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方法文章

合成氘代标准品用于定量2-花生四烯酰甘油 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/59882

⸱

2019年9月21日

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Química Rosario (IQUIR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 2Laboratorio de Fisiología Microbiana, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario

本文内容

摘要

本研究描述了一种在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中检测和定量内源性大麻素2-花生四烯酰甘油（2-AG）的稳健且简便的方法。通过制备分析用氘代标准品，并结合同位素稀释法及液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对2-AG进行定量分析。

摘要

本研究介绍了一种制备分析标准品的方法，用于通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对2-花生四烯酰甘油（2-AG）进行定性和定量分析。内源性大麻素是一类在多种生物中保守存在的脂质信号分子，可调控多种生物学过程。在 C. elegans 中，2-AG 被发现具有多种功能，包括调控dauer形成和胆固醇代谢。本文报道了一种克服与2-AG定量所需的氘代标准品相关成本高和稳定性差问题的方法。该标准品的合成步骤简单，可在任何实验室中完成，无需有机合成专业知识或特殊设备。此外，本文还描述了对Folch法进行改进以从 C. elegans 培养物中提取氘代标准品的方法。最后，介绍了一种利用稳定同位素标记的类似物1-AG-d5检测2-AG的定量与分析方法，可在快速色谱运行中获得可靠结果。该方法不仅适用于研究2-AG在 C. elegans 中的多种生物学功能，也可推广应用于其他生物中代谢物的相关研究。

引言

内源性大麻素在多种生物体中调节多种生物学过程，是一类保守的脂质介质1。最早被发现且研究最为充分的内源性大麻素是花生四烯酸乙醇胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酸甘油酯（2-arachidonoyl glycerol，2-AG）。内源性大麻素具有多种关键功能，包括参与大脑奖赏系统、药物成瘾、记忆、情绪以及代谢过程2。AEA和2-AG仅在需要时合成，半衰期较短，通过转运蛋白重摄取和水解作用被降解3。

利用 Caenorhabditis elegans（C. elegans）等动物模型研究多种生物学过程（包括细胞凋亡、细胞信号转导、细胞周期、细胞极性、基因调控、代谢、衰老以及性别决定）已变得十分重要4,5。此外，C. elegans 是研究多不饱和脂肪酸（PUFAs）生理功能的优秀模型。AEA 已在 C. elegans 中被鉴定出，并在饮食限制条件下含量降低6。这种缺乏可通过补充内源性大麻素逆转，从而通过饮食限制机制延长线虫的寿命。最近研究发现，2-AG 和 AEA 在调控 C. elegans 胆固醇转运过程中发挥着关键作用7。更重要的是，已确定外源性补充 2-AG 可以挽救 Niemann-Pick C1 型 C. elegans 突变体中因胆固醇转运障碍所导致的滞育状态。

为了更好地理解2-AG与线虫中胆固醇转运及其他生物学过程（如单胺能信号传导、伤害感受和运动行为）之间的关系，研究这种内源性代谢物及其在特定环境和饮食条件下的变化至关重要8,9,10,11,12,13。因此，亟需设计并优化一种方法，用于检测和定量秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的内源性2-AG，该方法应操作简便，适用于不同研究领域的科研人员，特别是那些研究该内源性大麻素与线虫行为关系的学者。

2008年，Lethonen 及其同事利用液相色谱-质谱（LC-MS）分析方法成功在 C. elegans 中鉴定出 2-AG 和 AEA14。2011年，他们进一步将该技术扩展至其他内源性大麻素的检测15。近期的研究表明，已有其他分析方法成功用于在 C. elegans 中检测和定量内源性大麻素，包括质谱法和气相色谱-质谱法（GC-MS）16,17,18，并且已有报道指出，类似的分析方法可进一步拓展至其他模式生物19。

既往报道的用于定量生物样品中2-AG的分析方法通常需要使用氘代内标，这些内标需从商业渠道购得，且其供应情况可能受限20,21。目前，多种用于LC-MS/MS定量内源性大麻素的分析标准品已可从不同供应商处购得。然而，这些标准品价格昂贵、化学性质敏感，并因含有多个双键而随时间推移易发生氧化。其中最常见的标准品基于八氘代花生四烯酸，适用于同位素稀释LC-MS/MS定量14,22。此外，大多数此类标准品在甘油骨架的2号位点发生酰基取代，导致其在多数条件下不稳定，易于发生酰基迁移19,23。

