需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

建立胃癌患者来源的异种移植模型和原代细胞系

10.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59871

⸱

2019年7月19日

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oncology in South China, Collaborative Innovation Center for Cancer Medicine, Sun Yat-sen University Cancer Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了从手术获取的胃癌样本中建立患者来源的异种移植（PDX）模型和原代癌细胞系的方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有用的工具。

摘要

利用临床前模型来加深对肿瘤生物学的理解并研究治疗药物的疗效，是癌症研究的关键。尽管目前已建立多种胃癌细胞系以及多种传统的转基因小鼠模型用于临床前研究，但这些体外和体内模型的缺点限制了其应用。由于这些模型在培养过程中特性已发生变化，无法再模拟肿瘤异质性，其对药物的反应也无法准确预测人体内的反应。因此，研究人员正在开发能够更好地体现肿瘤异质性的替代模型。源自患者的异种移植（PDX）模型可保留癌细胞的组织学形态，维持肿瘤内部的异质性，并更真实地反映肿瘤微环境中相关的人源成分。然而，构建一个PDX模型通常需要4至8个月，这超过了多数胃癌患者的预期生存期。鉴于此，建立原代癌细胞系可能是药物反应研究的一种有效补充方法。本实验方案描述了从手术切除的胃癌样本中建立PDX模型和原代癌细胞系的技术方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有力工具。

引言

胃癌是全球第五大常见癌症，也是癌症死亡的第三大原因。2018年，全球确诊胃癌新病例超过100万例，估计有78.3万人死于该疾病1。胃癌的发病率和死亡率在东亚东北部国家仍然很高2,3。尽管癌症治疗领域已取得显著进展，但晚期胃癌患者的预后仍然较差，五年生存率约为25%4,5,6,7,。因此，迫切需要开发新的胃癌治疗策略

胃癌的治疗具有挑战性，因其具有高度异质性8,9。 因此，如何应对肿瘤异质性带来的挑战以实现精准医疗，是癌症研究的核心问题。体外和体内模型在阐明胃癌的异质性机制和生物学特性方面发挥着关键作用。然而，尽管目前已有多种胃癌细胞系以及大量用于临床前研究的传统转基因小鼠模型，但这些模型的缺点限制了其应用10。由于这些模型在培养过程中特性已发生变化，无法再反映肿瘤异质性，其对药物的反应也无法预测人体内的真实响应11。这些问题严重限制了识别可能对靶向药物产生反应的癌症患者亚群的可能性。原发肿瘤的短期培养为研究抗肿瘤药理特性提供了一种相对较快且个性化的途径，这很可能成为个体化癌症治疗的标志性方法。

患者来源的异种移植模型（PDX）是药物反应谱分析的优选临床前替代模型12。此外，PDX模型为研究癌症的发生和进展提供了有力工具13,14。PDX模型能够保持癌细胞的组织学特征，保留肿瘤内的异质性，并更真实地反映肿瘤微环境中相关的人源组分15,16。然而，目前广泛使用的PDX模型存在建立和连续传代人源实体瘤成功率较低的局限性。本研究描述了较为成功的小鼠PDX模型及原代细胞系的建立方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本项人体研究已获得中国广州中山大学肿瘤防治中心（SYSUCC）机构伦理审查委员会的批准。动物研究已获得中山大学机构动物护理和使用委员会的批准。 注：所有实验均遵循相关法律法规及机构指南，包括《职业性接触血源性病原体防护指南》。

1. 样品制备

  1. 直接从手术中获取胃癌组织（P0 = 第0代），肿瘤标本体积应大于0.5 cm3。
  2. 准备3–4 mL培养基储备液：例如，添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基（1×）。
  3. 将新鲜肿瘤标本置于储备液中，4 °C保存，时间不超过4小时。

