超声增强的成年成人原代成纤维细胞分离

摘要

我们介绍一种简单、快速且可靠的原代成年成纤维细胞分离方案，初学者（例如学生）也可操作。该方法结合了酶消化组织与超声波机械振荡，以获取原代成纤维细胞。本方案可轻松根据特定实验需求进行调整（例如用于人体组织）。

摘要

原代成年成纤维细胞已成为研究全身各种组织中纤维化、成纤维细胞相互作用及炎症的重要工具。由于原代成纤维细胞会因肌成纤维细胞分化或衰老诱导而无法无限分裂，因此必须定期建立新的细胞培养。然而，在建立可靠的分离方案并进行原代成纤维细胞分离的过程中，存在若干需要克服的障碍：操作方法的难度（尤其是对初学者而言）、细菌污染的风险、获得可用于实验的原代成纤维细胞所需的时间，以及后续细胞的质量和活力。本研究提供了一种快速、可靠且易于掌握的原代成年成纤维细胞分离与培养方案，适用于从小鼠心脏、肺、肝脏和肾脏中分离细胞，该方法结合了酶消化与超声振荡技术。

引言

成纤维细胞是扁平、梭形的细胞，具有多个星状突起和发达的粗面内质网^1,2。一个典型的成纤维细胞大小为 30 - 100 µm，寿命为 57 ± 3 天^1,3。人类成纤维细胞的平均细胞周期持续时间为 16 - 48 小时，具体时长取决于培养条件⁴。有证据表明，培养的原代成纤维细胞的复制能力及其功能质量与供体年龄呈负相关，因此在可能的情况下应优先选择较年轻的供体（动物或患者）^5,6。

成纤维细胞是大多数哺乳动物机体组织中的主要细胞类型。尽管成纤维细胞广泛存在，但其分子鉴定仍是一个挑战⁷。在胚胎发育过程中，成纤维细胞会从不同来源迁移至正在发育的组织和器官⁸。因此，成纤维细胞中可检测到大量标记蛋白，但目前仍缺乏在所有成纤维细胞群体中均表达且仅限于成纤维细胞特有的特异性标记蛋白。因此，通常需结合多种公认标记物的表达模式来鉴定成纤维细胞。其中最为公认的标记物包括波形蛋白（vimentin）、人成纤维细胞表面蛋白（hFSP）、盘状结构域受体2（DDR2）以及α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）。

成纤维细胞是主要的细胞外基质（ECM）产生细胞类型。因此，成纤维细胞可维持有序的组织结构，并为邻近细胞提供机械支持¹。细胞外基质的合成与降解之间处于精密调控的平衡状态。当平衡向合成方向偏移时，将启动过量ECM沉积过程；若该过程未被及时终止，则会导致纤维化。纤维化由肌成纤维细胞介导，后者来源于发生分子和表型改变的活化成纤维细胞。肌成纤维细胞的一个显著特征是ECM和细胞因子分泌增加，并表达有序排列的αSMA微丝⁹。

近年来，研究关注的重点集中在原代成纤维细胞在纤维化、组织炎症以及成纤维细胞与癌细胞相互作用中的作用^10,11。然而，为了有效研究成纤维细胞在健康和疾病状态下的特性，有必要常规性地分离出具有活性的原代成体成纤维细胞。目前已有多种可用于分离成纤维细胞的方法^12,13,14。其中三种主要方法包括：组织块外植生长法¹²、酶消化组织法¹⁵以及空腔器官的酶灌注法^9,13,16。外植生长法的优点在于其分离过程温和，无需使用酶降解细胞。但另一方面，外植培养通常需要较长的培养周期，才能获得可用于实验的细胞。常规酶消化法速度较快，但在机械解离组织所必需的振荡过程中，存在混入其他细胞类型（如内皮细胞）或细菌污染的风险。此外，这些方法通常操作复杂，需要较长时间的学习和熟练掌握。

鉴于原代成纤维细胞在研究中的重要性，在快速性、简便性和可靠性方面仍需优化现有的细胞分离方法。本文提供了一种基于超声的新型酶解法成纤维细胞分离方法，可获得高质量的细胞。