为克服这些氘代标准品在成本和稳定性方面的困难，本文介绍了一种便捷且简单的方法，用于制备基于甘油-d5的分析标准品。制备五氘代标准品的步骤需经过三步反应，最终得到标准品1-AG-d5，该标准品性质稳定，不会发生酰基迁移（这是合成2-单酰基甘油时面临的主要问题）。

主要目的是展示一种简单且可重复的方法来研究2-AG 秀丽隐杆线虫，包括分析用氘代标准品的合成、线虫样品的制备与提取，以及采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行分析图1）。该合成方法无需复杂的有机合成知识或特殊设备，适用于来自不同领域且正在研究的科研人员 秀丽隐杆线虫 在内源性大麻素影响下的行为。该方法还可扩展至其他研究模型，适用于不同研究目标。按照本文所述方法制备的标准品已成功用于开发一种快速、可靠的色谱分析方法，可有效且可重复地检测和定量2-AG。

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方案

1. 1-AG-d5 的制备

注意：如需获得氘代内标物1-AG-d5用于定量分析，请遵循下述实验方案。

  1. 差异保护
    1. 若仅需保护伯醇，首先加入 38 mg 的甘油-d8 使用巴斯德移液管将样品转移至10 mL反应管中，并加入磁力搅拌子。
    2. 使用5 mL Hamilton注射器加入5 mL无水二氯甲烷（DCM），并用干燥N₂充满试管2 以提供惰性气氛。
    3. 使用一个浅的杜瓦瓶，装入蒸馏的乙酸乙酯，制备冷却浴。
    4. 将密封的反应管放入浴槽中，并通过缓慢加入液氮进行冷却2 直至溶剂冻结。
      警告：该液体在室温下剧烈沸腾，接触眼睛和皮肤可导致严重灼伤。
    5. 使用 Hamilton 注射器加入 54 mg 无水 collidine。
      警告：Collidine 具有挥发性，且气味强烈难闻。
    6. 加入70 mg叔丁基二甲基氯硅烷，在磁力搅拌器上于-78 °C搅拌整个溶液3小时。
    7. 反应3小时后，将反应体系置于室温继续搅拌12小时。
    8. 加入2 mL盐水以终止反应。
    9. 使用分液漏斗，每次用2 mL蒸馏过的二氯甲烷萃取溶液3次，每次均保留有机相。
    10. 将三种有机提取液合并，并用硫酸钠干燥。
    11. 在真空旋转蒸发仪中减压小心蒸发二氯甲烷，避免溶剂飞溅。
    12. 使用硅胶作为固定相，通过柱色谱纯化粗混合物，洗脱剂采用从100%正己烷到100%乙酸乙酯的梯度体系，乙酸乙酯比例从10%逐步增加至100%。
    13. 合并含产物的馏分，在真空旋转蒸发仪中减压除去溶剂，得到纯的1-O,3-O-双-(TBDMS)甘油-d5 无色液体。
  2. 酯化反应
    1. 加入10 mg的1-O,3-O-双(TBDMS)-甘油-d5 使用巴斯德移液管将（先前合成的）物质转移至10 mL反应管中，并加入磁力搅拌子。
    2. 使用5 mL Hamilton注射器加入2 mL无水二氯甲烷，并用干燥N₂充满试管2 以提供惰性气氛。
    3. 使用冰浴将溶液冷却至 0 °C。
    4. 使用多通道可调移液器加入36 mg花生四烯酸并搅拌。
    5. 加入15 mg 4-二甲氨基吡啶，搅拌。
    6. 使用多通道可调移液器加入15 mg N,N'-二异丙基碳二亚胺，并搅拌。
    7. 在0 °C下反应3小时。
    8. 反应3小时后，将反应体系置于室温继续搅拌12小时。
    9. 加入2 mL水以终止反应。
    10. 使用分液漏斗，用2 mL蒸馏二氯甲烷（DCM）对有机溶液萃取3次。
    11. 将三种有机提取液合并至同一试管中，用硫酸钠干燥。
    12. 在真空旋转蒸发仪中减压蒸去二氯甲烷，注意避免溶剂飞溅。
    13. 使用硅胶作为固定相，通过柱色谱纯化粗混合物，洗脱剂为从100%正己烷开始、逐渐增加至50%正己烷/50%乙酸乙酯的10%梯度乙酸乙酯/正己烷溶剂体系。
    14. 合并含产物的组分，并在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂，得到纯净的1-O, 3-O-双(TBDMS)-2-AG-d5 呈淡黄色液体。
  3. 去保护
    1. 加入15 mg的1-O,3-O-双(TBDMS)-2-AG-d5 使用巴斯德移液管将（先前合成的）物质转移至10 mL反应管中，并加入磁力搅拌子。
    2. 使用5 mL Hamilton注射器加入2 mL无水THF，并用干燥N₂充满反应管2 以提供惰性气氛。
    3. 使用冰浴将溶液冷却至 0 °C。
    4. 使用 Hamilton 注射器，将 150 µL 1 M 四丁基氟化铵的 THF 溶液逐滴加入。
    5. 让反应液升温至室温并搅拌1小时。
    6. 反应1小时后，加入2 mL水以终止反应。
    7. 使用分液漏斗，用2 mL蒸馏二氯甲烷萃取溶液3次。
    8. 将三种有机提取液合并，并用硫酸钠干燥。
    9. 在真空旋转蒸发仪中减压蒸去二氯甲烷，得到纯净的1-AG-d5 呈淡黄色液体。
  4. 使用硅胶60 F薄层色谱监测所有反应254 预涂铝箔。用4-茴香醛乙醇溶液染色后，在254 nm紫外灯下观察条带。