2. 建立PDX模型（图1）

  1. 为确保手术区域无菌，将所有材料用紫外线照射消毒超过 30 分钟，然后转移至动物实验室。
    注意：在使用二氯异氰尿酸钠消毒剂清洁台面之前，需先用紫外线对操作室照射消毒 30 分钟。随后使用聚维酮碘对皮肤进行消毒。
  2. 在无菌条件下，使用镊子和剪刀小心分离肿瘤组织，并将其修剪成若干小块（约 1 mm3 的立方体）。
  3. 使用麻醉机，通过暴露于 1–1.5% 异氟烷对 5 至 7 周龄的雌性 NOD-SCID-IL2rg（NSG）小鼠进行麻醉。
    1. 将小鼠麻醉至不再挣扎但仍保持均匀呼吸的状态。
      注意：50 mL 离心管是一种简易装置，功能类似于麻醉机。由于手术时间较短，无需使用兽用眼膏防止角膜干燥。
  4. 使用无菌剪刀在小鼠两侧背部外侧做 1 cm 切口，并将一块肿瘤组织植入每侧背部。
    1. 为防止肿瘤组织滑出，使用无菌镊子破坏皮下组织。然后夹取一块肿瘤组织，将其置于较深的位置。
  5. 使用外科缝合针进行皮下缝合以关闭植入部位，并用标记好的耳标对小鼠耳朵进行标记。
  6. 用碘对伤口进行消毒。
  7. 术后将小鼠轻轻放置于空笼中，保持胸卧位。密切观察小鼠状态；它们通常在约 3–4 分钟后苏醒并开始行走。将接受手术的小鼠放入另一个新笼子中，与未接受手术的小鼠分开饲养。
  8. 通过触诊移植部位评估肿瘤大小，每周使用游标卡尺测量肿瘤两次。
  9. 当肿瘤直径达到 10 mm，或动物状况恶化，或肿瘤发生溃疡时，采用经 IRB 批准的方法处死小鼠。将收获的新鲜肿瘤组织碎片重新植入 2 只新的小鼠中进行传代，或将标本暂时保存在冰上的 PBS 中，用于原代细胞系的分离。

3. 组织冷冻保存

注意：本部分主要参考活体组织冷冻试剂盒的操作方法。主要试剂盒和设备列于材料表中。

  1. 当肿瘤直径超过10 mm时，采用经伦理审查委员会（IRB）批准的方法对小鼠实施安乐死。
  2. 使用无菌镊子和剪刀，缓慢从小鼠体内分离肿瘤组织。
  3. 在10 cm培养皿中用DPBS清洗肿瘤组织，使用镊子和剪刀剥离坏死区域、脂肪组织、血凝块及结缔组织。
  4. 使用模具将肿瘤组织切成最大厚度为1 mm的薄片。
  5. 在10 cm培养皿中用DPBS清洗组织切片。
    注意：玻璃化冷冻过程在步骤3.6–3.8中涉及标记为V1/V2/V3的试管，其主要成分为DMSO和蔗糖。
  6. 用镊子将切片转移至V1管中，在4 °C孵育4分钟；短暂滚动并倒置试管，再于4 °C放置4分钟。
  7. 将V1溶液和切片倒入10 cm培养皿中，用镊子将切片转移至V2管中，在4 °C孵育4分钟；短暂滚动并倒置试管，再于4 °C放置4分钟。
  8. 将V2溶液和切片倒入10 cm培养皿中，用镊子将切片转移至V3管中，在4 °C孵育5分钟；短暂滚动并倒置试管，再于4 °C放置至少5分钟。确保所有切片均沉入管底。
    1. 若仍有数个切片漂浮，可再次短暂滚动并倒置试管，重新置于4 °C直至所有切片完全下沉；必要时可弃去漂浮的切片。
  9. 将V3溶液和切片倒入10 cm培养皿中。
  10. 将组织载体剪裁至适当长度，放置于无菌纱布上；将切片转移至载体上，用纱布包裹载体，用镊子夹取后放入液氮中，随后孵育5分钟。
  11. 在冻存管上标注组织相关信息。
  12. 将带有组织切片的载体转移至冻存管中，并储存在液氮中。

