使用锚定多重聚合酶链式反应联合下一代测序检测致癌基因融合

摘要

本文详细介绍了使用基于锚定多重聚合酶链式反应的文库制备试剂盒，随后进行高通量测序，以检测临床实体瘤样本中的致癌基因融合。文中描述了湿实验操作和数据分析的各个步骤。

摘要

基因融合经常导致多种不同类型癌症的致癌表型。此外，癌症患者样本中某些特定融合基因的存在通常直接影响诊断、预后和/或治疗方案的选择。因此，准确检测基因融合已成为多种疾病临床管理中的关键环节。直到最近，临床基因融合检测主要依赖于单基因检测方法。然而，具有临床意义的基因融合列表不断增长，使得同时评估多个基因融合状态的需求日益迫切。基于下一代测序（NGS）的检测技术通过大规模并行测序核酸的能力满足了这一需求。目前已有多种基于NGS、采用不同基因靶向富集策略的方法可用于临床分子诊断，每种方法各有其优势与局限性。本文描述了采用基于锚定多重PCR（AMP）的靶向富集与文库构建，随后进行NGS检测，以分析临床实体瘤标本中的基因融合情况。在基于扩增子的富集方法中，AMP的独特之处在于其能够在不依赖融合伴侣基因身份的情况下识别基因融合。本文详细介绍了确保从临床样本中准确检测基因融合所需的实验操作步骤和数据分析流程。

引言

两个或更多基因融合成一个单一的转录单元，可能由大规模染色体变异引起，包括缺失、重复、插入、倒位和易位。通过改变转录调控和/或表达基因产物的功能特性，这些融合基因可赋予癌细胞致癌特性¹。在许多情况下，已知融合基因作为主要的致癌驱动因子，通过直接激活细胞增殖和存活通路发挥作用。

基因融合对癌症患者的临床意义最初在慢性髓性白血病（CML）中发现费城染色体及其相应的BCR-ABL1融合基因时得以显现²。小分子抑制剂甲磺酸伊马替尼被开发用于特异性靶向该融合基因，在BCR-ABL1阳性的CML患者中展现出显著疗效³。在实体瘤中，针对致癌性基因融合的治疗也取得了成功，非小细胞肺癌中ALK和ROS1融合基因的抑制即为主要范例^4,5。近期，NTRK抑制剂拉罗替尼获得美国FDA批准，用于治疗携带NTRK1/2/3融合的实体瘤，且不受肿瘤原发部位限制⁶。除指导治疗选择外，基因融合检测在疾病诊断和预后评估中亦具有重要作用。这一点在多种肉瘤及血液系统恶性肿瘤亚型中尤为突出，这些肿瘤的诊断依赖于特定融合基因的存在，或其预后直接由融合基因的存在与否决定^7,8,9,10,11。以上仅是基因融合检测在癌症患者临床应用中的部分实例。

由于基因融合检测在临床决策中具有关键作用，因此从临床样本中准确检测基因融合至关重要。目前临床实验室已应用多种技术进行基因融合或染色体结构重排分析，包括：细胞遗传学技术、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光原位杂交（FISH）、免疫组织化学（IHC）以及5’/3’表达失衡分析等^12,13,14,15。目前，癌症中可靶向治疗的基因融合数量迅速增加，导致需要同时检测多个基因的融合状态。因此，一些每次只能检测一个或少数几个基因的传统技术正变得效率低下，尤其考虑到临床肿瘤样本通常非常有限，难以分配至多个检测中使用。而下一代测序技术（NGS）是一种非常适合多基因检测的分析平台，基于NGS的检测方法已在临床分子诊断实验室中广泛应用。

