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方法文章

成年小脑切片中长时程抑制诱导的评估

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DOI：

10.3791/59859

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2019年10月16日

 , 
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

本文内容

摘要

在某些基因操作动物中，使用单一方案可能无法诱导小脑浦肯野细胞中的长时程抑制（LTD），且LTD与运动学习之间可能存在差异。因此，有必要采用多种方案来评估基因操作动物中的LTD诱导。本文展示了标准方案。

摘要

突触可塑性为学习与记忆提供了机制基础。对于小脑运动学习而言，平行纤维（PF）至浦肯野细胞（PC）突触传递的长时程抑制（LTD）被认为是运动学习的基础，且在多种基因操作动物中均观察到LTD和运动学习能力的缺陷。常用的运动学习检测方法包括视动反射（OKR）、前庭-眼反射（VOR）的适应性测试以及转棒实验，用于评估运动学习能力。然而，在谷氨酸受体亚基GluA2羧基末端修饰的基因敲入小鼠中，尽管缺乏PF-LTD，仍表现出正常的VOR和OKR适应性。在该研究中，LTD的诱导仅尝试使用了一种刺激方案，并在室温下进行。因此，本研究在相同基因敲入突变小鼠中，于接近生理温度条件下，采用多种刺激方案探索了小脑LTD的诱导条件。最终，我们找到了能够在此类基因操作小鼠中成功诱导LTD的刺激方案。本研究提出了一组用于评估LTD诱导的实验方案，将更准确地检验LTD与运动学习之间的因果关系。总之，在评估基因操作小鼠中的LTD时，实验条件至关重要。

引言

小脑皮层中复杂的神经元网络突触结构，包括浦肯野细胞（PCs）、分子层中间神经元（篮状细胞和星形细胞）、戈尔吉细胞、颗粒细胞的平行纤维（PFs）、苔藓纤维以及攀爬纤维（CFs），已在兴奋/抑制、发散/聚合等方面得到阐明。这种高度有序的神经环路图谱提示小脑是一种“神经元机器”1，尽管此前尚不清楚这种“机器”的功能目的。随后，Marr 提出，PFs 向 PCs 的输入构成一个三层关联学习网络2。他还推测每根 CF 传递来自大脑皮层的关于基本运动的指令2。他假设 PFs 与 CF 同时激活会增强 PF-PC 突触的活性，从而导致 PF-PC 突触的长时程增强（LTP）。另一方面，Albus 则假设 PFs 与 CF 的同步激活会导致 PF-PC 突触的长时程抑制（LTD）3。上述两项研究均将小脑解释为一种独特的记忆装置，将其整合进小脑皮层网络后，便形成了 Marr–Albus 学习机器模型。

根据这些理论预测，有两条证据表明小脑中存在突触可塑性。第一条证据来自绒球的解剖学结构：前庭器官来源的苔藓纤维（MF）通路与视网膜来源的攀爬纤维（CF）通路在浦肯野细胞（PC）上汇聚4。这种独特的汇聚模式提示，绒球中发生的突触可塑性导致了前庭-眼反射显著的适应能力。第二条证据来自对绒球中浦肯野细胞反应的记录以及对绒球的损毁实验，这些结果也支持上述假说5,6,7。此外，在猴子手部运动适应过程中记录到的浦肯野细胞放电模式8进一步支持了突触可塑性假说，尤其是Albus提出的长时程抑制（LTD）假说3。

为了直接确定突触可塑性的性质，已有研究表明，在体内对一组平行纤维（PF）和特异性支配浦肯野细胞（PC）的攀爬纤维（CF）进行重复联合刺激（Cjs），可诱导PF–PC突触传递效能的长时程抑制（LTD）9,10,11。在后续利用小脑脑片12和培养的浦肯野细胞进行的体外研究中，联合刺激共培养的颗粒细胞和下橄榄核细胞13，或联合电泳施加谷氨酸与胞体去极化14,15，均可引发LTD。LTD诱导背后的信号转导机制也通过体外制备得到了深入研究16,17。

