单细胞RNA测序及人胰岛分析

摘要

本文介绍了一种利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，从分离的人胰岛中生成高质量、大规模单细胞转录组数据的实验方案。

摘要

胰岛由具有独特激素表达模式的内分泌细胞组成。这些内分泌细胞在正常和病理条件下表现出功能差异。本实验方案的目标是利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，获得每种内分泌细胞类型的高质量、大规模转录组数据。此类数据可用于构建在正常或特定条件下每种内分泌细胞类型的基因表达谱。该过程需要谨慎操作、精确测量以及严格的质控。在本方案中，我们详细描述了人胰岛组织的解离、测序及数据分析的具体步骤。约20,000个人类单胰岛细胞的代表性结果展示了该方案的成功应用。

引言

胰岛释放内分泌激素以调节血糖水平。五种在功能和形态上各不相同的内分泌细胞参与这一重要功能：α细胞产生胰高血糖素，β细胞产生胰岛素，δ细胞产生生长抑素，PP细胞产生胰多肽，ε细胞产生饥饿素¹。基因表达谱分析是表征正常或特定条件下内分泌细胞的有用方法。传统上，全胰岛基因表达谱通过微阵列和下一代RNA测序技术获得^{2,3,4,5,6,7,8}。尽管全胰岛转录组有助于识别器官特异性转录本和疾病候选基因，却无法揭示每种胰岛细胞类型的分子异质性。激光显微切割（LCM）技术已被用于直接从胰岛中获取特定细胞类型^9,10,11,12，但目标细胞群体的纯度仍不足。为克服这些局限，已采用荧光激活细....

方案

1. 人胰岛解离

1. 获取来自15至80岁、性别不限的遗体器官捐献者的胰岛，除非研究目的需要特定人群捐献者的胰岛。
   1. 分离后，将分离的胰岛在供应商处的组织培养设施中保存2-3天。胰岛损伤通常需要超过1天才变得可见。
   2. 将胰岛放入瓶中，并完全浸没于胰岛培养基中，通过隔夜运输送至实验室。
   3. 从胰岛供应商处获取所运送胰岛的胰岛当量（IEQ）数量。
2. 在胰岛到达当日进行复苏。此步骤应在生物安全柜中操作，以尽量减少污染风险。
   1. 将完全胰岛培养基（CMRL-1066，10% (v/v) FBS，1×青霉素-链霉素，2 mM谷氨酰胺）置于冰箱中冷却。
   2. 将胰岛从瓶中转移至一个50 mL锥形管中。
   3. 向空瓶中加入10 mL预冷的完全胰岛培养基，冲洗残留的胰岛，并将液体转移至锥形管中。
   4. 以200 x g离心2分钟以回收胰岛。吸除上清液，保留约1-2 mL培养基与沉淀一同留存。
   5. 用预冷的完全胰岛培养基重悬胰岛。根据供应商提供的IEQ数值，每5000 IEQ加入12 mL培养基。
   6. 将含胰岛的培养基倒入一个10 cm未经处理的组织培养皿中，在37 °C、5% CO₂的空气环境中孵育过夜。
3. 按以下方法对胰岛进行解离。此....

结果

单细胞RNA测序工作流程包括三个步骤：将完整的人胰岛解离为单细胞悬液，利用基于液滴的技术捕获单个细胞，以及分析RNA测序数据（图1）。首先，获取的人胰岛在夜间孵育。在显微镜下观察完整胰岛（图2A）。采用RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）技术验证解离后胰岛细胞的完整性。如图2B所示，分别使用GCG和INS mRNA探针对解离的α细胞和β细胞进行可视化。

在单细胞捕获步骤之前，需要确定细胞数量和活力。活力较低或碎片较多的细胞不适合进行后续处理。理想的细胞浓度通常为 400 至 500 个细胞/µL在单细胞分离步骤中，将约6000个细胞加载至微流控芯片中， 100 μL 从芯片中移除了乳液中的凝胶珠。

讨论

近年来发展的单细胞技术为鉴定细胞类型和研究人类胰岛细胞的分子异质性提供了新平台。我们采用基于液滴微流控的单细胞分离与数据分析方案来研究人类胰岛。该方案成功获得了来自超过20,000个单个人类胰岛细胞的RNA测序数据，且测序质量与批次效应的变异相对较小。

具体而言，本方案中有两个步骤对获得高质量结果至关重要。在解离人胰岛时需格外小心，应注意避免过度消化胰岛。单细胞分液是成功开展单细胞实验的另一个关键步骤。我们在图3中展示了高质量与低质量乳浊液的示例。清晰的乳浊液通常表明在分液步骤中收集到的细胞数量不足。

获取分离的原代人胰岛是构建大规模人胰岛单细胞转录组的一个限速步骤。来自不同尸体供体的分离胰岛通常在不同时间进行处理，因此在数据分析过程中应仔细评估潜在的样本依赖性批次效应。整合分析可用于识别不同批次间共同的细胞类型和亚群⁴¹。批次效应也可通过批次校正的表达量量化方法进行调整⁴²

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30 µm 预分离滤器	Miltenyi Biotec	130-041-407	细胞滤筛
8孔板	Chemometec	102673-680	Dell 计数法载玻片
Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 试剂盒	安捷伦	5067-4626	用于质量控制
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647	单细胞培养基
铬单细胞3'文库 & 凝胶珠试剂盒 v2，16次反应	10X Genomics	120237	单细胞试剂
Chromium单细胞A芯片试剂盒v2，48次反应（6个芯片）	10X Genomics	120236	微流控芯片
CMRL-1066	ThermoFisher	11530-037	完全胰岛培养基
EB缓冲液	Qiagen	19086	洗脱缓冲液
Eppendorf twin-tec 96孔PCR板，蓝色，半裙边	VWR	47744-112	乳液板
胎牛血清	ThermoFisher	16000-036	完全胰岛培养基
人胰岛	Prodo Labs	HIR	分离的人胰岛
L-谷氨酰胺（200 mM）	ThermoFisher	25030-081	完全胰岛培养基
Nextera DNA文库制备试剂盒（96个样本）	Illumina	FC-121-1031	文库构建试剂
NextSeq 500/550 高输出试剂盒 v2.5（75 个循环）	Illumina	FC-404-2005	测序
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	ThermoFisher	15140-122	完全胰岛培养基
Qubit 高灵敏度 dsDNA 检测试剂盒	Life Technologies	Q32854	用于质量控制
溶液18	Chemometec	103011-420	细胞计数实验试剂
SPRISelect 试剂	Fisher Scientific	B23318	纯化珠
组织培养皿（10 cm）	VWR	10861-594	用于胰岛培养
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013	细胞解离液
Zymo DNA Clean & 浓缩仪-5，50 次反应	VWR	77001-152	文库纯化柱