目前用于检测融合/重排的二代测序（NGS）检测方法在所用输入材料、文库构建与靶向富集所采用的化学方法，以及单次检测中涵盖的基因数量方面均存在差异。NGS检测可基于从样本中提取的RNA或DNA（或两者）进行。尽管基于RNA的分析常受限于临床样本中RNA高度降解的倾向，但它避免了对DNA为基础的融合检测中常需测序的大而重复的内含子区域，而这些区域已被证明在NGS数据分析中存在困难¹⁶。基于RNA的NGS检测的靶向富集策略主要可分为杂交捕获或扩增子介导的方法。尽管两种策略均已成功用于融合检测，但各自具有相对优势^17,18。杂交捕获法通常产生更复杂的文库并减少等位基因丢失，而基于扩增子的方法通常所需输入量更低，且脱靶测序更少¹⁹。然而，传统扩增子法富集的主要局限之一在于需要为所有已知的融合伙伴设计引物。这一问题尤为突出，因为许多具有重要临床意义的基因已知可与数十种不同的伙伴基因发生融合；即使引物设计能够覆盖所有已知的融合伙伴，新发的融合事件仍无法被检测到。一种最近提出的技术——锚定多重PCR（简称AMP），可克服这一局限²⁰。在AMP中，一种“半功能性”NGS接头被连接到由输入RNA衍生的cDNA片段上。靶向富集通过基因特异性引物与接头引物之间的扩增实现。因此，无论是否涉及新发的融合伙伴，所有目标基因的融合事件均应可被检测（见图1）。本文描述了ArcherDx FusionPlex实体瘤试剂盒的应用，该试剂盒是一种基于NGS的检测方法，采用AMP技术进行靶向富集与文库构建，用于检测实体瘤样本中的致癌基因融合（完整基因列表见补充表1）。该湿实验操作流程及数据分析步骤已在经《临床实验室改进修正案》（CLIA）认证的实验室中经过严格验证。

