Caenorhabditis elegans中 2-阿拉希多诺诺基甘油定量的分解标准合成

摘要

这项工作描述了一个强大和直接的方法，以检测和量化内分泌大麻素2-阿拉基诺诺甘醇（2-AG）在C.elegans。我们通过同位素稀释和液相色谱-电喷雾电化-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）制备并用于2-AG定量的分析化标准。

摘要

本工作提出了一种通过液相色谱-电喷雾电化-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）定性和定量分析2-阿拉基诺诺基甘油（2-AG）的分析标准的方法。内分泌大麻素是调节多种生物的多种生物过程的保存脂质中介物。在C.elegans中，2-AG被发现具有不同的作用，包括调节达瑙形成和胆固醇代谢。本报告描述了一种克服与2-AG量化所需的去化标准的成本和稳定性相关的困难的方法。标准合成程序简单，可在任何实验室进行，无需有机合成专业知识或特殊设备。此外，还描述了Folch从C.elegans文化中提取分离标准的方法的修改。最后，描述了一种使用稳定等位标记模拟1-AG-d₅检测2-AG的定量和分析方法，在快速色谱运行中提供了可靠的结果。该程序可用于研究 2-AG 在C. elegan 中的多重作用，同时也适用于不同生物体中代谢物的其他研究。

引言

内分泌大麻素调节多种生物过程中的多种生物过程，并保存脂质^中介1。首次发现且特征最良好的内分泌大麻素是安丹酰胺（阿拉基诺诺醇酰胺，AEA）和2-阿拉奇诺诺基甘油（2-AG）。内分泌大麻素起许多关键作用，包括那些参与大脑奖励系统以及毒瘾，记忆，情绪和代谢^过程2。AEA和2-AG仅在需要时合成，寿命短，通过运输蛋白再摄入和水^解3降解。

使用动物模型，如Caenorhabditis elegans （C. elegans）已成为研究各种生物过程，包括凋亡、 细胞信号、 细胞周期、 细胞极性、 基因调控、 代谢、 老化、和性别^{决定4，5。}此外，C. elegans是研究多不饱和脂肪酸 （PUFAs） 生理作用的极佳模型。AEA已在C.elegans中被识别，并在饮食^限制6下减少。这种缺陷通过膳食限制机制延长线虫的寿命，这种机制可以通过补充内分泌大麻素来抑制。最近，人们发现2-AG和AEA在管制C.elegans7的胆固醇贩运方面起着基础性作用。更重要的是，它确定，补充外源性2-AG可以拯救牛逮捕，这是由在尼曼-皮克C1型C.elegans突变体中胆固醇贩运受损引起的。

为了更好地了解2-AG与线虫中胆固醇贩运和其他生物过程的关系（即单胺能信号、异位信号和运动），研究这种内源代谢物及其表现至关重要受某些环境和饮食条件影响8、9、10、11、12、13。因此，必须设计和优化一种检测和量化C.elegan中内源性2-AG的方法，这种方法对于不同领域的科学家来说都很简单，特别是那些研究线虫行为的人。内分泌大麻素。

2008 年，Lethonen 和同事使用 LC-MS 分析方法¹⁴成功识别了C. elegan 的2-AG 和 AEA。2011年，他们成功地将这项技术推广到其他内分泌大麻^素15。最近的研究已经表明，其他分析方法已经成功地检测和量化了C.elegans中的内分泌大麻素，包括质谱和GC-MS 16、17、18，并且它有另据报道，类似的分析方法可以扩展到其他^型号19。

以前报告用于量化生物样品中2-AG的分析方法通常涉及使用商业上获取的脱化标准，并要求^{购买20、21。}用于内分泌大麻素的LC-MS/MS定量的许多分析标准可从不同供应商获得。然而，它们价格昂贵，敏感，并且随着时间的推移变得氧化，因为存在多个双键。这些标准最常见的版本是基于八度脱化的阿拉奇酮酸，适合通过同位素稀释LC-MS/MS^14，22定量。此外，这些标准大多被替换为甘油的位置2，使它们在大多数条件下不稳定，因为它们容易发生丙基^{迁移19，23}。

