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使用突触前结构组织微珠与“神经元球”培养进行突触前结构形成检测

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DOI：

10.3791/59893

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2019年8月2日

 ,  , 
1Functional Structure Biology Laboratory, Department of Medical Life Science, Yokohama City University Graduate School of Medical Life Science

本文内容

摘要

突触前部的形成是一个动态过程，包括突触蛋白按正确顺序的聚集。在本方法中，通过将连接有突触前部组织蛋白的微珠作用于“神经元球”培养物的轴突网络，可诱导突触前部的形成，从而便于分析突触前部形成过程中突触蛋白的聚集情况。

摘要

在神经元发育过程中，突触形成是建立神经环路的重要步骤。为了形成突触，突触蛋白必须通过从细胞体运输和/或在未成熟突触中进行局部翻译，以适当的顺序被递送至突触部位。然而，目前尚不完全清楚突触蛋白是如何按正确顺序在突触中富集的。本文中，我们介绍一种新方法，通过结合神经元球培养与微珠诱导的方法来分析突触前结构的形成。神经元球即神经元细胞聚集体，可形成远离细胞体和树突的轴突层，从而避免细胞体强荧光信号的干扰，使微弱的突触前荧光信号得以检测。为诱导突触前结构形成，我们使用表面偶联了富含亮氨酸重复序列跨膜神经元蛋白2（LRRTM2）的微珠，LRRTM2是一种兴奋性突触前组织者蛋白。利用该方法，我们发现突触小泡蛋白——囊泡型谷氨酸转运蛋白1（vGlut1）在突触前结构中的富集速度比活性区蛋白Munc18-1更快。即使在去除细胞体后，Munc18-1仍能以翻译依赖的方式在突触前结构中富集。该结果表明，Munc18-1通过轴突内的局部翻译实现富集，而非来源于细胞体的运输。综上所述，该方法适用于分析突触蛋白在突触前结构中的富集过程及其来源。由于神经元球培养操作简便，且无需使用特殊设备，该方法可推广应用于其他实验平台。

引言

突触形成是神经回路发育过程中的关键步骤之一1,2,3。突触是由突触前和突触后成分构成的特化结构，其形成是一个复杂且多步骤的过程，涉及轴突与树突的精确识别、活性区和突触后致密区的建立，以及离子通道和神经递质受体的恰当排列1,2。在各个过程中，多种突触蛋白通过从细胞体运输和/或在局部进行翻译，适时地富集到这些特化结构中。这些突触蛋白被认为以有序的方式组装，从而形成具有功能的突触。参与突触形成的某些突触蛋白功能异常会导致神经系统疾病4,5。然而，突触蛋白如何在正确的时间点富集仍不明确。

为了研究突触蛋白如何以有序的方式累积，有必要按时间顺序检测突触蛋白的累积过程。已有部分研究报告采用活体成像技术，在解离培养的神经元中观察突触的形成过程6,7。然而，在显微镜下寻找刚刚开始形成突触的神经元耗时较长。为了高效地观察突触蛋白的累积，必须能够在研究人员希望诱导突触形成时即启动该过程。第二个挑战是区分突触蛋白的累积是来源于胞体运输，还是突触局部翻译的结果。为此，需要在阻止突触蛋白从胞体运输的条件下，检测翻译水平的变化。

我们开发了一种新型的突触前结构形成检测方法，该方法结合了神经元球状培养与微珠共培养，以诱导突触前结构的形成8。神经元球状培养技术被用于研究轴突表型，因其可形成环绕细胞体的轴突层结构9,10。我们使用了磁性微珠，其表面偶联了亮氨酸富集重复跨膜神经元蛋白2（leucine-rich repeat transmembrane neuronal 2, LRRTM2），该蛋白是一种突触前组织分子，可用于诱导兴奋性突触前结构的形成（图1A）11,12,13。利用LRRTM2微珠，突触前结构的形成始于微珠施加的时刻。这意味着在同一个神经元球内的数千条轴突中，突触前结构的形成是同步启动的，从而能够高效地精确分析突触蛋白积累的时间进程。此外，通过去除细胞体，可在神经元球培养中简便地阻断突触蛋白从胞体向轴突的运输（图1B）8。我们已证实，在去除细胞体后，无胞体的轴突至少可存活4小时，并保持健康状态。因此，本实验方案适用于研究突触蛋白的来源（胞体或轴突）以及突触蛋白如何以有序方式积累。