前庭眼反射（VOR）和视动眼震反射（OKR）的适应性常被用于定量评估基因操作对小脑运动学习的影响，因为前庭-小脑皮层已被证实是VOR18,19,20和OKR19,21适应性学习的关键起源区域。长时程抑制（LTD）诱导失败与行为性运动学习障碍之间的相关性，一直被视为LTD在运动学习机制中起关键作用的证据22。这些观点统称为运动学习的LTD假说，也称Marr-Albus-Ito假说23,24,25,26。

使用类似方案测量了眼动适应性学习，同时采用多种实验条件在脑片制备中诱导长时程抑制（LTD）27,28,29,30,31。最近，Schonewille 等人26报道，某些基因操作小鼠表现出正常的运动学习能力，但其小脑脑片未显示出LTD，因此得出结论认为LTD对运动学习并非必需。然而，该研究仅在室温下使用一种类型的方案尝试诱导LTD。因此，我们在约30 °C的记录条件下采用了多种LTD诱导方案，并证实通过这些方案在接近生理温度时可稳定地在基因操作小鼠中诱导出LTD32。

然而，关于联合刺激的基本特性仍存在一些问题。首先是复杂峰电位的波形与长时程抑制（LTD）幅度之间的关系。其次，在平行纤维（PF）刺激与胞体去极化联合作用下，所使用的刺激次数是否必要尚不明确。在本研究中，这些问题通过野生型（WT）小鼠进行了探讨。

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方案

所有实验程序均经理化学研究所实验动物护理与使用委员会批准。小鼠饲养在理化学研究所脑科学中心动物房内，环境温度控制在23–25 °C，湿度控制在45%–65%。实验使用雄性和雌性野生型小鼠（C57BL/6，3–6个月龄）。

1. 实验所用溶液的制备

注意：所有溶液均应使用无金属（电阻率 > 18.2 MΩ）及其他杂质（总有机碳（TOC）< 5.0 ppb）的超纯水配制。用于脑片切割和记录的实验用人工脑脊液（ACSF）需在实验当天现配，由10倍浓度（x10）的ACSF储备液稀释而成。使用前需用5% CO2/95% O2混合气体对溶液进行通气。ACSF的pH值应调节至7.4 ± 0.1，渗透压通过加入超纯水调节至315 ± 5 mOsm/kg。

  1. 配制10倍浓缩的ACSF溶液，其中包含1250 mM NaCl、30 mM KCl、12.5 mM NaH2PO4，以及 260 mM NaHCO₃3该溶液可在 4 °C 下保存。
  2. 配制含 125 mM NaCl、3 mM KCl、2 mM CaCl₂ 的工作液 ACSF2，1 mM Mg2SO4，1.25 mM NaH2PO4，26 mM NaHCO₃3 和 20 mM 葡萄糖。
    1. 首先，加入 1 mL 的 2 M CaCl₂2 溶液，随后加入1 mL 1 M Mg2SO4 将溶液加入约800 mL超纯水中，以避免沉淀。然后加入100 mL 10倍浓缩的ACSF和葡萄糖。最后用超纯水定容至1,000 mL。
  3. 制备用于脑组织操作的3.3%琼脂。将1 g琼脂溶解于30 mL 0.9% NaCl溶液中，微波加热至刚好沸腾。搅拌混匀后，倒入无菌的4 cm × 10 cm塑料盒中，静置使其凝固。将琼脂板（~8 mm 厚度）置于冰箱中。
  4. 配制内液。
    1. 制备 K+含 60 mM KCl、60 mM K-葡萄糖酸盐、0.3 mM EGTA、4 mM MgCl 的基于钾的内液2，4 mM ATP，0.4 mM GTP 和 30 mM HEPES（pH 7.2）。
      注意： 低浓度（0.3 mM）的EGTA（一种缓慢作用的Ca²⁺螯合剂）2+-螯合剂，用于螯合可能污染的Ca2+ 在纯水中，但内液中这种低浓度的EGTA从不阻断LTD的诱导（图3, 图 4, 图5在全细胞记录期间测量的渗透压为285 mOsm/kg。
    2. 制备 Cs+含 60 mM CsCl、46 mM D-葡萄糖酸盐、27 mM 氯化四乙铵（TEA-Cl）、0.3 mM EGTA、4 mM MgCl₂ 的基于细胞内的溶液2，4 mM ATP、0.4 mM GTP 和 30 mM HEPES（pH 7.2，用CsOH调至pH）
      注意： Cs+ 阻断电压依赖性K通道，并通过增加长度常数改善远端树突的空间钳制条件。测得的渗透压为285 mOsm/kg。
    3. 制备200 µL的溶液分装液，并于-30 °C保存。

