无需抗体的RNA甲基转移酶活性分析检测法

摘要

本文描述了一种无需抗体的体外检测方法，用于直接分析甲基转移酶在合成RNA或体外转录RNA上的活性。

摘要

目前已发现超过100种化学性质不同的RNA修饰，其中约三分之二为甲基化修饰。由于介导RNA修饰“书写”与“擦除”的酶在疾病和癌症相关的生物学过程中发挥重要作用，人们对RNA修饰、尤其是甲基化修饰的兴趣重新兴起。本文提供了一种灵敏的体外检测方法，可用于准确分析RNA甲基化“书写”酶在合成RNA或体外转录RNA上的活性。该方法采用氚标记的S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine），使甲基化的RNA直接被氚标记。由于氚辐射能量较低，该方法安全性高；同时，已有成熟的氚信号放大技术，使得无需使用易产生假象的抗体，即可对甲基化RNA进行定量和可视化检测。尽管本方法主要针对RNA甲基化，但稍加调整即可适用于其他可用放射性同位素标记的RNA修饰研究，例如利用¹⁴C标记的乙酰辅酶A检测RNA乙酰化。总体而言，该检测方法可快速评估RNA甲基化的反应条件、小分子抑制剂的抑制效果，或RNA及酶突变体的影响，为验证和拓展细胞实验结果提供了一种强有力的工具。

引言

DNA、RNA 和蛋白质都会发生修饰，这些修饰严格调控基因表达¹。在这些修饰中，甲基化可发生在上述三种生物大分子上。过去三十年中，DNA 和蛋白质的甲基化已被广泛研究。相比之下，近年来由于发现能够书写、擦除或识别 RNA 甲基化的蛋白质在发育和疾病中发挥重要作用，RNA 甲基化的研究才重新受到关注²。除了在丰度较高的核糖体 RNA 和转运 RNA 中具有较明确的功能外，RNA 甲基化通路还调控特定信使 RNA 的稳定性^3,4、剪接⁵以及翻译^6,7、miRNA 加工^8,9和转录暂停与释放^10,11。

本文报道了一种在分子生物学实验室条件下体外验证RNA甲基转移酶活性的简单且稳健的方法（总结见图1）。许多研究通过使用....

方案

1. 目标RNA的体外转录及凝胶纯化

1. 使用已建立的分子克隆技术¹²或试剂盒，将目标序列克隆至含有T7和/或SP6启动子的质粒中。
2. 为体外转录线性化DNA模板
   1. 使用特异性引物对质粒进行PCR扩增，获得目标序列，引物设计需包含T7启动子区域及插入片段上下游各+20–30 bp，具体方法如前所述¹³。
   2. 或者，根据限制性内切酶（RE）供应商提供的说明，使用插入片段下游存在的限制性内切酶切点消化5 µg质粒。
      注意：务必确认所选限制性内切酶不会切割插入片段。本步骤中限制性内切酶的选择会显著影响转录产物的产量。优先选择产生平末端或5'突出末端的限制性内切酶，以避免T7 RNA聚合酶在相反DNA链上发生模板转换¹⁴。若初始产量不足，可尝试不同的限制性内切酶。
3. 使用DNA琼脂糖凝胶提取与纯化试剂盒纯化所得DNA，用30 µL水洗脱DNA。
4. 涡旋充分混匀，取1.5 µL用微量分光光度计测定DNA浓度。
5. 取250 ng DNA，在1x TBE缓冲液中进行1%琼脂糖凝胶电泳（4 V/cm，1小时），以检测纯化后DNA的质量和大小。
6. 解冻体外转录试剂盒中的冷冻试剂。将T....

结果

体外转录反应
图2A 展示了使用T7 RNA聚合酶对7SK snRNA进行体外转录反应的典型结果。7SK snRNA是一种相对较短（331个核苷酸）且具有高度结构的RNA。如该原始图像所示，除7SK条带外还存在多个长短不一的非特异性条带，可能源于随机的转录起始或终止事件。因此，在体外转录反应后进行凝胶纯化至关重要，以获得纯净的RNA样品，如图2B所示。此时，可通过目标RNA在分子量标记（ladder）中的相对位置进行鉴定，并通过凝胶纯化进行回收。

如前所述，在凝胶纯化步骤之前，可能需要优化转录反应的时间。转录反应时间过长可能导致RNA产量极高，从而难以在后续步骤中识别正确的转录产物。此外，还应使用特异性引物通过逆转录定量PCR（RTqPCR）验证纯化后转录产物的身份。

体外RNA甲基转.......

