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方法文章

单细胞RNA测序及人胰岛分析

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DOI：

10.3791/59866

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2019年7月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regeneron Pharmaceuticals, Inc

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，从分离的人胰岛中生成高质量、大规模单细胞转录组数据的实验方案。

摘要

胰岛由具有独特激素表达模式的内分泌细胞组成。这些内分泌细胞在正常和病理条件下表现出功能差异。本实验方案的目标是利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，获得每种内分泌细胞类型的高质量、大规模转录组数据。此类数据可用于构建在正常或特定条件下每种内分泌细胞类型的基因表达谱。该过程需要谨慎操作、精确测量以及严格的质控。在本方案中，我们详细描述了人胰岛组织的解离、测序及数据分析的具体步骤。约20,000个人类单胰岛细胞的代表性结果展示了该方案的成功应用。

引言

胰岛释放内分泌激素以调节血糖水平。五种在功能和形态上各不相同的内分泌细胞参与这一重要功能：α细胞产生胰高血糖素，β细胞产生胰岛素，δ细胞产生生长抑素，PP细胞产生胰多肽，ε细胞产生饥饿素1。基因表达谱分析是表征正常或特定条件下内分泌细胞的有用方法。传统上，全胰岛基因表达谱通过微阵列和下一代RNA测序技术获得2,3,4,5,6,7,8。尽管全胰岛转录组有助于识别器官特异性转录本和疾病候选基因，却无法揭示每种胰岛细胞类型的分子异质性。激光显微切割（LCM）技术已被用于直接从胰岛中获取特定细胞类型9,10,11,12，但目标细胞群体的纯度仍不足。为克服这些局限，已采用荧光激活细胞分选（FACS）技术来分离特定的内分泌细胞群体，例如α细胞和β细胞13,14,15,16,17,18。此外，Dorrell 等人采用基于抗体的FACS分选方法将β细胞分为四个亚群19。经FACS分选的胰岛细胞还可用于单细胞RNA测序的培养；然而，基于培养板的方法在可扩展性方面面临挑战20,21,22。

为了获得每种内分泌细胞类型的高质量、大规模转录组数据，我们将微流控技术应用于人胰岛细胞。该微流控平台能够以高通量、高质量和可扩展的方式，从大量单细胞中生成转录组数据23,24,25,26,27。除了揭示大量捕获的细胞类型的分子特征外，当提供足够数量的细胞时，高度可扩展的微流控平台还能实现对稀有细胞类型的鉴定。因此，将该平台应用于人胰腺胰岛，使得对分泌饥饿素的ε细胞这一稀有内分泌细胞类型进行了分析；由于其数量稀少，该细胞类型的已知功能十分有限28。近年来，我们及他人已发表多项研究，报道了利用该技术获得的人胰岛大规模转录组数据29,30,31,32,33。这些数据均为公开资源，可供胰岛研究领域用于研究内分泌细胞的异质性及其在疾病中的意义。

本文介绍了一种基于液滴微流控技术的单细胞RNA测序方案，该方案已用于生成约20,000个人类胰岛细胞的转录组数据，包括α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、ε细胞以及少量非内分泌细胞32。该实验流程从分离的人类胰岛开始，涵盖了胰岛细胞解离、单细胞捕获及数据分析等步骤。该方案需使用新鲜分离的胰岛，适用于人类及其他物种（如啮齿类动物）的胰岛。利用此流程，可构建在基础状态及其他条件下无偏倚且全面的胰岛细胞图谱。