2. 大脑解剖与修整

  1. 将两份50 mL的ACSF置于冰上冷却并充氧，直至温度低于4 °C。向其中一份冰冻ACSF中加入50 µL河豚毒素（TTX，1 mM），并保留该溶液用于脑片切割。为了获得保留长时程抑制（LTD）诱导能力的小鼠小脑脑片，需在正常ACSF中添加TTX。
  2. 通过在切片室的冰浴区域中加入冰块来冷却金属样本托盘。
  3. 将1 mL异氟烷倒入麻醉罐中（~1000 mL）中，将小鼠放入其中麻醉30–45秒。通过检测小鼠对机械刺激无反应，确认其已达到深度麻醉状态。
  4. 使用手术剪将小鼠断头。用手握住头部，用眼科剪沿中线剪开表层皮肤。用手指捏住皮肤并拉开，充分暴露颅骨表面。
  5. 使用眼科剪沿耳部和眼部上方的枕大孔水平剪开颅骨，再沿双眼上方连线剪开颅骨并移除，以分离出颅骨。
  6. 用手术刀在大脑半球中部切断，然后从颅骨中分离出包含小脑的脑后部。将其浸入盛有冰冻人工脑脊液（ACSF）的烧杯中。通常，从断头到脑组织块浸入预冷的ACSF烧杯中的总时间应少于60秒。
  7. 应调整冒泡管的位置，以免搅动烧杯中的脑组织块。机械损伤可能导致记录过程中脑片出现肿胀。静置至少7分钟，使脑组织充分冷却。
  8. 修剪脑组织块时，从大块琼脂平板（4 cm × 10 cm，4 °C保存）上切下一小块矩形琼脂（2 cm × 2 cm），置于滤纸上以吸去多余液体。
  9. 将琼脂块倒置在滤纸上，然后将其放置在预冷的金属样本托盘（16 cm × 20 cm）上的滤纸上。用刮铲挑起脑组织块，并用一片滤纸吸去其周围的过量液体。
  10. 将脑组织块用胶水（医用氰基丙烯酸酯速干胶）固定在琼脂块上，确保脑组织块的底部（腹侧）与琼脂块相连。
  11. 用刀切下右侧半球，确保切割面尽可能平行于浦肯野细胞（PC）的树突平面，因为该侧面将贴附于样本托盘表面。切除并移除半球的另一侧。随后，在上丘与下丘之间切断脑组织，并剪除脊髓。
  12. 将修剪好的小脑右侧与琼脂块一起用胶水粘附于预冷的样品托上。用刮刀的平坦部分将多余的胶水涂抹至小脑周围，避免胶水附着于小脑表面。倾斜金属托盘，加入人工脑脊液（ACSF）以固定胶水并冲洗去除多余胶水。