方案

1. 文库制备与测序

1. 通用检测注意事项及检测前步骤
   1. 检测运行通常包括七个临床样本和一个阳性对照（尽管每个文库制备运行的样本数量可根据需要调整）。阳性对照应至少包含几个该检测所靶向的基因融合，且这些融合需经制造商确认和/或通过正交方法验证。每次检测运行中必须将一个无模板对照（NTC）作为额外样本加入，但该对照仅需进行到第二链cDNA合成及测序前质量控制（Pre-Seq QC；以确保无cDNA合成）。NTC使用样本稀释液（10 mM Tris HCl pH 8.0）。
   2. 对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织进行总核酸（TNA）提取。
   3. 使用荧光定量法对TNA中的RNA组分进行定量。
      注意：为防止样本中RNA降解，应尽量减少冻融循环，将解冻后的核酸保持在低温环境（预冷金属块、冰上或其它低温条件），并防止RNase污染（佩戴手套，使用RNase去污染喷雾）。
2. 随机引物延伸
   注意：本检测的理想输入量为200 ng RNA（基于TNA的荧光定量结果）。若无法达到200 ng，可使用较低输入量。若样本在测序后质量控制中失败，可尝试使用更高输入量重复实验，以获得可接受的质量控制指标。
   1. 用10 mM Tris HCl pH 8.0将TNA稀释至所需RNA浓度。对每个样本，将20 µL稀释液转移至预冷铝块中的随机引物试剂条管中，通过上下吹打6–8次混匀。短暂离心后，将全部体积转移至96孔PCR板，并用RT封膜密封。
   2. 将PCR板插入热循环仪模块中，覆盖压缩垫并关闭盖子。在65 °C孵育5分钟（加热盖）。
   3. 从热循环仪中取出PCR板，置于冰上2分钟。
3. 第一链cDNA合成
   1. 将随机引物延伸产物的全部体积转移至预冷铝块中的第一链试剂条管中。通过上下吹打6–8次混匀。短暂离心后，将全部体积转移至96孔PCR板，并用RT封膜密封。
   2. 将PCR板插入热循环仪模块中，覆盖压缩垫并关闭盖子。运行热循环程序：25 °C 10分钟，42 °C 30分钟，80 °C 20分钟，4 °C保温（加热盖）。
4. 第二链cDNA合成
   1. 在一组新的PCR条管中，通过将1 µL第一链产物加入9 µL无核酸酶水，制备第一链产物的1:10稀释液。将该稀释液暂存，用于后续Pre-Seq QC检测。
   2. 向剩余的第一链产物中加入21 µL无核酸酶水。将40 µL第一链产物与无核酸酶水的混合液转移至预冷铝块中的第二链试剂条管中。通过上下吹打6–8次混匀。离心后，将全部体积转移至96孔PCR板，并用RT封膜密封。
   3. 将PCR板插入热循环仪模块中，覆盖压缩垫并关闭盖子。运行热循环程序：16 °C 60分钟，75 °C 20分钟，4 °C保温（加热盖）。
      注意：此为可接受的暂停点。PCR板可在-20 °C保存。
5. 测序前质量控制（Pre-Seq QC）
   注意：该质量控制（QC）检测主要用于验证NTC中无cDNA合成。然而，其数据也可能对检测问题排查具有参考价值。例如，若某样本Pre-Seq QC值良好但整体检测指标较差（见下文），则可能提示检测运行过程中存在问题，需重复实验。