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方案

1. 人胰岛解离

  1. 获取来自15至80岁、性别不限的遗体器官捐献者的胰岛，除非研究目的需要特定人群捐献者的胰岛。
    1. 分离后，将分离的胰岛在供应商处的组织培养设施中保存2-3天。胰岛损伤通常需要超过1天才变得可见。
    2. 将胰岛放入瓶中，并完全浸没于胰岛培养基中，通过隔夜运输送至实验室。
    3. 从胰岛供应商处获取所运送胰岛的胰岛当量（IEQ）数量。
  2. 在胰岛到达当日进行复苏。此步骤应在生物安全柜中操作，以尽量减少污染风险。
    1. 将完全胰岛培养基（CMRL-1066，10% (v/v) FBS，1×青霉素-链霉素，2 mM谷氨酰胺）置于冰箱中冷却。
    2. 将胰岛从瓶中转移至一个50 mL锥形管中。
    3. 向空瓶中加入10 mL预冷的完全胰岛培养基，冲洗残留的胰岛，并将液体转移至锥形管中。
    4. 以200 x g离心2分钟以回收胰岛。吸除上清液，保留约1-2 mL培养基与沉淀一同留存。
    5. 用预冷的完全胰岛培养基重悬胰岛。根据供应商提供的IEQ数值，每5000 IEQ加入12 mL培养基。
    6. 将含胰岛的培养基倒入一个10 cm未经处理的组织培养皿中，在37 °C、5% CO2的空气环境中孵育过夜。
  3. 按以下方法对胰岛进行解离。此步骤应在过夜孵育后进行。
    1. 预先温育完全胰岛培养基和细胞解离溶液。
    2. 在室温下配制含0.04% BSA的1× PBS溶液。
    3. 使用P200移液器计数并手工挑选200-300个胰岛，转移至含有5 mL预温完全胰岛培养基的15 mL锥形管中。
    4. 以200 x g离心2分钟收集胰岛。轻柔吸除上清液，避免扰动管底沉淀。
    5. 加入1.0 mL预温的细胞解离溶液，通过轻柔吹打使沉淀分散。在37 °C孵育9-11分钟，每隔3分钟缓慢吹打10秒，以使细胞解离为单细胞状态。
    6. 当胰岛细胞充分解离且溶液变浑浊时，加入9 mL完全胰岛培养基，并通过30 µm细胞筛过滤至新的15 mL锥形管中。
    7. 用2 mL完全胰岛培养基冲洗原管和细胞筛，收集残留胰岛并加入同一管中。
    8. 以400 x g离心5分钟收集细胞。
    9. 轻柔吸除培养基，将细胞沉淀重悬于5 mL含0.04% BSA的1× PBS（PBS-BSA）溶液中。
    10. 通过新的30 µm细胞筛过滤至15 mL锥形管中，再以400 x g离心5分钟收集细胞。
    11. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于200-300 µL 1× PBS-BSA溶液中。
    12. 测定细胞浓度，并调整体积至最终浓度为400-500个细胞/µL。

2. 单细胞悬液质量控制

  1. 使用基于荧光的自动细胞计数器测定细胞浓度34。
    1. 将10 μL细胞与0.5 μL AO/DAPI混合，用移液枪充分吹打混匀。取10.5 μL混合液加入载玻片，运行细胞计数检测以确定细胞数量和活率。
    2. 根据细胞计数结果，必要时对细胞悬液进行稀释或过滤处理。

3. 使用微流控芯片进行单细胞分离。遵循微流控芯片制造商提供的方案35。

  1. 将3'凝胶珠和逆转录（RT）试剂置于室温下（>30分钟）。如需要，用TE缓冲液重悬RT引物。
  2. 在低吸附离心管中按表1所述配制RT主混合液。
  3. 确定每个样本所需的输入细胞数量。计算为达到目标细胞数所需的细胞悬液体积（X）。每个样本需加入的无核酸酶水体积为33.8-X μL。
  4. 对于每个待分选的样本，向0.2 mL PCR条形管中加入33.8-X μL无核酸酶水，然后向每根条形管中加入66.2 μL主混合液。此时不要向条形管中加入细胞。轻轻吹打混匀。将准备好的条形管置于冰上。
  5. 将微流控芯片放入芯片盒中。调整芯片盒方向，确保油井（标记为第3行）最靠近实验操作者。
  6. 若运行的样本少于8个，请按以下顺序使用50%甘油填充未使用的通道：
    1. 向所有未使用通道的第1行孔中各加入90 µL 50%甘油。
    2. 向所有未使用通道的第2行孔中各加入40 µL 50%甘油。
    3. 向所有未使用通道的第3行孔中各加入270 µL 50%甘油。
  7. 将凝胶珠短暂涡旋。全速涡旋30秒。多次轻敲条形管管壁以收集珠子。确认无气泡存在。
  8. 向已准备好的条形管中加入X μL细胞悬液。吹打混匀5次。不更换枪头，立即将90 μL细胞混合液转移至芯片的第1行孔中。
  9. 等待30秒后，向第2行孔中缓慢加入40 μL凝胶珠。此步骤需极缓慢地进行移液操作。向第3行各孔中加入270 μL分选油。
  10. 将芯片密封垫圈卡入芯片支架的卡槽中。将组装好的芯片支架放入单细胞分选仪中，按下运行按钮。
  11. 运行完成后立即取出芯片支架组件。
  12. 从支架上取下芯片密封垫圈，以45°角打开芯片盒，从芯片中取出100 μL乳浊液，转移至蓝色塑料96孔板中。

