配备 63× 1.3 N.A. HC PLAN APO 甘油浸没物镜、iXon Life 888 EMCCD 相机、405 nm 二极管激光器、488 nm DPSS 激光器、640 nm 二极管激光器	Andor		共聚焦系统
赛拉嗪	Akorn		麻醉剂