4. 原代细胞的分离（图2）

  1. 使用高压蒸汽在 121 °C 下对镊子和剪刀灭菌 30 分钟。
  2. 从切除的标本或收获的 PDX 组织中切除胃癌样本。将组织置于冰上，然后转移至一个 10 cm 的无菌培养皿中。
  3. 用镊子和剪刀解剖并去除坏死区域、脂肪组织、血凝块和结缔组织。
  4. 在 10 cm 培养皿中，用含有 100 U/mL 青霉素和 0.1 mg/mL 链霉素的 DPBS 清洗肿瘤组织一次。
  5. 在培养皿盖上将肿瘤组织切成 1 mm3 的小块；每块的最大厚度应为 1 mm。
  6. 将组织转移至一个 50 mL 离心管中，加入约 7 mL 的 I 型胶原酶和胰蛋白酶（1:14）溶液。短暂涡旋混合。
  7. 将离心管置于 37 °C 水浴中孵育 30–40 分钟，每 5 分钟涡旋一次。
  8. 向管中加入等体积的含 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基（1x），充分涡旋混合。
  9. 通过 40 μm 滤膜缓慢过滤，将混合物转移至新的 50 mL 离心管中。
    注意：使用 40 μm 滤膜可确保更高的癌细胞比例。如有需要，可使用 100 μm 滤膜以保留更多类型的细胞，例如免疫细胞。
  10. 在室温下以 113–163 × g 离心 5–7 分钟，小心去除上清液。
  11. 用 5 mL PBS 重悬沉淀，小心去除上清液。
  12. 如果沉淀呈红色，说明含有大量红细胞。用 500 μL 红细胞裂解缓冲液轻轻重悬沉淀，孵育 5 分钟后加入 5 mL PBS，再小心去除上清液。
  13. 用培养基重悬沉淀，并将混合物转移至无菌的 10 cm 培养皿中。
  14. 每 2–3 天更换一次含血清的培养基。
  15. 当原代细胞达到 50% 汇合度时，使用胰蛋白酶/EDTA 进行传代。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在此，手术获取的肿瘤组织被保存在储存液中，直至进行下一步操作。4小时内，将肿瘤组织切成小块，并植入已用异氟烷浸润的棉球麻醉的NSG小鼠背部侧 flank 区域。体积大于1 cm3 的肿瘤可被切除，用于移植至新的小鼠（图1），或小心切片后按照方案保存于液氮中。本研究中，第一代肿瘤的生长速度较慢，需3周或更长时间才能达到适宜大小。第一代皮下肿瘤成瘤的成功率超过80%。我们通过显微镜下苏木精-伊红（H&E）染色确认了PDX模型中癌细胞的身份（图3C）。最终，由冻存肿瘤组织进行移植后肿瘤形成的成功率约为95%。

原代癌细胞的分离是研究个体肿瘤的另一种方法。这些细胞来源于手术标本或PDX模型。肿瘤组织用DPBS洗涤后切成小块。组织碎片经Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶（1:14）充分消化后进行过滤。去除红细胞后，细胞以与其他癌细胞相同的方式进行培养。存活的间充质细胞在后续传代中会死亡（图2）。根据...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

胃癌是一种侵袭性强且治疗选择有限的疾病，因此胃癌模型已成为支持功能研究并直接向临床转化的关键资源4,8,17。本文中，我们描述了建立胃癌患者来源的异种移植（PDX）模型和原代细胞系的方法与实验方案。重要的是，胃癌标本的形态学和生物学特性在PDX模型中基本得以保留。

在建立PDX模型的实验方案中，有一些关键点需要特别强调，以提高移植成功率。推荐使用NSG（NOD-SCID-IL2rg）小鼠作为免疫缺陷小鼠模型，因为这类小鼠的免疫抑制程度更为严重，缺乏T细胞、B细胞和NK细胞18,19,20,21。此外，由于小鼠免疫缺陷严重，所有实验操作必须保持无...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（81572392）；国家重点研发计划（2016YFC1201704）；广东省特支计划杰出青年科技人才项目（2016TQ03R614）的资助。