   1. 每个样本和NTC均需设置双重复。同时在Pre-Seq QC运行中加入反应NTC（即无核酸酶水，也设双重复）。向光学96孔板的每个相应孔中加入5 µL检测主混合液、1 µL 10x VCP引物和4 µL在步骤1.4.1中制备的1:10稀释第一链产物。
   2. 用RT封膜密封PCR板，短暂离心后装入定量PCR（qPCR）仪。运行程序：预扩增：1个循环，95 °C 20秒；扩增：35个循环，95 °C 3秒（升温速率4.4 °C/s）− 60 °C 30秒（升温速率2.2 °C/s）。
   3. 确认检测NTC和反应NTC均无循环阈值（Ct）值。
      注意：若检测NTC未观察到Ct值，则不再继续后续检测流程。若反应NTC出现Ct值，则需重复Pre-Seq QC检测。若检测NTC出现Ct值，提示在检测早期某阶段存在样本污染，需重新开始整个检测（所有样本）。合格样本的Pre-Seq QC Ct值应低于30（Ct值越低，表示产物越多，RNA质量越高）。Ct值高于30并非绝对的失败指标，此类样本仍可继续检测。但所有由此类样本获得的数据均应仔细审查，尤其在未检出任何融合的情况下。
6. 末端修复与磁珠纯化
   1. 将40 µL第二链产物转移至预冷铝块中的末端修复试剂条管中。通过上下吹打6–8次混匀，短暂离心后放入热循环仪模块（保持加热盖开启），运行程序：25 °C 30分钟，4 °C保温。
   2. 从4 °C取出纯化磁珠，使其平衡至室温。准备足量70%乙醇以供整个文库制备过程使用。使用前充分涡旋混匀磁珠，并将100 µL磁珠加入U型底板相应数量的孔中。
      注意：每运行8个样本，需20 mL 70%乙醇。
   3. 将末端修复产物的全部体积加入磁珠中。上下吹打6–8次混匀，在室温孵育5分钟，随后在磁力架上孵育5分钟。
   4. 移除并弃去上清液，用200 µL 70%乙醇洗涤两次，每次孵育30秒。最后一次洗涤后，彻底去除70%乙醇，室温晾干5分钟。
   5. 从磁力架上取下，用22 µL 10 mM Tris HCl pH 8.0重悬磁珠。脱离磁力架孵育3分钟，随后在磁力架上孵育2分钟。立即进入连接步骤1。
7. 连接步骤1与磁珠纯化
   1. 从末端修复磁珠纯化板中转移20 µL（注意不要扰动磁珠沉淀）至预冷铝块中的连接步骤1试剂条管中。通过上下吹打6–8次混匀，短暂离心后将全部体积转移至96孔PCR板。
   2. 将PCR板插入热循环仪模块中，覆盖压缩垫并关闭盖子。运行热循环程序：37 °C 15分钟，4 °C保温（加热盖）。
   3. 从4 °C取出纯化磁珠，使其平衡至室温。使用前充分涡旋混匀磁珠，并将50 µL磁珠加入U型底板相应数量的孔中。
   4. 将连接步骤1产物的全部体积加入磁珠中。上下吹打6–8次混匀，在室温孵育5分钟，随后在磁力架上孵育5分钟。
   5. 移除并弃去上清液，用200 µL 70%乙醇洗涤两次，每次孵育30秒。最后一次洗涤后，彻底去除70%乙醇，室温晾干5分钟。
   6. 从磁力架上取下，用42 µL 10 mM Tris HCl pH 8.0重悬磁珠。脱离磁力架孵育3分钟，随后在磁力架上孵育2分钟。立即进入连接步骤2。
8. 连接步骤2与磁珠纯化
   1. 从4 °C取出分子条形码（MBC）接头试剂条管。此时加入样本特异性索引，因此MBC接头条管的正确编号至关重要。将条管水平放置，铰链朝后，用永久性记号笔从左至右依次标记为1、2、3…。同时必须记录样本特异性索引以用于测序（需输入测序仪工作表中）。