4. 单细胞cDNA扩增。遵循微流控芯片制造商的方案35。

  1. 反转录。
    注意：此步骤应在洁净的专用PCR操作台内进行，以防止未扩增的cDNA受到微生物及其他污染。
    1. 使用加热板封膜机将96孔蓝色板用铝箔密封。
    2. 在热循环仪中运行反转录反应，程序如下：53 °C 反应45分钟 → 85 °C 反应5分钟 → 4 °C 保存。
      注意：此为安全暂停点。样品可在4 °C保存最多72小时。
  2. 反转录后纯化
    1. 将核酸结合磁珠和核酸片段大小选择磁珠恢复至室温，并涡旋振荡以重新悬浮。此时，将样品清洁缓冲液在65 °C解冻10分钟。将所有其他试剂恢复至室温并涡旋振荡。
    2. 按照表2和表3所示配制缓冲液。
  3. 化学破乳并纯化。
    1. 轻轻从板上移除铝箔密封膜。
    2. 向每个乳液中加入125 μL粉红色破乳试剂。等待1分钟后，将全部液体转移至洁净的0.2 mL条形管中。确保条形管中存在一层透明液体和一层粉红色液体。
    3. 从条形管底部吸取125 μL粉红色层，注意不要扰动透明层。少量粉红色液体（约15 μL）残留在管中属正常现象。
    4. 向条形管中加入表2中的200 μL清洁混合液，并在室温孵育10分钟。
    5. 将条形管置于磁力架上，待溶液澄清后，移除上清并弃去，随后用80%乙醇洗涤磁珠两次。让磁珠干燥1分钟。
    6. 将条形管从磁力架上取下，向磁珠中加入表3中的35.5 μL洗脱液。用移液器吹打以充分重悬磁珠。室温孵育2分钟。
    7. 将条形管放回磁力架，待溶液澄清后，将纯化的cDNA从条形管中转移至洁净的0.2 mL条形管中。
  4. 扩增cDNA。
    1. 配制下方表4所示的扩增主混合液。
    2. 向每个样品中加入65 μL cDNA扩增主混合液。将条形管放入热循环仪中，运行以下程序：98 °C 预变性3分钟 → 15个循环 [98 °C 变性15秒 → 67 °C 退火20秒 → 72 °C 延伸1分钟] → 72 °C 延伸5分钟 → 4 °C 保存
      注意：此为安全暂停点。样品可在4 °C保存最多72小时，或在-20 °C长期保存。
    3. 使用0.6倍体积的核酸片段大小选择磁珠纯化扩增后的cDNA。用80%乙醇洗涤两次，用40.5 μL洗脱液洗脱。
    4. 采用自动化凝胶电泳和基于荧光的DNA定量检测方法对cDNA进行质量控制36,37。
      注意：此为安全暂停点。样品可在4 °C保存最多72小时，或在-20 °C长期保存。