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方案

本手稿中描述的实验均按照横滨市大学机构动物护理和使用委员会指南进行。

1. 悬滴培养法神经元球的制备（第几天） 体外 （体外培养天数）0-3

注意：此处所述神经元球培养的制备步骤基于Sasaki团队先前报道的方法并进行了部分修改9,10。我们还采用了Banker方法中的若干步骤用于解离培养14。

  1. 开始解剖前确认以下事项
    1. 提前准备好所有所需溶液，并通过高压灭菌或过滤法进行灭菌。
    2. 准备好皮层神经元培养各步骤中将使用的所有器械和材料。
    3. 用70%乙醇喷洒并擦拭超净工作台、解剖台、体视显微镜载物台、剪刀和镊子。
  2. 通过CO2处死小鼠，并解剖腹部以获取E16胚胎。
  3. 借助精细镊尖小心地从胚胎中取出脑组织，并转移至含有4 mL HEPES缓冲盐溶液（HBSS）的60 mm细胞培养皿中。
    注：解剖用HBSS培养基含有10 mM HEPES（pH 7.4）、140 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.09 mM Na2HPO4、1.1 mM KH2PO4、5.6 mM D-葡萄糖和5.64 µM酚红。
  4. 去除颅顶皮肤，切除嗅球，在体视显微镜下用精细镊尖分离每个大脑半球的皮层，并转移至另一含有新鲜HBSS的60 mm培养皿中。每次独立的神经元球培养至少使用3–5个胚胎。
  5. 在超净台内的层流细胞培养罩中，用显微解剖弹簧剪将皮层组织剪成小块。
  6. 将剪碎的皮层组织转移至15 mL离心管中，加入4 mL含0.125%胰蛋白酶的HBSS溶液，在37 °C水浴中消化4.5分钟。
    注：该胰蛋白酶消化时间对获得高效神经元培养至关重要，延长消化时间（> 4.5分钟）会导致大量神经元死亡。
  7. 用无菌移液管将细胞团块转移至另一含有10 mL HBSS的15 mL离心管中，于37 °C孵育5分钟。重复此步骤一次。
  8. 将细胞团块转移至另一含有2 mL含GlutaMax、B27添加剂的Neurobasal培养基（NGB培养基）、0.01% DNase I和10%马血清的15 mL离心管中。
  9. 使用火焰抛光的细口玻璃巴斯德移液管反复吹打胰酶消化后的皮层组织（3–5次），进行吹打分散。
    注：火焰抛光细口玻璃巴斯德移液管的口径非常关键，具体可参见Banker方法相关文献14。若移液管口径过窄导致组织无法通过，应准备2–3种不同口径的移液管，并从口径较大的开始尝试。
  10. 为制备神经元球，取上述细胞悬液，用NGB培养基调整细胞密度至1 × 106 个细胞/mL。
  11. 将皮层神经元以悬滴方式培养，每滴含10,000个细胞（每滴体积为10 µL），置于10 cm培养皿上盖内侧。
  12. 在培养皿底部加入7 mL磷酸盐缓冲液（PBS），然后置于37 °C、5% CO2、湿度充足的培养箱中培养3天，以促进神经元球的形成。

2. 将神经元球置于PLL包被的玻璃盖玻片上及培养维持（DIV 3-11）

注意：在使用多聚赖氨酸（PLL）包被玻璃盖玻片之前，用去污剂清洗盖玻片非常重要。玻璃盖玻片有时并不够清洁，会影响神经元培养以及PLL的均匀包被。PLL包被不均匀可能导致神经球轴突延伸不均一。