   2. 从连接步骤1磁珠纯化板中转移40 µL（注意不要扰动磁珠沉淀）至预冷铝块中的MBC接头条管中。通过上下吹打6–8次混匀。
   3. 短暂离心后，将全部体积转移至连接步骤2试剂条管中（同样置于预冷铝块中）。通过上下吹打6–8次混匀，短暂离心后放入热循环仪模块。关闭加热盖，运行程序：22 °C 5分钟，4 °C保温。
      注意：此为安全暂停点，样本可在-20 °C保存。
   4. 从4 °C取出连接纯化磁珠，使其平衡至室温。准备1 mL新鲜的5 mM NaOH。
   5. 涡旋混匀连接纯化磁珠，向一组新的PCR条管中各加入50 µL。在磁力架上孵育1分钟。1分钟后移除并弃去上清液。从磁力架上取下条管，用50 µL连接纯化缓冲液重悬磁珠，上下吹打6–8次。
   6. 将连接步骤2产物的全部体积转移至连接纯化磁珠条管中。通过涡旋混匀样本，在室温孵育5分钟。再次涡旋混匀，继续在室温孵育5分钟。第二次孵育后，再次涡旋混匀样本，短暂离心，然后在磁力架上孵育1分钟。
   7. 移除并弃去上清液。加入200 µL连接纯化缓冲液，涡旋重悬。快速离心后置于磁力架上1分钟。使用连接纯化缓冲液再次进行第二次洗涤。
   8. 完成两次连接纯化缓冲液洗涤后，使用超纯水进行一次相同操作的洗涤。超纯水洗涤后，用20 µL 5 mM NaOH重悬磁珠，转移至96孔PCR板。将PCR板放入热循环仪模块中，覆盖压缩垫，运行程序：75 °C 10分钟，4 °C保温（加热盖）。
   9. 当样本冷却至4 °C后，短暂离心PCR板。将PCR板置于磁力架上至少3分钟，立即进入第一轮PCR。
9. 第一轮PCR与磁珠纯化
   1. 从4 °C取出第一轮PCR试剂条管，置于预冷铝块中。同时从-20 °C取出GSP1引物，使其平衡至室温。
   2. 向第一轮PCR试剂条管的每个孔中加入2 µL GSP1引物。将18 µL连接2纯化产物转移至第一轮PCR试剂条管中，通过上下吹打6–8次混匀。
   3. 短暂离心后转移至96孔PCR板。将PCR板放入热循环仪模块中，覆盖压缩垫，运行程序：95 °C 3分钟，15个循环（95 °C 30秒 − 65 °C 5分钟，升温速率100%），72 °C 3分钟，4 °C保温（加热盖）。
      注意：此为安全暂停点，样本可于4 °C过夜保存，或于-20 °C长期保存。
   4. 从4 °C取出纯化磁珠，使其平衡至室温。使用前充分涡旋混匀磁珠，并将24 µL磁珠加入U型底板相应数量的孔中。
   5. 将20 µL第一轮PCR产物转移至24 µL磁珠中。上下吹打6–8次混匀，在室温孵育5分钟，随后在磁力架上孵育2分钟。
   6. 移除并弃去上清液，用200 µL 70%乙醇洗涤两次，每次孵育30秒。最后一次洗涤后，彻底去除70%乙醇，室温晾干2分钟。
   7. 从磁力架上取下，用24 µL 10 mM Tris HCl pH 8.0重悬磁珠。脱离磁力架孵育3分钟，随后在磁力架上孵育2分钟。立即进入第二轮PCR。
10. 第二轮PCR与磁珠纯化
    1. 从4 °C取出第二轮PCR试剂条管，置于预冷铝块中。此时加入样本特异性索引，因此第二轮PCR条管的正确编号至关重要。将条管水平放置，铰链朝后，用永久性记号笔从左至右依次标记为1、2、3…。同时从-20 °C取出GSP2引物，使其平衡至室温。