为了克服与这些去水标准的成本和稳定性相关的困难，提出了一种方便而简单的方法来准备基于甘油-d₅的分析标准。准备五角星标准的顺序需要三步程序，结果为标准的1-AG-d_5，这是稳定的，不进行丙基迁移（在旨在合成2个单酸甘油时的主要问题）。

这里的主要目标是展示一种简单且可重复的方法，用于研究C.elegans中的2-AG，包括分析化标准的综合、线虫样品的制备和提取，以及LC-MS/MS的分析（图1）).这种合成程序在没有精密的有机合成知识或特殊设备的情况下是可以实现的，因此适合不同领域的科学家，他们正在研究在内分泌素影响下对C.elegans的行为。该方法还可以扩展到其他研究模型，使其适用于不同的目标。此处报告的标准已应用于成功开发一种快速可靠的色谱方法，以便以可重现的方式有效检测和定量 2-AG。

方案

1. 1-AG-d₅准备

注:为了获得1-AG-d₅作为定量检测的内部标准，请遵循如下详细协议。

1. 差分保护
   1. 为了只保护原发性酒精，首先使用巴斯德移液器在10 mL反应管中加入38毫克甘油-d_8，然后加入磁搅拌器。
   2. 使用 5 mL 汉密尔顿注射器加入 5 mL 无水二氯甲烷 （DCM），并用干 N₂填充管，产生惰性大气。
   3. 使用装满蒸馏乙酸乙酸的浅德瓦尔烧瓶准备浴缸。
   4. 将密封反应管放入浴缸内，在乙酸乙酯中缓慢加入_液体N2，直至溶剂冷冻，使其冷却。
      注意:液体在室温 （RT） 下剧烈沸腾，接触眼睛和皮肤时可引起严重烧伤。
   5. 使用汉密尔顿注射器加入54毫克无水胶氨酸。
      注意:科利丁是挥发性的，有非常强烈和令人不快的气味。
   6. 加入70毫克的三丁基甲基硅酸盐，并在-78°C下在磁搅拌器上搅拌整个溶液3小时。
   7. 3小时后，在RT处保持反应温暖，再搅拌12小时。
   8. 加入2 mL的盐水来淬火反应。
   9. 使用分离漏斗用2mL蒸馏二氯甲烷提取溶液3倍，每次节省有机提取物。
   10. 将三种有机提取物混合，在硫酸钠上干燥。
   11. 在真空旋转蒸发器中小心地在减压下蒸发二氯甲烷，以避免溶剂投影。
   12. 使用硅胶作为固定相和10%增加己酸/乙酸梯度，从100%己化，从100%乙酸乙酯完成，用100%乙酸乙酯完成，通过柱色谱法净化粗糙混合物。
   13. 在真空旋转蒸发器中结合含产品馏分，在减压下去除溶剂，获得纯1-O、3-O-bis-（TBDMS）甘油-d₅作为无色液体。
2. 酯
   1. 使用巴斯德移液器将 10 mg 的 1-O、3-O-bis（TBDMS）-甘油-d_5（以前合成）添加到 10 mL 反应管中，并添加磁性搅拌器。
   2. 使用 5 mL 汉密尔顿注射器加入 2 mL 无水二氯甲烷，并用干 N₂填充管，产生惰性大气。
   3. 使用冰浴将溶液冷却至 0°C。
   4. 使用多体积可调微管器加入36毫克的阿激酸，搅拌。
   5. 加入15毫克4-二甲基氨基甲酰胺，搅拌。
   6. 使用多体积可调微管器加入15毫克的N，N'-二丙丙二丙二溴二酯，搅拌。
   7. 让混合物在0°C下反应3小时。
   8. 3小时后，在RT处保持反应温暖，再搅拌12小时。
   9. 加入2 mL的水来淬火反应。
   10. 使用分离漏斗用2 mL蒸馏二氯甲烷（DCM）提取有机溶液3倍。
   11. 将三种有机提取物放入同一管中，将其干燥到硫酸钠上。
   12. 在真空旋转蒸发器中小心地在减压下蒸发二氯甲烷，以避免溶剂投影。
   13. 使用硅胶作为固定相和10%增加己酸/乙酸乙酯梯度，从100%己酸开始，用50%己酸/50%乙酸乙酯完成，通过柱色谱法净化粗糙混合物。
   14. 在真空旋转蒸发器中结合含产品馏分，在减压下去除溶剂，获得纯1-O-O-bis（TBDMS）-2-AG-d₅作为黄色液体。
3. 取消保护
   1. 使用巴斯德移液器将 15 毫克 1-O、3-O-bis（TBDMS）-2-AG-d_5（以前合成）添加到 10 mL 反应管中，并添加磁性搅拌器。
   2. 使用 5 mL 汉密尔顿注射器加入 2 mL 无水 THF，并用干燥的 N₂填充管，产生惰性大气。
   3. 使用冰浴将溶液冷却至 0°C。
   4. 使用汉密尔顿注射器在THF中加入1M四丁二醇氟化溶液的150μL滴液。
   5. 让反应温暖到RT，搅拌1小时。
   6. 1小时后，加入2 mL的水来淬火反应。
   7. 使用分离漏斗用2mL蒸馏二氯甲烷提取溶液3倍。
   8. 将三种有机提取物混合，在硫酸钠上干燥。
   9. 在真空旋转蒸发器中，在减压下蒸发二氯甲烷，以获得纯1-AG-d₅作为黄色液体。
4. 通过在硅胶 60 F₂₅₄预涂层铝板上执行的薄层色谱，监控所有反应。使用 4-甲醛乙醇溶液染色后，在 254 nm UV 灯下可视化带。