5. 测序文库构建

  1. 对cDNA进行片段化（tagmentation）及纯化38。
    1. 将cDNA归一化至总体积20 μL中含50 ng。此步骤中精确的定量至关重要。
    2. 配制表5中的片段化反应混合液，并在冰上将30 μL分装至每个20 μL的cDNA样品中。将样品放入热循环仪，运行片段化程序：55 °C 5 min → 10 °C 保持。
    3. 使用纯化柱对片段化后的cDNA进行纯化38。向每个样品中加入180 μL DNA结合缓冲液。转移230 μL至离心柱中。
    4. 在1300 x g条件下离心2 min，弃去穿流液。
    5. 用300 μL DNA洗涤缓冲液洗涤两次。再于1300 x g离心2 min，以确保乙醇完全去除。
    6. 向离心柱中加入31 μL洗脱缓冲液，室温孵育2 min，以洗脱纯化的片段化cDNA。
    7. 在1300 x g条件下离心2 min，回收纯化产物。
  2. 样本加索引PCR。
    1. 选择在多重测序运行中不会重叠的条形码。
    2. 按表6所示配制样本索引PCR主混合液。
    3. 向30 μL纯化样品中加入60 μL样本索引PCR主混合液。
    4. 向每个样品中加入10 μL浓度为20 μM的4-寡核苷酸样本索引（记录所用索引）。此时总反应体积为100 μL。
    5. 将样品放入热循环仪，热盖温度设为105 °C。运行以下程序：98 °C 45 s → 12-14个循环 [98 °C 20 s → 54 °C 30 s → 72 °C 20 s] → 72 °C 1 min → 4 °C 保持。
      注意：此为安全暂停点。样品可在4 °C保存最多72小时。
  3. 使用双轮磁珠纯化法纯化文库。
    1. 向样品中加入100 μL核酸片段大小选择磁珠，用移液器充分混匀。室温孵育5 min。
    2. 将样品置于磁力架上，静置至溶液澄清。移除并弃去上清液。
    3. 用200 μL 80%乙醇洗涤两次。
    4. 在磁力架上干燥磁珠2 min。从磁力架上取下，向磁珠沉淀中加入50.5 μL EB缓冲液。用移液器吹打重悬磁珠。
    5. 室温孵育2 min。转移至磁力架，静置2 min。将50 μL洗脱样品转移至新的八联管中。
    6. 向样品中加入40 μL核酸片段大小选择磁珠，室温孵育5 min。转移至磁力架，待溶液澄清后，移除并弃去上清液。
    7. 用125 μL 80%乙醇洗涤两次。
    8. 在磁力架上干燥磁珠2 min。从磁力架上取下，向磁珠沉淀中加入60.5 μL EB缓冲液。用移液器吹打重悬磁珠。
    9. 室温孵育2 min。转移至磁力架，静置2 min。将50 μL洗脱样品转移至新的八联管中。此即最终文库。
    10. 样品可在4 °C保存最多72小时，或在-20 °C长期保存。注意：此为安全暂停点。
  4. 使用自动化凝胶电泳和基于荧光的DNA定量检测方法对最终文库进行定量和质量控制36,37。在进行质量控制前，将样品稀释1:10。

6. 文库测序

  1. 将每个待测序样品归一化至 2 ng/μL，并将 3 μL 归一化后的各样品混合在一起。
  2. 使用基于荧光的 DNA 定量分析法测定混合样品的浓度37。
  3. 将混合样品稀释至 0.25 ng/μL。
  4. 按如下方法对混合样品进行变性：12 μL 稀释后的混合样品（0.25 ng/μL）+ 1 μL DNA 对照（1 nM），2 μL EB 缓冲液 + 5 μL NaOH（0.4N）。室温孵育 5 分钟，然后加入 10 μL 200 mM Tris（pH 8.0）。
  5. 将 4.05 μL 变性样品加入 1345.95 μL HT1 溶液中。取 1.3 mL 加入测序仪的试剂盒中，按照制造商指南39运行测序程序，测序方案为 26 个循环（Read 1）+ 8 个循环（i7 Index）+ 0 个循环（i5 Index）+ 55 个循环（Read 2）。

7. 读段比对（补充文件1）

  1. 运行 Cell Ranger（v2.0.0）将测序产生的原始碱基识别（BCL）文件解复用为 FASTQ 文件。将 FASTQ 文件比对至人类 B37.3 基因组组装序列和 UCSC 基因模型，以获得基因表达定量结果。
  2. 比对质量控制。
    1. 生成比对指标，并检查 Q30 碱基、有效条形码比例、与细胞相关的读段比例、比对上的读段比例以及每个细胞中检测到的读段数。
    2. 检查条形码秩图，确保与细胞相关的条形码与背景之间有清晰分离。