讨论

本文报道了一种简单且可靠的体外验证RNA甲基转移酶对特定转录本活性的方法。该检测方法利用了S-腺苷甲硫氨酸的甲基供体位置可被氚标记的特性（图1），从而无需使用抗体即可准确检测甲基化的RNA。然而需要注意的是，该方法无法确定酶催化甲基化修饰的具体残基或化学基团。若要鉴定或验证某一特定残基是否被甲基化，可将RNA甲基转移酶检测方法与突变分析、逆转录阻滞或RNA底物的质谱分析等其他技术联合使用。

RNA 的选择及其合成方式取决于 RNA 的大小。长度在 18 到 120 个核苷酸之间的特定 RNA 可以方便地从多家知名的核酸供应商处进行定制合成。然而，更常见的情况是通过体外转录来制备不同大小的特定 RNA。用于体外转录的 DNA 模板可通过多种方式获得，且需要将目标序列置于 T7 或 SP6 启动子的下游。当 RNA 的精确末端至关重要时，建议使用 pRZ 质粒¹⁷。该检测方法具有高灵敏度（图 3），因此也可用细胞 RNA.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 bp DNA Ladder	Invitrogen	10821-015	10 bp DNA Ladder 试剂盒。
10% 过硫酸铵（APS）	N/A	N/A	用于尿素变性聚丙烯酰胺凝胶（配制 10 mL：将 1 g 溶解于 8 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 10 mL；使用装有 0.45 µm 滤膜的 10 mL 注射器过滤溶液）。
10X TBE 缓冲液	N/A	N/A	用于尿素变性聚丙烯酰胺凝胶（配制 1 L：在含搅拌子的量筒中加入 108 g Tris 碱和 55 g 硼酸，加入 800 mL 蒸馏水并搅拌溶解；加入 40 mL 0.5 M Na₂EDTA（pH 8.0）；用去离子水定容至 1 L；使用 0.22 µm 滤膜过滤溶液）。
10X TBS	N/A	N/A	配制 1 L：在含搅拌子的量筒中加入 60.5 g Tris 碱和 87.6 g NaCl，加入 800 mL 蒸馏水并搅拌溶解；用浓盐酸调节 pH 至 7.5；用去离子水定容至 1 L；使用 0.22 µm 滤膜过滤溶液。
丙烯酰胺：双丙烯酰胺 29:1（40% 溶液/电泳级），Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	用于尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。
ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]；（SAM[3H]）	Perkin Elmer	NET155V250UC	用于体外 RNA 甲基化；浓度 = 1.0 mCi/mL；比活性 = 17.1 Ci/mmol；摩尔浓度= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM。   收到冷冻的 3H-SAM 管后，在 4°C 下解冻，分装为每份 20 µL，于 -30°C 冻存。严禁将部分使用过的分装样品再次冻存或重复使用。
Amersham Hypercassette 自显影暗盒	GE Healthcare	RPN11649	用于凝胶自显影曝光。
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	用于凝胶自显影曝光。
Beckman 闪烁计数仪	Beckman	LS6500	用于液体闪烁计数。
Biorad Mini 水平电泳系统	Biorad	1704466	Mini 水平电泳系统。
cOmplete Mini EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche Applied Science	4693159001	配制 20X 溶液：将 1 片溶解于 0.525 mL 无核酸酶水中。
Criterion Cell	Biorad	345-9902	无 RNase 的聚丙烯酰胺凝胶空夹板。
Criterion 空夹板	Biorad	1656001	垂直中型格式电泳槽。
DeNovix DS-11 微量分光光度计	DeNovix	DS-11-S	用于测定 DNA 和 RNA 浓度的微量分光光度计。
Ecoscint 原液	National Diagnostics	LS-271	用于液体闪烁计数。
Fisherbrand 7 mL HDPE 闪烁瓶	Fisher	03-337-1	用于液体闪烁计数。
Fluoro-Hance-Quick Acting 自显影增强剂	RPI CORP	112600	用于凝胶自显影前处理。
凝胶干燥仪	Biorad	1651745	用于干燥凝胶。
上样缓冲液 II（Gel Loading Buffer II）	Ambion	AM8547	用于在变性尿素聚丙烯酰胺凝胶中上样 RNA（成分：95% 甲酰胺、18 mM EDTA、0.025% SDS、二甲苯蓝和溴酚蓝）。
GeneCatcher 一次性凝胶切割吸头	Gel Company	NC9431993	用于从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中切除条带。
Megascript 试剂盒	Ambion	AM1333	用于 T7 RNA 聚合酶介导的体外转录。
Perfectwestern 超大容器	Genhunter Corporation	NC9226382（透明）/ NC9965364（黑色）	凝胶染色盒。
pRZ	Addgene	#27663	用于产生具有均一末端的体外转录本的质粒
Qiagen RNeasy MinElute 纯化试剂盒	Qiagen	74204	用于 RNA 纯化，采用本方案中提供的改良操作流程。
QIAquick 凝胶回收试剂盒（50）	Qiagen	28704	用于回收和纯化用于体外转录的双链 DNA 片段。
Saran Premium 塑料保鲜膜	Saran Wrap	Amazon	用于凝胶干燥。
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	超灵敏核酸凝胶染料。
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	核酸凝胶染料。
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl，1 mM 二钠 EDTA，pH 8.0
TEMED	Fisher	110-18-9	用于尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。
配备 SMARTBLOCK 24X 1.5 mL 管的 Thermomixer	eppendorf	5382000023/5361000038	用于对 1.5 mL 管进行温度控制孵育。
TOPO TA 克隆试剂盒	life technologies		用于快速克隆 Taq 聚合酶–扩增的 PCR 产物至含有 T7 和/或 SP6 启动子的载体中，以进行体外 RNA 转录。
TURBO DNase（2 U⁄µL）	Ambion	AM2238	用于从体外转录反应中去除 DNA。
尿素	Sigma	51456-500G	用于尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。
Whatman 3MM 滤纸	GE Healthcare	3030-154	用于凝胶干燥的层析纸。