方案

以下实验方案遵循德国德累斯顿工业大学的机构动物护理指南（文件编号：T 2014/4）以及国际公认的动物护理指南（FELASA）¹⁷。图1展示了细胞分离过程。

1. 准备装置、材料和培养基

1. 准备细胞培养基、PBS 溶液、胶原酶混合液储备液（将 50 mg 冻干胶原酶混合物溶于 12 mL 无菌超纯水中）以及 0.25% 胰蛋白酶溶液。
2. 将培养基、PBS 和胰蛋白酶溶液预热至 37 °C。
3. 将超声水浴预热至 37 °C。
4. 使用 70% 乙醇对镊子、不锈钢刮匙、手术刀（每个器官使用 2 把手术刀）以及 2 个玻璃烧杯进行消毒，并将这些器械置于细胞培养罩内。
5. 将其中一个烧杯装入 70% 乙醇，另一个装入无菌水或 PBS 溶液。这些烧杯用于每次处理完一个器官后对器械进行消毒和清洗。
6. 将含有冷 PBS 的无菌 15 mL 塑料离心管置于湿冰上。所需离心管数量取决于拟分离成纤维细胞的器官数量。

2. 小鼠解剖与器官摘除

1. 佩戴两副手套，一副套在另一副之上，以便在动物解剖完成后立即脱去外层手套。
   注意：此步骤可防止动物皮毛和皮肤上的细菌扩散至器官。
2. 处死小鼠（例如通过颈椎脱臼法），并用针将尸体四肢固定在聚苯乙烯泡沫垫上。
3. 使用70%乙醇喷雾对小鼠尸体进行消毒。确保毛发完全浸透乙醇，以防止毛发飞扬。
4. 使用手术镊和无创剪刀在泌尿生殖道正上方剪开毛发。沿中线从初始切口处向上剪至颈部（3 - 4 cm），并在四肢处做松弛切口。
   警告：此步骤中切勿刺穿肌肉层，以免造成细菌污染！
5. 将皮肤用针固定在聚苯乙烯泡沫垫上，以便充分暴露覆盖腹腔的肌肉组织。
6. 使用70%乙醇对腹壁肌肉组织进行两次消毒。待乙醇完全挥发干燥后再进行下一步操作。
7. 脱去第一副手套，更换为一套新的无菌镊子和剪刀。
8. 使用手术剪剪开肌肉层，打开腹腔和胸腔，轻柔地取出目标器官。操作时用手术镊轻轻夹住器官（切勿刺穿器官，施加压力应尽可能小），并用剪刀在血管进入器官的入口附近剪断供血血管。
9. 将取出的器官放入含有冷PBS的无菌管中，拧紧管盖。将管子置于湿冰上，直至进行3.1步骤。

3. 组织剪碎、消化与细胞提取

1. 将试管转移至无菌细胞培养超净台中。
   注意：操作前需佩戴一副新的手套，并用70%乙醇对试管进行消毒！
2. 使用无菌镊子将器官从15 mL离心管中取出，放置于无菌6 cm培养皿的一半区域，用PBS短暂冲洗以去除多余血液。随后将器官转移至培养皿的另一半区域，吸除多余的PBS。
3. 使用两把无菌手术刀将组织切碎，残留的组织碎片大小不应超过1 - 2 mm。
4. 用无菌刮勺将切碎的组织转移至新的无菌15 mL离心管中，并加入2 mL 0.25%胰蛋白酶溶液。将离心管置于37 °C细胞培养孵箱中孵育5分钟。
5. 轻轻涡旋振荡离心管（约1400转/分钟）10秒。
6. 在细胞培养超净台中，向管内加入4 mL含胎牛血清（FCS）的细胞培养基（如DMEM，Dulbecco改良Eagle培养基），以终止胰蛋白酶反应。
7. 向每管含有心脏或肺组织的样品中加入250 µL胶原酶混合液，向肾脏或肝脏组织样品中分别加入100 µL。
8. 将离心管放入37 °C超声水浴中，启动超声破碎仪处理10 分钟。
   注意：本实验方案所用的超声水浴工作频率为35 kHz，最大功率为320 W。
9. 轻轻涡旋振荡离心管（约1400转/分钟）10秒。
10. 再次将离心管放入超声水浴中处理10分钟。
11. 轻轻涡旋振荡（约1400转/分钟）10秒。
12. 用70%乙醇对离心管进行消毒后，转移至无菌细胞培养超净台中。
13. 用40 µm滤网将溶液过滤至新的无菌15 mL离心管中。
14. 以500 × g 离心5分钟。
15. 弃去上清液，将沉淀物重悬于1 mL新鲜培养基中。
16. 将细胞转移至合适的细胞培养容器（如6孔板）中，置于37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中过夜培养。
17. 次日，吸除培养基，用PBS洗涤3次，然后加入新鲜培养基（加入体积根据所选培养容器而定，例如6孔板每孔加2 mL）。
18. 每隔一天更换一次培养基。
    注意：成纤维细胞在达到90%显微融合度后可进行传代（通常在培养5–7天后）。