2. 标准储备液和测量溶液的配制

  1. 取1 mg内标物1-AG-d5溶于1 mL乙腈（ACN）中，超声1分钟，制备得到1,000 ppm的标准储备溶液。
  2. 为制备用于线虫定量分析的1,000 ppb溶液，首先配制10 ppm溶液：使用Hamilton注射器吸取10 µL储备溶液，加入990 µL乙腈，定容至1 mL，混匀。
  3. 使用Hamilton注射器从步骤2.2所得溶液中吸取100 µL，加入900 µL乙腈，定容至1 mL，得到用于定量分析的1,000 ppb溶液。
  4. 每步操作之间均需超声1分钟，以确保完全溶解。将溶液储存于-78 °C，以维持标准品的浓度和完整性。使用标准溶液后，在关闭瓶盖前通入少量氮气，防止氧化。

3. C. elegans 的培养与维持

注意：用 E. coli OP50 并在这些平板上培养线虫。

  1. 将 3 g NaCl 与 17 g 琼脂混合。
  2. 加入 2.5 g 蛋白胨，然后加入 975 mL H2O。
  3. 高压灭菌 50 分钟，然后将烧瓶冷却至 55 °C。
  4. 混合以下成分：1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4、25 mL 1 M KH2PO4 缓冲液（均已预先高压灭菌），以及 1 mL 5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液。
  5. 在无菌环境下，将 NGM 溶液分装至 60 mm 培养皿中，填充至培养皿体积的三分之二。将培养皿置于 4 °C 保存。
  6. 从 -80 °C 甘油菌种中挑取 E. coli 菌液，在 LB 琼脂平板上划线，于 37 °C 培养过夜。
  7. 挑取单菌落接种于 100 mL 液体 LB 培养基中，37 °C 振荡培养过夜。
    注意：无需检测 O.D.，因为该菌株在此期间可达到稳定期。
  8. 取出储存的 NGM 平板，在超净工作台中打开皿盖，敞开放置以蒸发平板表面多余水分。
  9. 待平板干燥后，使用巴斯德移液管将 100 µL OP50 E. coli 菌液加至平板中央，不要扩散。
  10. 将 OP50 E. coli 菌苔在室温下培养过夜，或在 37 °C 培养 8 小时。
  11. 加入通过次氯酸盐处理或"漂白"（第 4 节）获得的所需数量的线虫胚胎。
    注意：在加入线虫前，需将平板冷却至室温。