       注意：必须记录样本特异性索引以用于测序（需输入测序仪工作表中）。
    2. 向第二轮PCR试剂条管的每个孔中加入2 µL GSP2引物。将18 µL第一轮PCR纯化产物转移至第二轮PCR试剂条管中，通过上下吹打6–8次混匀。
    3. 短暂离心后转移至96孔PCR板。将PCR板放入热循环仪模块中，覆盖压缩垫，运行程序：95 °C 3分钟，18个循环（95 °C 30秒 − 65 °C 5分钟，升温速率100%），72 °C 3分钟，4 °C保温（加热盖）。
       注意：此为安全暂停点，样本可于4 °C过夜保存，或于-20 °C长期保存。
    4. 从4 °C取出纯化磁珠，使其平衡至室温。使用前充分涡旋混匀磁珠，并将24 µL磁珠加入U型底板相应数量的孔中。
    5. 将20 µL第二轮PCR产物转移至磁珠中。上下吹打6–8次混匀，在室温孵育5分钟，随后在磁力架上孵育2分钟。
    6. 移除并弃去上清液，用200 µL 70%乙醇洗涤两次，每次孵育30秒。最后一次洗涤后，彻底去除70%乙醇，室温晾干2分钟。
    7. 从磁力架上取下，用24 µL 10 mM Tris HCl pH 8.0重悬磁珠。脱离磁力架孵育3分钟，随后在磁力架上孵育2分钟。将20 µL第二轮PCR纯化产物转移至新的96孔PCR板中。
       注意：此为安全暂停点，文库可于-20 °C长期保存，或立即进入文库定量步骤。
11. 文库定量
    1. 从-20 °C取出文库定量主混合液和标准品，使其平衡至室温。
    2. 使用10 mM Tris HCl pH 8.0对所有文库（第二轮PCR产物）进行1:5稀释，随后使用含0.05%聚山梨酯的10 mM Tris HCl pH 8.0进行连续稀释：1:199、1:199和20:80。最终两个稀释度（1:200,000和1:1,000,000）需设三个重复。
    3. 向光学96孔板的每个孔中加入6 µL主混合液，随后加入4 µL相应稀释液或标准品。短暂离心后，将PCR板装入qPCR仪。使用以下扩增条件：1个循环95 °C 5分钟，35个循环95 °C 30秒（升温速率4.4 °C/s）− 60 °C 45秒（升温速率2.2 °C/s）。
    4. 完成文库定量并确定文库浓度（通过两个测试稀释度的平均值计算）后，使用10 mM Tris HCl pH 8.0将所有文库归一化至2 nM。将每个归一化后的文库各取10 µL，混合于一个1.5 mL微量离心管中，制备文库混合液。
12. 文库测序
    1. 从-20 °C取出测序仪试剂盒，置于去离子水（DI水）中至填充线，至少1小时。同时从4 °C取出测序仪试剂盒，使其在室温平衡至少1小时。该测序平台最多可同时测序8个文库（其中必须包含一个阳性对照）。
    2. 通过将10 µL文库混合液与10 µL 0.2 N NaOH混合，制备变性扩增子文库（DAL）混合液，在室温孵育5分钟。5分钟后加入10 µL 200 mM Tris HCl pH 7.0，随后加入970 µL HT1杂交缓冲液。
    3. 通过混合300 µL HT1、25 µL 20 pM PhiX和675 µL DAL混合液，制备最终上样管。涡旋混匀后短暂离心。将上样管全部体积加入测序仪试剂盒的样本孔中，并将试剂盒装入测序仪，运行2 × 151 bp读长，同时进行2 × 8索引读取。