结果

本方案从成年小鼠实体组织中分离成纤维细胞的能力已得到验证。所获得的成纤维细胞具有活性，可用于后续实验，如免疫荧光染色或增殖实验（图2D-F，图5A）。

成年成纤维细胞是扁平的梭形细胞，具有多个细胞突起，通常以单层形式生长^12,18。所获得的结果反映了这些形态学特征，并表明来自不同器官的成纤维细胞群体之间存在明显的形态学差异（图2）。肾成纤维细胞尤其比心脏、肺或肝成纤维细胞更小，且生长密度更高（图2）。

上图展示了 图3 通过心肌成纤维细胞分离后的实例...

讨论

与永生化成纤维细胞系相比，原代成纤维细胞具有多项优势。它们可以低成本地获得高质量且足量的细胞。此外，原代培养允许研究来自多个个体的细胞，从而提高实验结果的可靠性，并降低仅观察到细胞培养假象的可能性。持续建立新的原代培养物可避免因反复传代而常见的遗传改变²¹。此外，在高代次培养物中，细胞衰老^22，23或肌成纤维细胞分化增加的现象更为常见²⁰。在低代次（2–3代）时，基础状态下的肌成纤维细胞比例约为20–30%（数据未显示），根据β-半乳糖苷酶表达水平判断，仅有2.89%的细胞处于衰老状态（图5B）。因此，建议将培养物传代不超过5次，之后应更换新的培养物。这可确保整个实验过程中结果的可靠性和可重复性。使用含15% FCS的培养基相比含10% FCS的培养基，可获得更佳的成纤维细胞生长和增殖效果。这保证了首次传代后较高的成纤维细胞产量和良好...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	T4049-100ML
抗生素	Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA	Gibco LS15140148	青霉素/链霉素（10,000 U/mL）
细胞培养超净台	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	51023608	HeraSafe KSP15
细胞培养孵箱	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	50049176	BBD 6220
细胞培养板	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	取决于容器	6孔、12孔、24孔 Nunclon 表面
细胞培养抽吸装置	VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany	20727400	BVC 专业抽吸系统
细胞筛（滤网）	Corning, Tewksbury, USA	431750	40 µm 尼龙
离心机	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	75007213	Megafuge 8R
无线移液控制器	Hirschmann, Eberstadt, Germany	9907200	Pipetus
一次性移液器吸头	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	取决于体积	移液器专用 SafeSeal 吸头（10 µL、20 µL、100 µL、200 µL、1000 µL）
一次性塑料移液管	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	取决于体积	5 mL、10 mL、25 mL、50 mL
一次性无菌手术刀	Myco Medical, Cary, USA	n.a.	Techno cut
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	41965-062	高糖
Eppendorf 管	Eppendorf, Hamburg, Germany	取决于体积	50 µL、500 µL、1.500µL、2.000 µL
胎牛血清（FCS）	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	F2442-50ML
胶原酶混合液	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	5401020001	Liberase TL 研究级
6 cm 培养皿	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P5481-500EA
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D8537-500ML	500 mL
衰老检测试剂盒	Abcam, Cambridge, UK	ab65351
摇床/涡旋振荡器	IKA, Staufen im Breisgau, Germany	n.a.	MS2 Minishaker（后续型号：Ident-Nr.: 0020016017）
无菌塑料管	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Falcon 352095	BD Falcon 管（15 mL、50 mL）
超声波水浴锅	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	312	Sonorex RK100H
外科剪刀（无创型）	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	NR 82
外科剪刀	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	eq 1060.09
外科镊子	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BD577