2. 标准库存和测量解决方案的准备

1. 在 ACN 的 1 mL 中溶解 1 mg 的内部标准 1-AG-d₅和声波 1 分钟，以获得 1，000 ppm 标准库存溶液。
2. 要制备用于蠕虫定量的 1，000 ppb 溶液，首先准备 10 ppm 溶液:使用汉密尔顿注射器获取 10 μL 的库存溶液，并通过添加 990 μL 的 ACN 将其稀释至 1 mL 的最终体积。
3. 从使用汉密尔顿注射器从步骤 2.2 中生产的溶液中取 100 μL，通过加入 900 μL 的 ACN 将其稀释至 1 mL 的最终体积，以获得用于定量的 1，000 ppb 溶液。
4. 在每个步骤之间进行 1 分钟的声波，以确保完全溶解。将溶液储存在-78°C，以保持标准的浓度和完整性。使用标准溶液后，在关闭小瓶之前流一些氮气，以防止氧化。

3. C. elegans的生长和维持

注:用大肠杆菌OP50播种线虫生长培养基（NGM）琼脂板，并在这些板上繁殖蠕虫。

1. 混合 3 克 NaCl 与 17 克琼脂。
2. 加入2.5克肽，然后加入975 mL的H₂O。
3. 高压灭菌50分钟，然后冷却烧瓶至55°C。
4. 混合: 1 m L 的 1 M CaCl_2，1 m MgSO₄的 1 m L， 25 mL 的 1 M KH₂PO₄缓冲液 （所有这些都以前已灭武）， 和 1 mL 的 5 mg/mL 胆固醇在乙醇.
5. 在保持无菌环境的同时，将 NGM 溶液放入 60 mm Petri 板中，将板的容量填充到其体积的三分之二。将盘子储存在 4°C。
6. 将大肠杆菌培养物从-80°C甘油储存到LB琼脂板上。让它在37°C的板上过夜。
7. 拿起单个菌落，在37°C下用搅拌在37°C处接种100 mL的液体LB。
   注: 没有必要检查 O.D.，因为此应变可以在此时间达到静止相位。
8. 拆下存储的 NGM 板，取下层流罩中的盖子，然后保持打开状态，以便从板中蒸发多余的水分。
9. 盘子干燥后，使用巴斯德移液器向板中心添加 100 μ0 μL 的 OP50大肠杆菌，而不会扩散。
10. 离开OP50大肠杆菌草坪在RT或37°C下生长8小时。
11. 加入通过次氯酸盐处理或"漂白"获得的所需数量的蠕虫胚胎（第4节）。
    注:在添加蠕虫之前，将板冷却到 RT。