2. 数据分析

1. 测序数据处理与分析
   1. 从高通量测序（NGS）仪器下载测序指标数据。
   2. 确保测序数据落在以下范围内（针对本示例所用试剂盒的具体要求）：簇密度（密度 [K/mm²]）：945–1600 K；通过过滤的读段比例（簇PF [%]）：>90%；质量得分（% ≥Q30）：>85%；PhiX比对率（比对 %）：1.5−6.0%；PhiX错误率（错误率 [%]）：<1.0%；通过过滤的读段数（读段PF [M]）：>2200万。
      注：未达到上述指标的测序运行需重新进行。
   3. 检查每个样本（即每个样本特异性索引）所占读段比例。在典型的运行中，PhiX掺入量约为5%，共测序8个样本，每个样本理想情况下应占读段总数的约11.9%。每个样本的可接受范围为5−25%。若任一样本超出此范围，则需重复文库定量及测序。
2. 将原始序列数据提交至分析算法
   注：本文描述的是ArcherDx Analysis软件版本4.1.1.7。在本示例中，分析软件以“虚拟机”形式部署于内部服务器上。每并发分析一个样本需一个中央处理器（CPU）和12 GB随机存取存储器（RAM）（通常同时处理8个样本，共需8个CPU和96 GB RAM）。处理时间通常为3−8小时。
   1. 使用分析系统中的默认分析设置，但以下两项除外：MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS（由10改为20）和READ_DEPTH_NORMALIZATION（设为0以防止下采样）。
   2. 在用户界面中点击执行分析，提交作业名称，并选择必要的FASTQ文件（确保为每个样本选择双端读段[R1和R2]）。
   3. 选择RNA融合作为RNA分析类型，Illumina（双端）作为测序平台，FusionPlex实体瘤检测面板作为目标区域，然后点击提交分析。
3. 检测数据分析与解读
   1. 打开分析系统的用户界面并选择目标作业，选择阳性对照样本。确认所有预期的融合基因和致癌异构体均已被检测到，并列于强证据标签页中。
      注：若在某次检测运行中，阳性对照中任一追踪的融合基因未被检出，可能提示该次运行存在问题，需从检测起始步骤重新进行。
   2. 点击读段统计标签页，检查该运行中每个临床样本的读段统计数据。每个样本应至少包含100万条总片段。若少于100万条，应重新测序文库，并考虑重新定量，以确认初始定量结果无异常偏高。
      注：高质量样本通常显示靶上率 % >85%，RNA分子标签数应>20,000，且占总读段数的>30%。然而，未达到这些指标并不自动判定样本失败。
   3. 检查每个GSP2对照的平均唯一起始位点数数值。
      注：该数值反映针对四个看家基因引物的测序复杂度，是样本RNA质量的关键决定因素（若预期在样本中表达的基因测序效果差，则检测表达融合基因的可信度较低）。该指标的阈值为20。若任一样本数值低于20，且未发现高置信度融合，则该样本结果必须报告为无信息价值。该指标状态也可在运行摘要页面中查看（状态将显示为融合质控：通过或融合质控：GSP2对照RNA唯一起始位点数低，取决于数值是否大于或小于20）。即使样本未通过此项质控，若确认融合真实存在，仍可报告高置信度融合结果（见下文）。通常，该指标的QC评分越高，PreSeq Ct值越低，符合预期（图2）。
4. 融合基因结果解读
   1. 仔细审查强证据标签页下的每一个被检出的融合基因（系统检出的大多数强证据融合为人工假象）。同时浏览弱证据融合分类，尽管其中出现非人工假象融合的情况极为罕见。评估融合有效性时，首先关注读段数（#/%)和起始位点数指标。
      注：通常，这些指标数值越高，对检出融合的置信度越高。若融合支持读段来自支持引物的比例低于10%，且支持起始位点数少于5个，则高度怀疑为人工假象。
   2. 注意过滤器列中显示的图标。
      注：其中多个图标提示可能存在人工假象来源。常见情况（主要出现在弱证据融合分类中）包括：融合伙伴为已知旁系同源基因，或序列具有相似性（提示可能引物错配或错误比对）。另一常见的人工假象来源是支持融合的读段具有高错误率，表明其与参考基因组比对质量差，此类情况有特定图标标识。转录通读事件通过另一图标识别，此类事件较常见，通常可忽略。用户界面中还使用其他多个图标，但本文不详尽描述所有图标。通常可忽略且无需进一步调查的常见假象包括：ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, 和FCGR2C-MAST。
   3. 在用户界面中点击可视化链接，查看每个潜在融合的支持读段，该操作将引导用户进入基于网页的JBrowse视图，显示单个支持融合读段的堆积情况。确认读段总体上无错配（尽管可接受一定程度的背景噪声），有显著比例（理想情况下>30个碱基）的读段比对至融合伙伴基因，并且基因断点及引物结合位点附近的序列无插入或缺失。确认比对序列包含支持融合读段引物的3’端结合序列（若不含3’端序列，可能提示引物错配）。
   4. 若融合涉及两个基因的编码序列，需确保3’端伙伴基因保持阅读框正确。在界面中点击翻译链接（将为每个参考序列组合提供真或假状态），并手动通过基因组浏览器检查断点位置，确认融合处于正确阅读框。可通过将鼠标悬停在融合示意图中的红色圆点上确定断点位置。
      注：由于大多数（但非全部）真实融合的基因组断点位于内含子区域，并导致完整外显子拼接，因此当两个伙伴基因的断点均位于外显子边界时，通常对该融合的置信度更高。然而，已有大量文献报道融合中存在外显子内部断点，因此不应将其作为融合解读的绝对标准。
   5. 对每个融合，手动确认断点附近的序列与每个伙伴基因的下一个预期连续碱基无同源性。在基因组浏览器中检查所有可能的连续外显子。
      注：融合假象的常见来源是由于两个基因伙伴之间存在序列同源性导致的比对错误或引物错配，而系统可能未通过上述图标识别此类情况。