8. 数据分析（补充文件 2）

  1. 细胞质量控制与预处理。
    1. 排除检测到的基因数 < 500、唯一分子标识符（UMI）总数 < 3000、以及存活率评分 > 0.2 的细胞，具体标准如前所述32。根据组织和细胞类型调整阈值。
    2. 去除双细胞（doublets）。
      1. 使用 R 软件包 mclust40 分析五种内分泌激素基因（胰高血糖素 - GCG、胰岛素 - INS、生长抑素 - SST、胰多肽 - PPY 和胃饥饿素 - GHRL）的双峰表达模式（高表达和低表达模式）。
      2. 去除表达超过一种激素基因的细胞，即具有两个或以上激素基因处于高表达模式的细胞。
    3. 使用 R 软件包 Seurat41，在单细胞水平上根据总 UMI 对基因表达进行标准化，并乘以 10,000 的缩放因子。
    4. 去除在少于 3 个细胞中被检测到的基因。
    5. 基于所有细胞的平均表达量和离散度识别高变基因。根据组织和细胞类型调整阈值。
  2. 利用高变基因进行主成分分析。根据选定的主成分数量对细胞进行聚类。通过将某一细胞簇与其他所有细胞进行比较，鉴定各细胞簇富集的基因。

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结果

单细胞RNA测序工作流程包括三个步骤：将完整的人胰岛解离为单细胞悬液，利用基于液滴的技术捕获单个细胞，以及分析RNA测序数据（图1）。首先，获取的人胰岛在夜间孵育。在显微镜下观察完整胰岛（图2A）。采用RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）技术验证解离后胰岛细胞的完整性。如图2B所示，分别使用GCG和INS mRNA探针对解离的α细胞和β细胞进行可视化。

在单细胞捕获步骤之前，需要确定细胞数量和活力。活力较低或碎片较多的细胞不适合进行后续处理。理想的细胞浓度通常为 400 至 500 个细胞/µL在单细胞分离步骤中，将约6000个细胞加载至微流控芯片中， 100 μL 从芯片中移除了乳液中的凝胶珠。

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讨论

近年来发展的单细胞技术为鉴定细胞类型和研究人类胰岛细胞的分子异质性提供了新平台。我们采用基于液滴微流控的单细胞分离与数据分析方案来研究人类胰岛。该方案成功获得了来自超过20,000个单个人类胰岛细胞的RNA测序数据，且测序质量与批次效应的变异相对较小。

具体而言，本方案中有两个步骤对获得高质量结果至关重要。在解离人胰岛时需格外小心，应注意避免过度消化胰岛。单细胞分液是成功开展单细胞实验的另一个关键步骤。我们在图3中展示了高质量与低质量乳浊液的示例。清晰的乳浊液通常表明在分液步骤中收集到的细胞数量不足。

获取分离的原代人胰岛是构建大规模人胰岛单细胞转录组的一个限速步骤。来自不同尸体供体的分离胰岛通常在不同时间进行处理，因此在数据分析过程中应仔细评估潜在的样本依赖性批次效应。整合分析可用于识别不同批次间共同的细胞类型和亚群41。批次效应也可通过批次校正的表达量量化方法进行调整42

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披露

所有作者均为 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. 的员工和股东。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30 µm 预分离滤器Miltenyi Biotec130-041-407细胞滤筛
8孔板Chemometec102673-680Dell 计数法载玻片
Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 试剂盒安捷伦5067-4626用于质量控制
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9647单细胞培养基
铬单细胞3'文库 & 凝胶珠试剂盒 v2，16次反应10X Genomics120237单细胞试剂
Chromium单细胞A芯片试剂盒v2，48次反应（6个芯片）10X Genomics120236微流控芯片
CMRL-1066ThermoFisher11530-037完全胰岛培养基
EB缓冲液Qiagen19086洗脱缓冲液
Eppendorf twin-tec 96孔PCR板，蓝色，半裙边VWR47744-112乳液板
胎牛血清ThermoFisher16000-036完全胰岛培养基
人胰岛Prodo LabsHIR分离的人胰岛
L-谷氨酰胺（200 mM）ThermoFisher25030-081完全胰岛培养基
Nextera DNA文库制备试剂盒（96个样本）IlluminaFC-121-1031文库构建试剂
NextSeq 500/550 高输出试剂盒 v2.5（75 个循环）IlluminaFC-404-2005测序
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）ThermoFisher15140-122完全胰岛培养基
Qubit 高灵敏度 dsDNA 检测试剂盒Life TechnologiesQ32854用于质量控制
溶液18Chemometec103011-420细胞计数实验试剂
SPRISelect 试剂Fisher ScientificB23318纯化珠
组织培养皿（10 cm）VWR10861-594用于胰岛培养
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013细胞解离液
Zymo DNA Clean & 浓缩仪-5，50 次反应VWR77001-152文库纯化柱

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