4. 用于同步 C elegans 培养物的漂白技术

  1. 将线虫接种并分块转移到6 cm NGM平板上。
  2. 让线虫生长2-3天，以获得足够数量的卵和产卵成虫。
  3. 当卵和成虫数量足够后，向平板中加入5 mL M9缓冲液。
  4. 用玻璃移液管将线虫转移至15 mL离心管中。
  5. 在2,000 x g条件下离心2分钟，使线虫沉淀。
  6. 用吸管吸除大部分M9缓冲液，注意避免扰动线虫沉淀。
  7. 加入3 mL漂白液（NaOH:NaOCl:H2O按2:1:1比例配制）。
  8. 轻轻颠倒混匀，持续5分钟，或直至完整成虫数量明显减少。
    注意：漂白时间不得超过5分钟。
  9. 在2,000 x g条件下离心1分钟，吸除大部分漂白液，避免扰动线虫沉淀。
  10. 加入15 mL M9缓冲液，并充分混匀。
  11. 再次在2,000 x g条件下离心1分钟。
  12. 吸除大部分M9缓冲液，避免扰动线虫沉淀。
  13. 重复步骤4.10–4.12一至两次。
  14. 加入5 mL新鲜M9缓冲液，并轻轻振荡。
  15. 在轻微摇动条件下过夜培养，使卵孵化。

5. 线虫样品制备

  1. 将通过漂白程序获得的 N2 胚胎在 M9 缓冲液（15 mL 离心管中加入 5 mL）中于 20 °C 过夜孵化。
  2. 以 2,000 x g 离心 2 分钟，收集同步化的 L1 期幼虫。
  3. 用 M9 缓冲液洗涤线虫 1 次，然后定量活 L1 期线虫的数量。
  4. 将约 10,000 条线虫接种至含 1 mL 已干燥 OP50 E. coli 的 NGM 平板（直径 10 cm）中。
  5. 在 20 °C 下培养平板 48 小时，直至线虫发育至 L4 期。
  6. 用冷 M9 缓冲液在 15 mL 离心管中收集线虫，洗涤 1 次，然后转移至 1.5 mL 离心管中。
  7. 在 2,000 x g 条件下离心 1 分钟使线虫沉淀，吸除大部分上清液，将离心管浸入液氮中，随后于 -80 °C 保存。

6. 脂质提取

  1. 将约100 µL属于N2的冷冻线虫沉淀物在冰上解冻，加入1.3 mL甲醇，并对样品超声处理4分钟。
  2. 加入2.6 mL氯仿和1.3 mL 0.5 M KCl/0.08 M H3PO4，最终比例为1:2:1，加入1,000 ppb内标1-AG-d5，并以终浓度50 µg/mL加入丁基化羟基甲苯作为抗氧化剂。
  3. 涡旋混合样品1分钟，并在冰上于超声水浴中处理15分钟。
  4. 涡旋混合样品两次，每次1分钟，然后在2,000 x g离心10分钟，以诱导相分离。
  5. 收集下层相并转移至洁净离心管中，用氮气吹干，将残留固体重新溶解于100 µL乙腈中。

7. 采用高效液相色谱-串联质谱法分析内源性大麻素

  1. 采用液相色谱联用电喷雾三重四极杆质谱仪检测并定量线虫样品中的2-AG。
  2. 反相高效液相色谱使用以下梯度比例：0.0–0.5 min 为 H2O:ACN（40:60），0.5–6.5 min 从 H2O:ACN（40:60）线性梯度变化至（25:75），6.5–7.5 min 保持 H2O:ACN（25:75），7.5–8.0 min 从 H2O:ACN（25:75）恢复至（40:60）， 8.0–12.0 min 保持 H2O:ACN（40:60）。
  3. 维持色谱柱温度为 40 °C，并将自动进样器样品盘温度设置为 10 °C。
  4. 设定以下电离条件：正离子模式；干燥气体（N2）温度 = 300 °C；干燥气体流速 = 10 L/min；雾化气压力 = 10 UA；毛细管电压 = 4 kV。
  5. 分析物检测采用 MRM 模式，监测以下离子跃迁：2-AG 为 379.2 m/z → 289.2 m/z；内标 1-AG-d5 为 384.2 m/z → 289.2 m/z。

