使用锚定多重聚合酶链式反应联合下一代测序检测致癌基因融合

摘要

本文详细介绍了使用基于锚定多重聚合酶链式反应的文库制备试剂盒，随后进行高通量测序，以检测临床实体瘤样本中的致癌基因融合。文中描述了湿实验操作和数据分析的各个步骤。

摘要

基因融合经常导致多种不同类型癌症的致癌表型。此外，癌症患者样本中某些特定融合基因的存在通常直接影响诊断、预后和/或治疗方案的选择。因此，准确检测基因融合已成为多种疾病临床管理中的关键环节。直到最近，临床基因融合检测主要依赖于单基因检测方法。然而，具有临床意义的基因融合列表不断增长，使得同时评估多个基因融合状态的需求日益迫切。基于下一代测序（NGS）的检测技术通过大规模并行测序核酸的能力满足了这一需求。目前已有多种基于NGS、采用不同基因靶向富集策略的方法可用于临床分子诊断，每种方法各有其优势与局限性。本文描述了采用基于锚定多重PCR（AMP）的靶向富集与文库构建，随后进行NGS检测，以分析临床实体瘤标本中的基因融合情况。在基于扩增子的富集方法中，AMP的独特之处在于其能够在不依赖融合伴侣基因身份的情况下识别基因融合。本文详细介绍了确保从临床样本中准确检测基因融合所需的实验操作步骤和数据分析流程。

引言

两个或更多基因融合成一个单一的转录单元，可能由大规模染色体变异引起，包括缺失、重复、插入、倒位和易位。通过改变转录调控和/或表达基因产物的功能特性，这些融合基因可赋予癌细胞致癌特性¹。在许多情况下，已知融合基因作为主要的致癌驱动因子，通过直接激活细胞增殖和存活通路发挥作用。

基因融合对癌症患者的临床意义最初在慢性髓性白血病（CML）中发现费城染色体及其相应的BCR-ABL1融合基因时得以显现²。小分子抑制剂甲磺酸伊马替尼被开发用于特异性靶向该融合基因，在BCR-ABL1阳性的CML患者中展现出显著疗效³。在实体瘤中，针对致癌性基因融合的治疗也取得了成功，非小细胞肺癌中ALK和ROS1融合基因的抑制即为主要范例^4,5。近期，NTRK抑制剂拉罗替尼获得美国FDA批准，用于治疗携带NTRK1/2/3融合的实体瘤，且不受肿瘤原发部位限制⁶。除指导治疗选择外，基因融合检测在疾病诊断和预后评估中亦具有重要作用。这一点在多种肉瘤及血液系统恶性肿瘤亚型中尤为突出，这些肿瘤的诊断依赖于特定融合基因的存....

方案

1. 文库制备与测序

1. 通用检测注意事项及检测前步骤
   1. 检测运行通常包括七个临床样本和一个阳性对照（尽管每个文库制备运行的样本数量可根据需要调整）。阳性对照应至少包含几个该检测所靶向的基因融合，且这些融合需经制造商确认和/或通过正交方法验证。每次检测运行中必须将一个无模板对照（NTC）作为额外样本加入，但该对照仅需进行到第二链cDNA合成及测序前质量控制（Pre-Seq QC；以确保无cDNA合成）。NTC使用样本稀释液（10 mM Tris HCl pH 8.0）。
   2. 对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行总核酸（TNA）提取。
   3. 使用荧光定量法对TNA中的RNA组分进行定量。
      注意：为防止样本中RNA降解，应尽量减少冻融循环，将解冻后的核酸保持在低温环境（预冷金属块、冰上或其它低温条件），并防止RNase污染（佩戴手套，使用RNase去污染喷雾）。
2. 随机引物延伸
   注意：本检测的理想输入量为200 ng RNA（基于TNA的荧光定量结果）。若无法达到200 ng，可使用较低输入量。若样本在测序后质量控制中失败，可尝试使用更高输入量重复实验，以获得可接受的质量控制指标。
   1. 用10 mM Tris HCl pH 8.0将TNA稀释至所需RNA浓度。对每个样本，将20 µL稀释液转移....

结果

如图所示 图3, 图4 和 图5 来自分析用户界面的截图，展示了肺腺癌样本的分析结果。在 图3样本摘要显示在上方，列出了检测到的强证据融合基因以及质控状态（红色圆圈标出）。 ADCK4-NUMBL 融合（列出的3种异构体）因属于持续性转录通读事件而被立即忽略（列表旁的断开圆圈图标表示）。底部 图3 是“读段统计”页面的截图。图中用绿色圆圈标出的是特别有信息量的指标。决定样本通过/失败的关键质控指标用红色突出显示（此指标决定了上方摘要中的通过/失败状态）。如果该值低于20，则阴性融合结果被视为“无信息性”。 图4 和 图5 是两种需要进一步研究的融合基因的融合示意图（上图）和支持该融合的测序读段在JBrows.......