  1. 将盖玻片浸泡在陶瓷架中，使用1/20稀释的中性无磷洗涤剂处理1至3个过夜时段。
  2. 用超纯水清洗盖玻片8次，然后在200 °C的烘箱中灭菌12小时。
    注意：自此步骤起的所有操作均须在层流洁净细胞培养罩内进行。
  3. 将烘烤后的盖玻片转移至100 mm培养皿中。在培养皿盖与底部之间用封口膜密封后，烘烤过的盖玻片可长期保存。
  4. （可选）在盖玻片上施加石蜡小点。这些小点可形成间隙，防止在免疫染色过程中神经元球体因直接接触塑料培养皿而从盖玻片上脱落。将石蜡置于合适的瓶中，在约90 °C的热水浴中加热融化。将巴斯德移液管浸入石蜡后迅速轻触盖玻片边缘，形成三个小点。
  5. 在60 mm培养皿中，使用PLL溶液（15 μg/mL溶于硼酸盐缓冲液）将PLL（分子量 > 300,000）包被于带有石蜡点的玻璃盖玻片上，并在CO2培养箱中孵育至少1小时。
  6. 用PBS洗涤4次后，将PLL包被的盖玻片转移至4孔板中，每孔加入350 µL NGB培养基，并向培养基中添加胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷盐酸盐（AraC，3 μM），以杀灭增殖细胞。
  7. 将含有PLL包被盖玻片的4孔板置于CO2培养箱中至少20分钟，确保培养基温度升至37 °C，然后再转移神经元球体。
  8. 在体外培养第3天（DIV 3），当“神经元球体”已充分形成时，将其转移至CO2培养箱内预置的4孔板中的PLL包被盖玻片上（每孔5个神经元球体）。
  9. 48小时后，更换神经元球体培养基为新鲜的不含AraC的NGB培养基。在进行此操作前，应立即在层流洁净细胞培养罩内准备好温度维持在37 °C的加热板。
    注意：为尽量减少培养物暴露于CO2培养箱外的时间，换液操作必须在加热板上迅速完成。
  10. 将神经元球体培养物继续在CO2培养箱中培养至最多体外培养第11天（DIV 11）。
    注意：在体外培养第11至12天（DIV 11-12），可选用神经突延伸达1-2 mm的神经元球体进行实验。

3. 在含有或不含细胞体的神经元球状培养物（DIV 11-12）上应用 LRRTM2 微珠

注意：在将LRRTM2微珠应用于神经元球状培养物之前，建议先去除细胞体。因此，应首先制备LRRTM2微珠，随后去除细胞体，并尽快将LRRTM2微珠加入培养体系中。生物素标记的LRRTM2由横滨市大学Nogi研究组以条件培养基形式提供。他们使用的表达载体包含生物素受体序列和生物素连接酶 E. coli (BirA)15,16 将生物素连接到LRRTM2，并将表达载体转染至Expi293表达系统中的Expi293F细胞。载体信息详见于 补充图1与用于原型LRRTM2系统的LRRTM2-Fc偶联的蛋白A磁珠相比，生物素标记的LRRTM2偶联链霉亲和素磁珠显著降低了免疫染色的背景信号8.

  1. 生物素标记的LRRTM2磁珠的制备
    1. 为了去除表达生物素标记LRRTM2的Expi293F细胞条件培养基中的过量生物素，将1.7 mL条件培养基与0.8 mL PBS混合（总体积2.5 mL）上样至PD-10凝胶过滤柱。PD-10柱预先用25 mL超纯水和25 mL PBS平衡。
    2. 用3.5 mL PBS洗脱，收集流出液作为LRRTM2储备液。
      注意：该LRRTM2储备液可分装后于-80 °C长期保存。生物素标记LRRTM2的表达水平有时在不同批次间存在差异。因此，当首次使用新批次的LRRTM2储备液时，应确定用于与磁珠偶联的LRRTM2储备液的合适体积，以确保在神经元球上形成足够的突触前结构。
    3. 取20 µL链霉亲和素包被的磁性微粒（直径：4-5 µm）悬浮液加入微量离心管中。将磁珠固定于附有钕铁硼永磁体的自制装置上，并在1.5 mL微量离心管中用100 µL PBS-MCBC洗涤三次。
      注意：PBS-MCBC含有PBS，其中包含5 mM MgCl2、3 mM CaCl2、0.1% BSA和0.1%不含EDTA的Complete蛋白酶抑制剂。
    4. 完全去除磁珠上的PBS-MCBC后，加入预定体积的LRRTM2储备液（通常为500–1,000 µL，参见注释3.1.2）至洗涤后的磁珠中。将混合物置于旋转仪上，在4 °C孵育1–2小时。
    5. 用100 µL PBS-MCBC洗涤磁珠两次，随后用100 µL NGB培养基洗涤一次。
    6. 将LRRTM2磁珠重悬于50 µL NGB培养基中，用于神经元球培养。
    7. 在另一微量离心管中，采用相同步骤制备对照磁珠（阴性对照），但不添加生物素标记的LRRTM2蛋白。
  2. 在DIV 11–12时去除神经元球的胞体并施加LRRTM2磁珠
    1. 将4孔板的各孔标记为“胞体（+）”和“胞体（-）”。
    2. 在体视显微镜下，用已喷洒70%乙醇的刀片将黄色移液枪头末端以45°角斜切（图1B）。
    3. 将黄色枪头末端置于神经元球的胞体区域，通过抽吸去除胞体（图1B）。
    4. 为区分实验中的各个特定条件，再次将各孔标记为“LRRTM2磁珠”和“对照磁珠”。
    5. 将LRRTM2磁珠和对照磁珠施加至神经元球培养体系，并使用铁氧体磁铁将磁珠沉降至孔板底部1分钟，以启动突触前结构的形成。该步骤可确保所有磁珠同时接触细胞表面。尤其在与LRRTM2磁珠进行短时间孵育（例如30分钟和1小时）时，此方法可实现同步化处理。
    6. 进行时间进程实验时，将各个独立孔分别标记为0分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和18小时，并在指定时间点施加LRRTM2磁珠。
    7. 加入LRRTM2磁珠后，将神经元球与磁珠共孵育指定时间（0分钟至18小时），以诱导突触前结构的形成。