3. 脑切片

  1. 将样品调整至小脑背侧朝前的位置。倒入冰冷的切割型人工脑脊液（ACSF），其中含有 1 µM TTX，用量需完全浸没小脑。将通气管插入 ACSF 中，并开始用 O2/CO2 混合气体持续通气。
  2. 在双目显微镜下使用精细镊子去除蛛网膜。用刀片切断小脑脚，并移除脑干和琼脂块。将切片托盘旋转 180°，使小脑背侧面向剃刀刀片。
  3. 安装刀片并调整首次切割位置。将振动切片机的切片参数设置如下：振幅 5.5，频率 85 Hz，速度 3–4，切片厚度 300 µm。
  4. 将小脑切片转移至尼龙网篮中，放入丙烯酸材质的孵育槽，并完全浸入充氧的 ACSF 中。孵育槽应置于水浴中，维持温度为 26 °C。
  5. 将切片至少储存 1 小时，以使其从切片过程中造成的损伤中恢复。

4. 全细胞膜片钳记录

注意：膜片钳记录需要以下设备：配备红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统的直立显微镜、膜片钳放大器、数据采集卡、数字刺激器、隔离器、计算机、用于数据采集与分析的软件、电动操纵器、显微镜载物台、隔振台、法拉第笼、溶液加热系统、蠕动泵和电极拉制仪。

  1. 向ACSF中加入苦味毒（0.1 mM），并使用超声处理3分钟以充分溶解。
  2. 以每分钟2 mL的流速，用含苦味毒且经O2-CO2饱和的ACSF灌注记录室。将记录室的温度维持在约30 °C。
  3. 使用拉制仪四步法拉制带丝硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 = 1.5 mm）以制备记录电极，尖端直径应约为1 µm。
  4. 使用拉制仪两步法拉制相同的毛细管以制备刺激电极，然后在双目显微镜下轻触铁块以折断尖端，形成精细尖部，最终直径应为3–5 µm。
  5. 将小脑切片转移至记录室，并用尼龙线固定的铂金丝网固定。用ACSF填充刺激电极。
  6. 为刺激平行纤维（PFs），将刺激电极置于分子层表面，距离浦肯野细胞层约50 µm处。
  7. 为刺激攀爬纤维（CF），将刺激电极置于浦肯野细胞层底部（步骤5.3、5.4）。
  8. 使用0.45 µm滤器过滤钾离子（K+）基或铯离子（Cs+）基内液。使用微量加样器向记录电极中注入8 µL内液。
  9. 在将记录电极浸入ACSF之前，施加轻微正压。电极阻抗应为2–4 MΩ，并校正液结电位。
  10. 用记录电极接近健康、明亮的浦肯野细胞胞体，轻微推动浦肯野细胞表面，停止施加正压，随后施加负压直至形成吉欧姆封接，再通过负压建立全细胞记录模式。
  11. 将膜电位钳制在-70 mV，以0.1 Hz频率施加-2 mV脉冲（持续时间100 ms），持续监测输入电阻、串联电阻和输入电容。不使用串联电阻补偿。当串联电阻变化超过15%时，舍弃该数据。