4. 用于同步C elegans培养的漂白技术

1. 种子和块蠕虫到6厘米NGM板。
2. 让蠕虫生长2-3天，以获得足够的鸡蛋和肉汁成人在盘子里。
3. 一旦有足够的鸡蛋/成人，将5 mL的M9倒在盘子上。
4. 使用玻璃移液器将蠕虫转移到 15 mL 离心管中。
5. 在 2，000 x g下将管离心 2 分钟，然后将蠕虫颗粒。
6. 吸出大部分M9，避免蠕虫颗粒的干扰。
7. 添加 3 mL 漂白溶液（NaOH:NaOCl:H₂O）的 2:1:1 比率）。
8. 轻轻反转以混合溶液5分钟或直到完整的成年蠕虫数量减少。
   注意:请勿漂白超过5分钟。
9. 在 2，000 x g下离心 1 分钟，吸吸大部分漂白溶液，而不会干扰蠕虫颗粒。
10. 加入 15 mL 的 M9 并混合均匀。
11. 在 2000 x g下再次离心 1 分钟。
12. 吸出大部分M9，而不会干扰蠕虫颗粒。
13. 重复步骤 4.10-4.12 一次或两次。
14. 加入5 mL的新鲜M9和搅拌。
15. 让鸡蛋在温柔的摇动下孵化过夜。

5. 蠕虫样品制备

1. 让通过漂白程序获得的N2胚胎在M9缓冲液（15mL离心管中的5 mL）在20°C处孵化过夜。
2. 在2000 x g下离心管2分钟，收获同步L1。
3. 使用 M9 缓冲液 1x 清洗蠕虫，然后量化活 L1 蠕虫的数量。
4. 将大约 10，000 种蠕虫播种到 NGM 板（直径 10 厘米），其中 1 mL 的 OP50大肠杆菌（以前干燥）。
5. 在20°C下孵育板48小时，直到蠕虫到达L4级。
6. 在15 mL离心管中用冷M9缓冲液收获蠕虫，洗涤1次，然后将其转移到1.5 mL管中。
7. 在2000 x g下离心1分钟，消除大部分上清液，将管浸入液氮中，并储存在-80°C。

6. 脂质提取

1. 在冰上解冻大约100 μL的属于N2的冷冻蠕虫颗粒，加入1.3 mL的甲醇，并将样品声波4分钟。
2. 加入2.6 mL的氯仿和1.3 m KCl/0.08 M H₃PO_4，最终比例为1:2:1，内部标准1-AG-d₅的1，000ppb，以及丁酸羟基甲苯作为抗氧化剂，最终浓度为50微克/mL。
3. 将样品涡旋1分钟，在超声波水浴中声波15分钟。
4. 将样品涡旋2倍1分钟，在2000 x g下离心10分钟，以诱导相分离。
5. 收集下相并将其收集在干净的管中，在氮气下干燥，并将固体残留物重新悬浮在 100 μL 的 ACN 中。