4. 免疫染色与显微镜观察

注意：在有无胞体的实验条件下，均需使用 LRRTM2 微珠孵育细胞 4 小时后进行固定，因为在缺乏胞体的情况下，轴突在 4 小时后会逐渐死亡。若进行 LRRTM2 微珠的时间进程实验，则在指定时间点固定细胞。

  1. 在LRRTM2微珠诱导突触前结构形成后，对神经元球培养物中的神经元进行固定与染色
    1. 移除NGB培养基，加入4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液（250 µL/孔），室温固定20分钟，随后用500 µL PBS洗涤4次，每次5分钟。
    2. 用TBS（Tris缓冲盐水：50 mM Tris-HCl（pH 7.3）和150 mM NaCl）洗涤固定后的细胞，时间不少于5分钟。
    3. 使用含0.3% Triton X-100的TBS对神经元球培养物中的细胞/轴突进行透化处理，持续5分钟。
    4. 用封闭缓冲液（含0.1% Triton X-100和5%正常山羊血清（NGS）的TBS）在室温下封闭细胞1小时。
    5. 加入一抗进行孵育：抗兔vGlut1（囊泡型谷氨酸转运体1，1:4000）和抗鼠Munc18-1（1:300），用抗体稀释液稀释后，4 °C孵育过夜。
    6. 用免疫荧光（IF）缓冲液（含0.1% Triton X-100和2% BSA的TBS）洗涤盖玻片4次，每次5分钟，随后加入荧光标记的二抗（Alexa染料偶联抗体）孵育30分钟：抗鼠IgG-Alexa 555（1:500）、抗兔IgG-Alexa 488（1:1000）。
    7. 用含1 µg/mL DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）的PBS对神经元胞体的细胞核染色5分钟。
    8. 用PBS洗涤盖玻片3次，然后使用含167 mg/mL聚乙烯醇和6 mg/mL N-丙基没食子酸盐的封片剂将盖玻片封固于载玻片上。
    9. 将载玻片置于-20 °C冰箱中保存直至显微镜观察。若保存于-20 °C，载玻片上的荧光信号至少可稳定检测1年。
  2. 在荧光显微镜下成像
    1. 使用倒置荧光显微镜配备60倍油镜和冷却CCD相机，采集微分干涉差（DIC）图像和免疫荧光（IF）图像。图像采集使用显微镜系统自带的软件，图像分析使用Image J软件。
    2. 使用以下公式测量轴突中突触前结构的IF荧光强度：微珠区域（ROI）的IF强度减去非微珠区域强度，除以微珠周围20 µm轴突区域的强度减去背景强度。该比值即为蛋白富集指数（图4A）。所有测量均应在原始16位图像上使用Image J软件完成。
    3. 为定量分析LRRTM2微珠诱导的突触前特定蛋白富集水平，应始终在显微镜下（60倍镜）选择距离细胞体至少两个视野以上的位置进行成像。
      注：神经元球成像区域的选择至关重要，因为靠近细胞体的区域轴突密集，而神经元球外围区域更易获得单根轴突。
    4. 为确保测量准确性，每张盖玻片应选择5个不同轴突区域（与细胞体距离相似）进行分析。
    5. 不同实验日及不同实验之间应保持一致的成像条件。