结果

如图3、图4和图5所示，这些截图来自分析用户界面，展示了肺腺癌样本的分析结果。图3上方为样本摘要，列出了被检出的具有强证据支持的融合基因，以及质控（QC）状态（以红圈标出）。ADCK4-NUMBL融合（列出了3种异构体）被立即排除，因其为持续存在的转录通读事件（在条目旁以虚线圆圈图标标注）。图3下方为“读段统计”页面的截图。其中具有重要信息的指标以绿色圈出。决定样本通过与否的关键质控指标以红色高亮显示（该指标决定了上方摘要中的通过/未通过状态）。若该值低于20，则阴性融合结果被视为“无信息价值”。图4和图5分别为两个需要进一步调查的融合基因的融合示意图（上方）和支持读段的JBrowse视图（下方）的截图。<...

讨论

基于锚定多重PCR的靶向富集与文库构建，结合下一代测序技术，非常适用于临床肿瘤样本中多重基因融合的检测。该方法以RNA为起始输入材料，而非基因组DNA，从而避免了对庞大且重复的内含子区域进行测序的需要。此外，由于该策略在扩增时不受融合伴侣基因身份的限制，因此能够检测出 novel 基因融合事件。这一特性在临床应用中具有重要意义，已有大量文献报道通过AMP方法鉴定出具有临床干预价值的 novel 基因融合事件^{21,22,23,24,25}。

由于该检测基于RNA，因此在处理过程中保持样本中RNA的质量至关重要。同时，确定哪些样本产生的RNA测序结果过于低下而无法信任阴性融合结果也极为重要。这一判断通过评估针对四个看家基因的引物测序数据来实现。如果这些基因的测序结果...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mM Tris HCl pH 8.0	IDT	11-05-01-13	用于TNA稀释
1M Tris pH 7.0	Thermo Fisher	AM9850G	用于文库合并
25 mL 带分隔的试剂储液槽	USA Scientific	9173-2000	适用于多通道移液器和大体积试剂操作
96孔半裙边0.1 mL透明PCR板	USA Scientific	1402-9700	用于热循环仪步骤
Agencourt AMPure XP磁珠	Beckman Coulter	A63881	用于多个检测步骤后的纯化
Agencourt Formapure试剂盒	Beckman Coulter	A33343	用于TNA提取
Archer FusionPlex实体瘤检测试剂盒	ArcherDX	AB0005	该试剂盒包含进行Illumina测序文库制备所需的大部分试剂（也可提供用于Ion Torrent测序的试剂盒）
96孔冰块	Light Labs	A7079	用于在多个步骤中保持样本低温
乙醇	Decon Labs	DSP-MD.43	用于磁珠洗涤
Illumina文库定量内参标准品	Kapa Biosystems	KK4906	用于文库定量
文库定量引物及ROX低浓度qPCR预混液	Kapa Biosystems	KK4973	用于文库定量
文库定量标准品	Kapa Biosystems	KK4903	用于文库定量
96孔磁力板（N38级）	Alpaqua	A32782	用于磁珠纯化步骤
MBC接头Set B	ArcherDX	AK0016-48	含有样本特异性索引的接头，用于实现多重测序
微量离心机	USA Scientific	2641-0016	用于离心PCR管
MicroAmp EnduraPlate光学96孔板	Thermo-Fisher	4483485	用于测序前质控文库定量
Microamp光学膜压缩垫	Applied Biosystems	4312639	用于文库定量
微型板旋转器	Labnet	MPS-1000	用于将液体收集至孔板底部
MiSeq试剂盒v3（600个循环）	Illumina	MS-102-3003	包含MiSeq测序运行所需的各种组分
MiSeqDx系统	Illumina		高通量测序仪器
Model 9700热循环仪	Applied Biosystems		在检测过程中用于多个步骤
无核酸酶水	Ambion	9938	用作通用稀释液
光学ABI 96孔PCR板盖	Thermo-Fisher	4311971	用于测序前质控文库定量
PCR工作站Model 600	Air Clean Systems	BZ10119636	湿实验检测步骤在此“无菌操作台”中进行
蛋白酶K	Qiagen	1019499	用于TNA提取
QuantStudio 5	Applied Biosystems	LSA28139	用于测序前质控和文库定量的qPCR仪器
Qubit RNA高灵敏度检测试剂盒	Life Technologies	Q32855	用于测定TNA样本中的RNA浓度
RNase Away	Fisher	12-402-178	用于工作区域的常规RNase去污染
Seraseq FFPE肿瘤融合RNA参考物质v2	SeraCare	0710-0129	用作检测的阳性对照
氢氧化钠	Fisher	BP359-212	用于清洁步骤和测序准备
SYBR Green Supermix	Bio Rad	172-5120	测序前质控检测的组分
TempAssure PCR 8联管条	USA Scientific	1402-2700	用于试剂和样本混合等操作
模板RT PCR封膜	USA Scientific	2921-7800	用于覆盖96孔板
U型底96孔微孔板	LSP	MP8117-R	用于磁珠纯化过程