讨论

基于锚定多重PCR的靶向富集与文库构建，结合下一代测序技术，非常适用于临床肿瘤样本中多重基因融合的检测。该方法以RNA为起始输入材料，而非基因组DNA，从而避免了对庞大且重复的内含子区域进行测序的需要。此外，由于该策略在扩增时不受融合伴侣基因身份的限制，因此能够检测出 novel 基因融合事件。这一特性在临床应用中具有重要意义，已有大量文献报道通过AMP方法鉴定出具有临床干预价值的 novel 基因融合事件^{21,22,23,24,25}。

由于该检测基于RNA，因此在处理过程中保持样本中RNA的质量至关重要。同时，确定哪些样本产生的RNA测序结果过于低下而无法信任阴性融合结果也极为重要。这一判断通过评估针对四个看家基因的引物测序数据来实现。如果这些基因的测序结果.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mM Tris HCl pH 8.0	IDT	11-05-01-13	用于TNA稀释
1M Tris pH 7.0	Thermo Fisher	AM9850G	用于文库合并
25 mL 带分隔的试剂储液槽	USA Scientific	9173-2000	适用于多通道移液器和大体积试剂操作
96孔半裙边0.1 mL透明PCR板	USA Scientific	1402-9700	用于热循环仪步骤
Agencourt AMPure XP磁珠	Beckman Coulter	A63881	用于多个检测步骤后的纯化
Agencourt Formapure试剂盒	Beckman Coulter	A33343	用于TNA提取
Archer FusionPlex实体瘤检测试剂盒	ArcherDX	AB0005	该试剂盒包含进行Illumina测序文库制备所需的大部分试剂（也可提供用于Ion Torrent测序的试剂盒）
96孔冰块	Light Labs	A7079	用于在多个步骤中保持样本低温
乙醇	Decon Labs	DSP-MD.43	用于磁珠洗涤
Illumina文库定量内参标准品	Kapa Biosystems	KK4906	用于文库定量
文库定量引物及ROX低浓度qPCR预混液	Kapa Biosystems	KK4973	用于文库定量
文库定量标准品	Kapa Biosystems	KK4903	用于文库定量
96孔磁力板（N38级）	Alpaqua	A32782	用于磁珠纯化步骤
MBC接头Set B	ArcherDX	AK0016-48	含有样本特异性索引的接头，用于实现多重测序
微量离心机	USA Scientific	2641-0016	用于离心PCR管
MicroAmp EnduraPlate光学96孔板	Thermo-Fisher	4483485	用于测序前质控文库定量
Microamp光学膜压缩垫	Applied Biosystems	4312639	用于文库定量
微型板旋转器	Labnet	MPS-1000	用于将液体收集至孔板底部
MiSeq试剂盒v3（600个循环）	Illumina	MS-102-3003	包含MiSeq测序运行所需的各种组分
MiSeqDx系统	Illumina		高通量测序仪器
Model 9700热循环仪	Applied Biosystems		在检测过程中用于多个步骤
无核酸酶水	Ambion	9938	用作通用稀释液
光学ABI 96孔PCR板盖	Thermo-Fisher	4311971	用于测序前质控文库定量
PCR工作站Model 600	Air Clean Systems	BZ10119636	湿实验检测步骤在此“无菌操作台”中进行
蛋白酶K	Qiagen	1019499	用于TNA提取
QuantStudio 5	Applied Biosystems	LSA28139	用于测序前质控和文库定量的qPCR仪器
Qubit RNA高灵敏度检测试剂盒	Life Technologies	Q32855	用于测定TNA样本中的RNA浓度
RNase Away	Fisher	12-402-178	用于工作区域的常规RNase去污染
Seraseq FFPE肿瘤融合RNA参考物质v2	SeraCare	0710-0129	用作检测的阳性对照
氢氧化钠	Fisher	BP359-212	用于清洁步骤和测序准备
SYBR Green Supermix	Bio Rad	172-5120	测序前质控检测的组分
TempAssure PCR 8联管条	USA Scientific	1402-2700	用于试剂和样本混合等操作
模板RT PCR封膜	USA Scientific	2921-7800	用于覆盖96孔板
U型底96孔微孔板	LSP	MP8117-R	用于磁珠纯化过程