8. 线虫中内源性大麻素的定量分析

  1. 使用氘代内标 1-AG-d5，并计算待测物与内标的峰面积比。
  2. 使用以下离子跃迁：2-AG 为 384.2 m/z 转 287.2 m/z；1-AG-d5 为 379.2 m/z 转 287.2 m/z。
  3. 通过将待测物的峰面积比与氘代内标的峰面积比进行比较，并结合内标的浓度值，计算内源性 2-AG 的浓度。

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结果

利用市售的d8-甘油和花生四烯酸，通过三步合成法成功制备了同位素标记的类似物（图2，图3）。该方法操作简便，无需复杂仪器、特殊控制条件或昂贵试剂。因此，该方法具有良好的稳健性，可进一步推广用于合成含有不同脂肪酸的单酰基甘油。

采用核磁共振波谱对1-AG-d5进行了结构表征。1H NMR谱图显示在5.44 ppm至4.93 ppm处出现特征性多重峰，对应花生四烯酰基链上的八个烯烃质子，以及在2.40 ppm处的三重峰，对应羰基邻位α碳上的两个质子。在2D NMR谱图中，还可观察到2.9 ppm至2.7 ppm范围内的多重峰，可归属于甘油部分的五个氘原子。

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讨论

内源性大麻素是一类脂质，已被证实参与调控秀丽隐杆线虫（C. elegans）中滞育幼虫（dauer）的形成7。更具体而言，多不饱和脂肪酸（PUFAs）的合成对于胆固醇的转运以及线虫的生殖发育具有重要作用。本文揭示，含有花生四烯酸的内源性大麻素2-AG能够恢复因胆固醇代谢障碍而进入滞育状态的线虫幼虫，使其重新进入正常的发育周期7。

鉴于最近发现2-AG在促进胆固醇转运及其他生物过程中具有重要作用，而目前对脂质如何影响这一过程仍知之甚少，因此迫切需要一种可靠的内源性大麻素检测方法。成功开发这一简便且稳定的合成方法以获得氘代类似物1-AG-d5，是本实验方案中的关键步骤。

大多数已报道的单酰基甘油定量方法都需要使用市售的分析标准品，而这些标准品通常价格昂贵，且在常规储存条件下不稳定。这给需要大量标准品和新鲜储备的科研人员带来了不便，对于预算较低的实验室而言更是难以获取。然而，本方法通过使用更易获得的...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了阿根廷国家科学技术促进局（ANPCyT，项目编号PICT 2014-3693）研究基金的资助。J.F.d.L.、G.P. 和 B.H.C. 为阿根廷国家科学与技术研究理事会（CONICET）的在研学者。D.d.M. 和 G.R.L. 为 CONICET 研究职业体系成员。我们感谢 Gonzalo Lamberto（INMET）在 LC-MS/MS 分析及有益讨论方面的支持。视频拍摄与剪辑由阿根廷罗萨里奥国立大学政治与国际关系学院科学传播部的 Ramiro Ortega 和 María Soledad Casasola 完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-二甲氨基吡啶Sigma-Aldrich107700试剂级，99%
抗氧化剂 BHTSigma-AldrichW21805
花生四烯酸Sigma-Aldrich10931
甘油-d8Sigma-Aldrich447498
三重四极杆质谱检测器Thermo ScientificTSQ Quantum Access Max
N,N’-二异丙基碳二亚胺Sigma-AldrichD125407
核磁共振波谱仪BrukerAvance II 300 MHz
反相高效液相色谱柱Thermo Fisher25003-052130C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
叔丁基二甲基氯硅烷Sigma-Aldrich190500试剂级，97%
四丁基氟化铵Sigma-Aldrich2161431.0 M THF 溶液
超高效液相色谱系统Thermo ScientificUltimate 3000 RSLC Dionex
线虫品系 N2 Bristol秀丽隐杆线虫遗传中心 (CGC)

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