7. HPLC-MS/MS的内分泌大麻素分析

1. 使用液相色谱与ESI三四极极质谱仪相结合，检测和量化线虫样品中的2-AG。
2. 对于倒相 HPLC 使用以下比率:从 0.0-0.5 分钟 H₂O:ACN （40:60），0.5-6.5 分钟 H₂O:ACN （40:60） 到 （25:75）， 6 .5-7.5 分钟 H₂O:ACN （25:75）， 7.5-8.0 分钟 H₂O:ACN （25:75） 到 （40:60）， 8.0-12.0 分钟 H₂O:ACN （40:60）。
3. 将柱温度保持在 40°C，并将自动进样器托盘温度设置为 10°C。
4. 设置以下电化条件:正电子模式;干燥气体 （N₂） 温度 = 300 °C;干燥气体流速= 10 L/min;雾化器压力 = 10 UA;和帽子。电压 = 4 千伏。
5. 对于反毒检测，使用具有以下转换的 MRM:2AG 的 379.2 m/z 到 289.2 m/z;和 384.2 m/z 到 289.2 m/z 的 1-AG-d₅。

8. 蠕虫内分泌大麻素定量

1. 使用已解内部标准 1-AG-d₅并计算 Anlyante 与内部标准的峰值面积比率。
2. 使用以下转换:2-AG 的 384.2 m/z 到 287.2 m/z;和 379.2 m/z 到 287.2 m/z 的 1-AG-d₅。
3. 使用标准的浓度值，通过与被解标准的峰值面积比进行比较，计算内源性2-AG的浓度。

结果

一个同位素标记的模拟成功地合成了从市售的d_8-甘油和阿拉奇酮酸使用3步合成方法（图2，图3）。这些步骤简单明了，不需要精密的设备、特殊控制的条件或昂贵的试剂。因此，这种方法是健壮的，可以成功地扩展到合成含有不同脂肪酸的甘油酯。

1-AG-d₅采用核磁光谱结构特征。¹H NMR 显示特征倍数为 5.44 ppm 至 4.93 ppm，该特性倍数为 5.44 ppm 至 4.93 ppm，该特性与 2.40 ppm 的八个乙烯基质子集成，与 α 位置的两个质子相相对应。在²D NMR 中，还可以看到甘油部分的五个分量可分配 2.9 ppm 到 2.7 ppm 的多倍。

讨论

内分泌大麻素是一类脂质，在C.elegans7中涉及对种黄的调节。更具体地说，多不饱和脂肪酸（PUFAs）的合成对胆固醇贩运和蠕虫的生殖发育非常重要。据此间透露，2-AG是一种含有内分泌大麻素的甲壳类酸，负责使达尔幼虫在^{胆固醇代谢受损的}蠕虫中恢复其正常周期。

鉴于最近发现的2-AG在提高胆固醇贩运和其他生物过程的重要性，以及对脂质如何影响这一过程知之甚少，有必要为这种内分泌大麻素提供可靠的检测方法。成功开发这种简单而强大的合成方法，以获得去化模拟1-AG-d₅是该协议的关键步骤。

所报告的量化单基甘油的大多数方法都涉及使用商业上可用的分析标准，这些标准在常规储存条件下通常昂贵且不稳定。这使得他们不方便研究人员谁需要大量的标准和新鲜库存。对于预算较低的实验室，它们也无法访问。然而，这种方法克服了这一障碍，建议使用更容易访问的起始材料合成标准。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-二甲氨基吡啶	Sigma-Aldrich	107700	试剂级，99%
抗氧化剂 BHT	Sigma-Aldrich	W21805
花生四烯酸	Sigma-Aldrich	10931
甘油-d8	Sigma-Aldrich	447498
质谱检测器 三重四极杆	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N，N'-二异丙基碳二亚胺	Sigma-Aldrich	D125407
核磁共振波谱仪	Bruker		Avance II 300 MHz
反相 HPLC 色谱柱	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD （50 x 2.1 mm）
叔丁基二甲基硅烷氯	Sigma-Aldrich	190500	试剂级，97%
THF UHPLC 系统中的四丁基氟化铵	Sigma-Aldrich	216143	1.0M
	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
蠕虫菌株 N2 布里斯托	尔隐杆病遗传学中心 （CGC）