5. 长时程抑制的诱导

  1. 使用脉冲（持续时间 0.1 ms）刺激分子层。通过施加双脉冲刺激（脉冲间期（ISI）为 50 ms）来鉴定平行纤维兴奋性突触后电流（PF-EPSC）。PF-EPSC 应表现出成对脉冲易化现象，并随着刺激强度的增加，其幅度逐渐增大。
  2. 以 0.1 Hz 的频率施加单脉冲，记录 PF-EPSC 的测试反应。调节刺激强度，使诱发出的 EPSC 幅度约为 200 pA。避免电压依赖性离子通道引起的电流污染。
  3. 在浦肯野细胞层底部刺激攀爬纤维（CF），并通过施加双脉冲刺激来鉴定由 CF 激活引发的 EPSC。CF-EPSC 应表现出成对脉冲抑制现象，并随着刺激强度的增加呈现“全或无”的反应模式。为诱导长时程抑制（LTD），应使用单次刺激。
  4. LTD诱导方案1
    1. 在电流钳条件下，使用含 K+ 的电极内液，同时以 1 Hz 频率施加单次平行纤维刺激和单次攀爬纤维刺激，持续 5 分钟（共 300 次脉冲）（图 1A）。
  5. LTD诱导方案2
    1. 在电流钳条件下，使用含 K+ 的电极内液，以 1 Hz 频率施加双次平行纤维刺激（ISI 为 50 ms）和单次攀爬纤维刺激，使第二次平行纤维刺激与攀爬纤维刺激同步，持续 5 分钟（图 1B）。
  6. LTD诱导方案3
    1. 在电压钳条件下，使用含 Cs+ 的电极内液，以 1 Hz 频率施加双次平行纤维刺激（ISI 为 50 ms）和一次单步去极化电压脉冲（从 -70 mV 至 0 mV，持续 50 ms）作用于胞体，持续 3 分钟，使第二次平行纤维刺激与去极化电压脉冲的起始时间一致（图 1C）。
  7. LTD诱导方案4
    1. 在电压钳条件下，使用含 Cs+ 的电极内液，以 0.5 Hz 频率同时施加平行纤维刺激（5 次，100 Hz）和一次单步去极化电压脉冲（从 -70 mV 至 0 mV，持续 50 ms）作用于胞体，持续 3 分钟（图 1D）。

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结果

本研究采用四种方案诱导小脑长时程抑制（LTD）。前两种方案（方案1和方案2）在电流钳条件下，联合施加平行纤维（PF）刺激和攀爬纤维（CF）刺激。另外两种方案（方案3和方案4）在电压钳条件下，用胞体去极化替代CF刺激。对联合刺激期间的电压轨迹或电流轨迹进行了比较（图2）。

在电流钳条件下，1次平行纤维刺激（PF-刺激）与1次攀爬纤维刺激（CF-刺激）联合应用（方案1）是切片制备中常规使用的方法26,27。由Cj诱发的复合动作电位的波形与单独CF-刺激诱发的波形相似，表现为首个陡峭的小锋电位，随后出现2至3个次级锋电位（图2A）。在采用方案2进行刺激时，也观察到类似形态的复合动作电位，即先给予1次PF-刺激，50毫秒后再给予一次PF-与CF-刺激的联合刺激（图2B）。在电压钳条件下，使用基于C...

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讨论

四种方案之间的差异

在LTD诱导方案1和2中，以1 Hz频率进行300次Cjs刺激足以诱导小脑LTD。该CF刺激频率似乎处于生理范围内，因为在清醒成年小鼠（P60）中报道的复杂峰电位发放率约为1.25 Hz36。然而，单独使用CF刺激（如方案1和2中所采用）并未引起PF-CF突触的长时程可塑性（图4，图5），尽管较高频率的单独CF刺激可诱导LTD24。在方案1中诱发的复杂峰电位波形也与LTD幅度无显著相关性（图3）。复杂峰电位的波形可能反映了平均的Ca2+浓度，但并不能代表发生LTD的树突细支中局部的Ca2+浓度。

关于平行纤维（PF）刺激，尽管传统上采用单次PF刺激来诱导小脑长时程抑制（LTD）

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 A. Oba 提供的技术支持。本研究部分由科学研究费补助金（C）17K01982 号资助，授予 K.Y.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
放大器Molecular Devices-AxonMulticlamp 700B
硼硅酸盐玻璃毛细管SutterBF150-110-10
数字转换器Molecular Devices-AxonDigidata1322A
电极拉制仪SutterModel P-97
异氟烷FUJIFILM Wako Pure Chemical26675-46-7
隔离器A.M.P.I.ISOflex
线性切片机Dosaka EMPRO7N
显微镜NIKONEclipse E600FN
蠕动泵GilsonMP1 Single Channel Pump
苦味毒Sigma-AldrichP1675
纯水制备仪Merck-MilliporeMilliQ 7000
实验软件Molecular probe-AxonpClamp 10
统计软件KyensLabKyPlot 5.0
刺激器WPIDS8000
温度控制器WarnerTC-324B
河豚毒素Tocris1078

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