我们特别感谢广州赛基生物技术有限公司在图示制备过程中提供的帮助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
40 μm 细胞筛Biologix, 山东, 中国15-1040
生物显微镜OLYMPUS, 东京, 日本OLYMPUS CKX41
离心机Eppendorf, 米特尔萨克森, 德国5427R
CO2 培养箱Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国HERACELL 150i
DPBSBasalmedia Technology, 上海, 中国L40601
电热恒温水浴箱一恒, 上海, 中国DK-8AXX
胎牛血清Wisent Biotechnology, 温哥华, 加拿大86150040
异氟烷Baxter, 中国CN2L9100
活体组织冷冻试剂盒Celliver Biotechnology, 上海, 中国LT2601
活体组织解冻试剂盒Celliver Biotechnology, 上海, 中国LT2602
NSG 小鼠百奥赛图, 北京, 中国B-CM-002-4-5W
青霉素&链霉素Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国15140122
红细胞裂解液Solarbio, 北京, 中国R1010
RPMI-1640 培养基Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国8118367
带线外科缝合针灵桥, 宁波, 中国3/8 弧形 4×10
组织处理模具及辅助刀片Celliver Biotechnology, 上海, 中国LT2603
胰蛋白酶-EDTAThermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国2003779
I 型胶原酶Thermo Fisher Scientific, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚, 美国17100017

参考文献

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. Ca-a Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Sugano, K. Screening of gastric cancer in Asia. Best Practive & Research in Clinical Gastroenterology. 29 (6), 895-905 (2015).
  3. Nikfarjam, Z., et al. Demographic survey of four thousand patients with 10 common cancers in North Eastern Iran over the past three decades. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (23), 10193-10198 (2014).
  4. Coccolini, F., et al. Advanced gastric cancer: What we know and what we still have to learn. World Journal of Gastroenterology. 22 (3), 1139-1159 (2016).
  5. Goetze, O. T., et al. Multimodal treatment in locally advanced gastric cancer. Updates in Surgery. 70 (2), 173-179 (2018).
  6. Graziosi, L., Marino, E., Donini, A. Multimodal Treatment of Locally Advanced Gastric Cancer: Will the West Meet the East? Annals of Surgical Oncology. 26 (3), 918(2019).
  7. Choi, Y. Y., Noh, S. H., Cheong, J. H. Evolution of Gastric Cancer Treatment: From the Golden Age of Surgery to an Era of Precision Medicine. Yonsei Medical Journal. 56 (5), 1177-1185 (2015).
  8. Zhang, W. TCGA divides gastric cancer into four molecular subtypes: implications for individualized therapeutics. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (10), 469-470 (2014).
  9. Tirino, G., et al. What's New in Gastric Cancer: The Therapeutic Implications of Molecular Classifications and Future Perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  10. Roschke, A. V., et al. Karyotypic complexity of the NCI-60 drug-screening panel. Cancer Research. 63 (24), 8634-8647 (2003).
  11. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Xu, C., et al. Patient-derived xenograft mouse models: A high fidelity tool for individualized medicine. Oncology Letters. 17 (1), 3-10 (2019).
  14. Lai, Y., et al. Current status and perspectives of patient-derived xenograft models in cancer research. Journal OF Hematology & Oncology. 10 (1), 106(2017).
  15. Kawaguchi, T., et al. Current Update of Patient-Derived Xenograft Model for Translational Breast Cancer Research. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 131-139 (2017).
  16. Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Research. 75 (15), 2963-2968 (2015).
  17. Liu, X., Meltzer, S. J. Gastric Cancer in the Era of Precision Medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (3), 348-358 (2017).
  18. Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. (7), Cold Spring Harbor. 694-708 (2014).
  19. McDermott, S. P., et al. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  20. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma (c) (null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  21. Wege, A. K., et al. Co-transplantation of human hematopoietic stem cells and human breast cancer cells in NSG mice: a novel approach to generate tumor cell specific human antibodies. MAbs. 6 (4), 968-977 (2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

NSG 小鼠肿瘤组织移植皮下注射胶原酶-胰蛋白酶消化冷冻保存方案H&E 染色药物反应研究
建立胃癌患者来源的异种移植模型和原代细胞系
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。