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结果

在此，我们展示了在神经球培养的轴突片层中，由LRRTM2诱导的突触前结构内突触前蛋白聚集的代表性结果。作为突触前蛋白，我们分析了兴奋性突触小泡蛋白vGlut1和活性区蛋白Munc18-1。我们还研究了vGlut1和Munc18-1在突触前结构中聚集的时间过程，并利用去除胞体的轴突及蛋白质合成抑制剂，获得了关于突触前结构中Munc18-1来源的结果。最近，我们研究了脆性X智力低下蛋白（FMRP）在突触前结构中Munc18-1聚集过程中的作用8。FMRP是脆性X综合征（FXS）的致病基因产物，是一种可结合mRNA并抑制翻译的蛋白17,18,19。我们还利用缺乏编码FMRP的Fmr1基因的FXS模型小鼠，检测了FMRP在Munc18-1聚集中的参与情况。

在DIV11时将LRRTM2-beads加入神经元球培养物中，可诱导神经元球轴突突触...

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讨论

我们开发了一种新方法，利用神经元球培养体系，通过LRRTM2包被的微珠刺激来检测突触前结构的形成。目前，大多数突触前结构形成检测方法采用聚-D-赖氨酸（PDL）包被的微珠，并结合解离培养或微流控装置20,21,22。本方法的优势之一在于使用LRRTM2微珠。LRRTM2可特异性地与神经轴素（neurexin）相互作用，从而特异性诱导兴奋性突触前结构的形成11,12,13，而PDL微珠则非特异性地同时诱导兴奋性和抑制性突触前结构20。在本方法中，通过根据实验目的更换生物素化蛋白的胞外结构域，还可应用其他突触前结构组织者——这类蛋白成员超过10种3——来诱导突触前结构的形成。<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由日本学术振兴会科学研究费补助金（KAKENHI）(C)（编号 22500336、25430068、16K07061）（Y. Sasaki）资助。我们感谢横滨市立大学的Terukazu Nogi博士和Makiko Neyazaki女士慷慨提供生物素标记的LRRTM2蛋白。同时感谢Honami Uechi和Rie Ishii提供的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体稀释液DAKOS2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-545-152
小鼠抗 Munc18-1BD Biosciences610336
B-27 补充剂 (50X)，无血清Thermo Fisher Scientific17504044
牛血清白蛋白 (BSA)Nacalai Tesque01863-48
细胞培养处理多孔板（4 孔板）Nunc176740
完全无 EDTARoche11873580001
冷却 CCD 相机Andor TechnologyiXON3
盖玻片MatsunamiC015001尺寸：15 mm，厚度：0.13–0.17 mm
胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷 (AraC)Sigma-AldrichC1768
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI)Nacalai Tesque11034-56
脱氧核糖核酸酶 1 (DNase I)Wako 纯化学047-26771
Expi293 表达系统Thermo Fisher ScientificA14635
马血清Sigma-AldrichH1270
图像采集软件NikonNIS-element AR
图像分析软件NIHImage Jhttps://imagej.nih.gov/ij/
倒置荧光显微镜NikonEclipse Ti-E
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Neurobasal 培养基Thermo Fisher Scientific#21103-049
正常山羊血清 (NGS)Thermo Fisher Scientific#143-06561
N-丙基没食子酸酯Nacalai Tesque29303-92
多聚甲醛 (PFA)Nacalai Tesque26126-25

Paraplast Plus		Sigma-AldrichP3558
聚-L-赖氨酸氢溴化物 (分子量 > 300,000)Nacalai Tesque28359-54
聚乙烯醇SigmaP8136
预装一次性 PD-10 柱GE healthcare17085101
兔抗囊泡型谷氨酸转运体 1Synaptic Systems135-302
SCAT 20X-N (中性无磷去污剂)Nacalai Tesque41506-04
链霉亲和素包被的磁性微粒Spherotech IncSVM-40-10直径：4–5 µm
TritonX-100Nacalai Tesque35501-15
胰蛋白酶Nacalai Tesque18172-94

参考文献

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LRRTM2 vGlut1 Munc18 1

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