本研究描述了一种在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中检测和定量内源性大麻素2-花生四烯酰甘油（2-AG）的稳健且简便的方法。通过制备分析用氘代标准品，并结合同位素稀释法及液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对2-AG进行定量分析。
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摘要
摘要
本研究介绍了一种制备分析标准品的方法，用于通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对2-花生四烯酰甘油（2-AG）进行定性和定量分析。内源性大麻素是一类在多种生物中保守存在的脂质信号分子，可调控多种生物学过程。在 C. elegans 中，2-AG 被发现具有多种功能，包括调控dauer形成和胆固醇代谢。本文报道了一种克服与2-AG定量所需的氘代标准品相关成本高和稳定性差问题的方法。该标准品的合成步骤简单，可在任何实验室中完成，无需有机合成专业知识或特殊设备。此外，本文还描述了对Folch法进行改进以从 C. elegans 培养物中提取氘代标准品的方法。最后，介绍了一种利用稳定同位素标记的类似物1-AG-d5检测2-AG的定量与分析方法，可在快速色谱运行中获得可靠结果。该方法不仅适用于研究2-AG在 C. elegans 中的多种生物学功能，也可推广应用于其他生物中代谢物的相关研究。
引言
内源性大麻素在多种生物体中调节多种生物学过程，是一类保守的脂质介质1。最早被发现且研究最为充分的内源性大麻素是花生四烯酸乙醇胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酸甘油酯（2-arachidonoyl glycerol，2-AG）。内源性大麻素具有多种关键功能，包括参与大脑奖赏系统、药物成瘾、记忆、情绪以及代谢过程2。AEA和2-AG仅在需要时合成，半衰期较短，通过转运蛋白重摄取和水解作用被降解3。
利用 Caenorhabditis elegans（C. elegans）等动物模型研究多种生物学过程（包括细胞凋亡、细胞信号转导、细胞周期、细胞极性、基因调控、代谢、衰老以及性别决定）已变得十分重要4,5。此外，C. elegans 是研究多不饱和脂肪酸（PUFAs）生理功能的优秀模型。AEA 已在 C. elegans 中被鉴定出，并在饮食限制条件下含量降低6。这种缺乏可通过补充内源性大麻素逆转，从而通过饮食限制机制延长线虫的寿命。最近研究发现，2-AG 和 AEA 在调控 C. e....
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方案
1. 1-AG-d5 的制备
注意：如需获得氘代内标物1-AG-d5用于定量分析，请遵循下述实验方案。
- 差异保护
- 若仅需保护伯醇，首先加入 38 mg 的甘油-d8 使用巴斯德移液管将样品转移至10 mL反应管中，并加入磁力搅拌子。
- 使用5 mL Hamilton注射器加入5 mL无水二氯甲烷（DCM），并用干燥N₂充满试管2 以提供惰性气氛。
- 使用一个浅的杜瓦瓶，装入蒸馏的乙酸乙酯，制备冷却浴。
- 将密封的反应管放入浴槽中，并通过缓慢加入液氮进行冷却2 直至溶剂冻结。
警告：该液体在室温下剧烈沸腾，接触眼睛和皮肤可导致严重灼伤。 - 使用 Hamilton 注射器加入 54 mg 无水 collidine。
警告：Collidine 具有挥发性，且气味强烈难闻。 - 加入70 mg叔丁基二甲基氯硅烷，在磁力搅拌器上于-78 °C搅拌整个溶液3小时。
- 反应3小时后，将反应体系置于室温继续搅拌12小时。
- 加入2 mL盐水以终止反应。
- 使用分液漏斗，每次用2 mL蒸馏过的二氯甲烷萃取溶液3次，每次均保留有机相。
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结果
利用市售的d8-甘油和花生四烯酸，通过三步合成法成功制备了同位素标记的类似物（图2，图3）。该方法操作简便，无需复杂仪器、特殊控制条件或昂贵试剂。因此，该方法具有良好的稳健性，可进一步推广用于合成含有不同脂肪酸的单酰基甘油。
采用核磁共振波谱对1-AG-d5进行了结构表征。1H NMR谱图显示在5.44 ppm至4.93 ppm处出现特征性多重峰，对应花生四烯酰基链上的八个烯烃质子，以及在2.40 ppm处的三重峰，对应羰基邻位α碳上的两个质子。在2D NMR谱图中，还可观察到2.9 ppm至2.7 ppm范围内的多重峰，可归属于甘油部分的五个氘原子。
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讨论
内源性大麻素是一类脂质，已被证实参与调控秀丽隐杆线虫（C. elegans）中滞育幼虫（dauer）的形成7。更具体而言，多不饱和脂肪酸（PUFAs）的合成对于胆固醇的转运以及线虫的生殖发育具有重要作用。本文揭示，含有花生四烯酸的内源性大麻素2-AG能够恢复因胆固醇代谢障碍而进入滞育状态的线虫幼虫，使其重新进入正常的发育周期7。
鉴于最近发现2-AG在促进胆固醇转运及其他生物过程中具有重要作用，而目前对脂质如何影响这一过程仍知之甚少，因此迫切需要一种可靠的内源性大麻素检测方法。成功开发这一简便且稳定的合成方法以获得氘代类似物1-AG-d5，是本实验方案中的关键步骤。
大多数已报道的单酰基甘油定量方法都需要使用市售的分析标准品，而这些标准品通常价格昂贵，且在常规储存条件下不稳定。这给需要大量标准品和新鲜储备的科研人员带来了不便，对于预算较低的实验室而言更是难以获取。然而，本方法通过使用更易获得的.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了阿根廷国家科学技术促进局（ANPCyT，项目编号PICT 2014-3693）研究基金的资助。J.F.d.L.、G.P. 和 B.H.C. 为阿根廷国家科学与技术研究理事会（CONICET）的在研学者。D.d.M. 和 G.R.L. 为 CONICET 研究职业体系成员。我们感谢 Gonzalo Lamberto（INMET）在 LC-MS/MS 分析及有益讨论方面的支持。视频拍摄与剪辑由阿根廷罗萨里奥国立大学政治与国际关系学院科学传播部的 Ramiro Ortega 和 María Soledad Casasola 完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-二甲氨基吡啶 | Sigma-Aldrich | 107700 | 试剂级，99% |
| 抗氧化剂 BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| 花生四烯酸 | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| 甘油-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| 三重四极杆质谱检测器 | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-二异丙基碳二亚胺 | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| 核磁共振波谱仪 | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| 反相高效液相色谱柱 | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| 叔丁基二甲基氯硅烷 | Sigma-Aldrich | 190500 | 试剂级，97% |
| 四丁基氟化铵 | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0 M THF 溶液 |
| 超高效液相色谱系统 | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| 线虫品系 N2 Bristol | 秀丽隐杆线虫遗传中心 (CGC) |
参考文献
- McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
- Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence.
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重印与许可
