我们介绍一种简单、快速且可靠的原代成年成纤维细胞分离方案，初学者（例如学生）也可操作。该方法结合了酶消化组织与超声波机械振荡，以获取原代成纤维细胞。本方案可轻松根据特定实验需求进行调整（例如用于人体组织）。
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摘要
摘要
原代成年成纤维细胞已成为研究全身各种组织中纤维化、成纤维细胞相互作用及炎症的重要工具。由于原代成纤维细胞会因肌成纤维细胞分化或衰老诱导而无法无限分裂，因此必须定期建立新的细胞培养。然而，在建立可靠的分离方案并进行原代成纤维细胞分离的过程中，存在若干需要克服的障碍：操作方法的难度（尤其是对初学者而言）、细菌污染的风险、获得可用于实验的原代成纤维细胞所需的时间，以及后续细胞的质量和活力。本研究提供了一种快速、可靠且易于掌握的原代成年成纤维细胞分离与培养方案，适用于从小鼠心脏、肺、肝脏和肾脏中分离细胞，该方法结合了酶消化与超声振荡技术。
引言
成纤维细胞是扁平、梭形的细胞，具有多个星状突起和发达的粗面内质网1,2。一个典型的成纤维细胞大小为 30 - 100 µm，寿命为 57 ± 3 天1,3。人类成纤维细胞的平均细胞周期持续时间为 16 - 48 小时，具体时长取决于培养条件4。有证据表明，培养的原代成纤维细胞的复制能力及其功能质量与供体年龄呈负相关，因此在可能的情况下应优先选择较年轻的供体（动物或患者）5,6。
成纤维细胞是大多数哺乳动物机体组织中的主要细胞类型。尽管成纤维细胞广泛存在，但其分子鉴定仍是一个挑战7。在胚胎发育过程中，成纤维细胞会从不同来源迁移至正在发育的组织和器官8。因此，成纤维细胞中可检测到大量标记蛋白，但目前仍缺乏在所有成纤维细胞群体中均表达且仅限于成纤维细胞特有的特异性标记蛋白。因此，通常需结合多种公认标记物的表达模式来鉴定成纤维细胞。其中最为公认的标记物包括波形蛋白（vimen....
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方案
以下实验方案遵循德国德累斯顿工业大学的机构动物护理指南（文件编号：T 2014/4）以及国际公认的动物护理指南（FELASA）17。图1展示了细胞分离过程。
1. 准备装置、材料和培养基
- 准备细胞培养基、PBS 溶液、胶原酶混合液储备液（将 50 mg 冻干胶原酶混合物溶于 12 mL 无菌超纯水中）以及 0.25% 胰蛋白酶溶液。
- 将培养基、PBS 和胰蛋白酶溶液预热至 37 °C。
- 将超声水浴预热至 37 °C。
- 使用 70% 乙醇对镊子、不锈钢刮匙、手术刀（每个器官使用 2 把手术刀）以及 2 个玻璃烧杯进行消毒，并将这些器械置于细胞培养罩内。
- 将其中一个烧杯装入 70% 乙醇，另一个装入无菌水或 PBS 溶液。这些烧杯用于每次处理完一个器官后对器械进行消毒和清洗。
- 将含有冷 PBS 的无菌 15 mL 塑料离心管置于湿冰上。所需离心管数量取决于拟分离成纤维细胞的器官数量。
2. 小鼠解剖与器官摘除
- 佩戴两副手套，一副套在另一副之上，以便在动物解剖完成后立即脱去外层手套。
注意：此步骤可防止动物皮毛和皮....
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结果
本方案从成年小鼠实体组织中分离成纤维细胞的能力已得到验证。所获得的成纤维细胞具有活性，可用于后续实验，如免疫荧光染色或增殖实验（图2D-F，图5A）。
成年成纤维细胞是扁平的梭形细胞，具有多个细胞突起，通常以单层形式生长12,18。所获得的结果反映了这些形态学特征，并表明来自不同器官的成纤维细胞群体之间存在明显的形态学差异（图2）。肾成纤维细胞尤其比心脏、肺或肝成纤维细胞更小，且生长密度更高（图2）。
上图展示了 图3 通过心肌成纤维细胞分离后的实例.......
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讨论
与永生化成纤维细胞系相比，原代成纤维细胞具有多项优势。它们可以低成本地获得高质量且足量的细胞。此外，原代培养允许研究来自多个个体的细胞，从而提高实验结果的可靠性，并降低仅观察到细胞培养假象的可能性。持续建立新的原代培养物可避免因反复传代而常见的遗传改变21。此外，在高代次培养物中，细胞衰老22，23或肌成纤维细胞分化增加的现象更为常见20。在低代次（2–3代）时，基础状态下的肌成纤维细胞比例约为20–30%（数据未显示），根据β-半乳糖苷酶表达水平判断，仅有2.89%的细胞处于衰老状态（图5B）。因此，建议将培养物传代不超过5次，之后应更换新的培养物。这可确保整个实验过程中结果的可靠性和可重复性。使用含15% FCS的培养基相比含10% FCS的培养基，可获得更佳的成纤维细胞生长和增殖效果。这保证了首次传代后较高的成纤维细胞产量和良好.......
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披露
不存在任何利益冲突需要声明。
致谢
感谢Romy Kempe女士和Annett Opitz女士提供的专业技术支持。同时感谢Bjoern Binnewerg先生提供的IT支持。本工作获得了以下机构资助：a) 德累斯顿心血管日促进协会（Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V.），b) "女性资格晋升资助计划（Habilitationsförderprogramm für Frauen"），德累斯顿卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯医学院，以及c) 埃尔泽·克勒纳研究学院（Else Kröner-Forschungskolleg, EKFK），德累斯顿卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯医学院。我们对各项资助与支持深表感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| 抗生素 | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | 青霉素/链霉素（10,000 U/mL） |
| 细胞培养超净台 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| 细胞培养孵箱 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| 细胞培养板 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 取决于容器 | 6孔、12孔、24孔 Nunclon 表面 |
| 细胞培养抽吸装置 | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC 专业抽吸系统 |
| 细胞筛（滤网） | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm 尼龙 |
| 离心机 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| 无线移液控制器 | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| 一次性移液器吸头 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 取决于体积 | 移液器专用 SafeSeal 吸头（10 µL、20 µL、100 µL、200 µL、1000 µL） |
| 一次性塑料移液管 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 取决于体积 | 5 mL、10 mL、25 mL、50 mL |
| 一次性无菌手术刀 | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | 高糖 |
| Eppendorf 管 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 取决于体积 | 50 µL、500 µL、1.500µL、2.000 µL |
| 胎牛血清（FCS） | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| 胶原酶混合液 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL 研究级 |
| 6 cm 培养皿 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 mL |
| 衰老检测试剂盒 | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| 摇床/涡旋振荡器 | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker（后续型号：Ident-Nr.: 0020016017） |
| 无菌塑料管 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon 管（15 mL、50 mL） |
| 超声波水浴锅 | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| 外科剪刀（无创型） | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| 外科剪刀 | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| 外科镊子 | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
参考文献
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology.
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