本方案描述了从手术获取的胃癌样本中建立患者来源的异种移植（PDX）模型和原代癌细胞系的方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有用的工具。
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摘要
摘要
利用临床前模型来加深对肿瘤生物学的理解并研究治疗药物的疗效，是癌症研究的关键。尽管目前已建立多种胃癌细胞系以及多种传统的转基因小鼠模型用于临床前研究，但这些体外和体内模型的缺点限制了其应用。由于这些模型在培养过程中特性已发生变化，无法再模拟肿瘤异质性，其对药物的反应也无法准确预测人体内的反应。因此，研究人员正在开发能够更好地体现肿瘤异质性的替代模型。源自患者的异种移植（PDX）模型可保留癌细胞的组织学形态，维持肿瘤内部的异质性，并更真实地反映肿瘤微环境中相关的人源成分。然而，构建一个PDX模型通常需要4至8个月，这超过了多数胃癌患者的预期生存期。鉴于此，建立原代癌细胞系可能是药物反应研究的一种有效补充方法。本实验方案描述了从手术切除的胃癌样本中建立PDX模型和原代癌细胞系的技术方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有力工具。
引言
胃癌是全球第五大常见癌症，也是癌症死亡的第三大原因。2018年，全球确诊胃癌新病例超过100万例，估计有78.3万人死于该疾病1。胃癌的发病率和死亡率在东亚东北部国家仍然很高2,3。尽管癌症治疗领域已取得显著进展，但晚期胃癌患者的预后仍然较差，五年生存率约为25%4,5,6,7,。因此，迫切需要开发新的胃癌治疗策略
胃癌的治疗具有挑战性，因其具有高度异质性8,9。 因此，如何应对肿瘤异质性带来的挑战以实现精准医疗，是癌症研究的核心问题。体外和体内模型在阐明胃癌的异质性机制和生物学特性方面发挥着关键作用。然而，尽管目前已有多种胃癌细胞系以及大量用于临床前研究的传统转基因小鼠模型，但这些模型的缺点限制了其应用10。由于这些模型在培养过程中特性已发生变化，无法再反映肿瘤异....
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方案
本项人体研究已获得中国广州中山大学肿瘤防治中心（SYSUCC）机构伦理审查委员会的批准。动物研究已获得中山大学机构动物护理和使用委员会的批准。 注：所有实验均遵循相关法律法规及机构指南，包括《职业性接触血源性病原体防护指南》。
1. 样品制备
- 直接从手术中获取胃癌组织（P0 = 第0代），肿瘤标本体积应大于0.5 cm3。
- 准备3–4 mL培养基储备液：例如，添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基（1×）。
- 将新鲜肿瘤标本置于储备液中，4 °C保存，时间不超过4小时。
2. 建立PDX模型（图1）
- 为确保手术区域无菌，将所有材料用紫外线照射消毒超过 30 分钟，然后转移至动物实验室。
注意：在使用二氯异氰尿酸钠消毒剂清洁台面之前，需先用紫外线对操作室照射消毒 30 分钟。随后使用聚维酮碘对皮肤进行消毒。 - 在无菌条件下，使用镊子和剪刀小心分离肿瘤组织，并将其修剪成若干小块（约 1 mm3 的立方体）。
- 使用麻醉机，通过暴露于 1–1.5% 异氟烷对 5 至 7 周龄的雌性 NOD-S....
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结果
在此，手术获取的肿瘤组织被保存在储存液中，直至进行下一步操作。4小时内，将肿瘤组织切成小块，并植入已用异氟烷浸润的棉球麻醉的NSG小鼠背部侧 flank 区域。体积大于1 cm3 的肿瘤可被切除，用于移植至新的小鼠（图1），或小心切片后按照方案保存于液氮中。本研究中，第一代肿瘤的生长速度较慢，需3周或更长时间才能达到适宜大小。第一代皮下肿瘤成瘤的成功率超过80%。我们通过显微镜下苏木精-伊红（H&E）染色确认了PDX模型中癌细胞的身份（图3C）。最终，由冻存肿瘤组织进行移植后肿瘤形成的成功率约为95%。
原代癌细胞的分离是研究个体肿瘤的另一种方法。这些细胞来源于手术标本或PDX模型。肿瘤组织用DPBS洗涤后切成小块。组织碎片经Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶（1:14）充分消化后进行过滤。去除红细胞后，细胞以与其他癌细胞相同的方式进行培养。存活的间充质细胞在后续传代中会死亡（图2）。根据.......
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讨论
胃癌是一种侵袭性强且治疗选择有限的疾病，因此胃癌模型已成为支持功能研究并直接向临床转化的关键资源4,8,17。本文中，我们描述了建立胃癌患者来源的异种移植（PDX）模型和原代细胞系的方法与实验方案。重要的是，胃癌标本的形态学和生物学特性在PDX模型中基本得以保留。
在建立PDX模型的实验方案中，有一些关键点需要特别强调，以提高移植成功率。推荐使用NSG（NOD-SCID-IL2rg）小鼠作为免疫缺陷小鼠模型，因为这类小鼠的免疫抑制程度更为严重，缺乏T细胞、B细胞和NK细胞18,19,20,21。此外，由于小鼠免疫缺陷严重，所有实验操作必须保持无.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（81572392）；国家重点研发计划（2016YFC1201704）；广东省特支计划杰出青年科技人才项目（2016TQ03R614）的资助。
我们特别感谢广州赛基生物技术有限公司在图示制备过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 40 μm 细胞筛 | Biologix, 山东, 中国 | 15-1040 | |
| 生物显微镜 | OLYMPUS, 东京, 日本 | OLYMPUS CKX41 | |
| 离心机 | Eppendorf, 米特尔萨克森, 德国 | 5427R | |
| CO2 培养箱 | Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国 | HERACELL 150i | |
| DPBS | Basalmedia Technology, 上海, 中国 | L40601 | |
| 电热恒温水浴箱 | 一恒, 上海, 中国 | DK-8AXX | |
| 胎牛血清 | Wisent Biotechnology, 温哥华, 加拿大 | 86150040 | |
| 异氟烷 | Baxter, 中国 | CN2L9100 | |
| 活体组织冷冻试剂盒 | Celliver Biotechnology, 上海, 中国 | LT2601 | |
| 活体组织解冻试剂盒 | Celliver Biotechnology, 上海, 中国 | LT2602 | |
| NSG 小鼠 | 百奥赛图, 北京, 中国 | B-CM-002-4-5W | |
| 青霉素&链霉素 | Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国 | 15140122 | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio, 北京, 中国 | R1010 | |
| RPMI-1640 培养基 | Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国 | 8118367 | |
| 带线外科缝合针 | 灵桥, 宁波, 中国 | 3/8 弧形 4×10 | |
| 组织处理模具及辅助刀片 | Celliver Biotechnology, 上海, 中国 | LT2603 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国 | 2003779 | |
| I 型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国 | 17100017 |
参考文献
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. Ca-a Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Sugano, K.
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