活细胞荧光显微镜技术用于研究细菌中亚细胞蛋白定位及细胞形态变化

摘要

本文提供了使用高分辨率荧光显微镜研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中蛋白质亚细胞定位动态及监测形态变化的逐步操作指南。

摘要

对影响细菌细胞分裂和细胞形态的因素的研究通常需结合高分辨率荧光显微镜进行，因为在群体水平上观察到的现象可能无法真实反映单个细胞水平上的实际情况。活细胞时间序列显微成像技术使研究人员能够监测细胞分裂或细胞形态的动态变化，从而实时获取蛋白质亚细胞定位和基因表达时序的宝贵信息，有助于回答重要的生物学问题。本文中，我们描述了利用高分辨率去卷积显微镜监测Bacillus subtilis和Staphylococcus aureus表型变化的实验方案。本报告的目的是提供一套简单明了的实验流程，可供其他希望开展荧光显微镜实验以研究细菌及其他生物中不同生物学过程的研究人员参考和采用。

引言

近年来，显微镜技术的进步显著推动了细菌细胞生物学领域的发展^1,2。在众多仪器中，能够进行延时荧光显微成像实验的显微镜仍是一种重要的工具。研究人员可以利用荧光蛋白（如基于绿色荧光蛋白（GFP）的转录和翻译报告融合蛋白）、荧光D-氨基酸（FDAA）³，或其他用于标记细胞壁、细胞膜和DNA的染料，实时监测多种生理事件。因此，荧光显微镜在微生物细胞生物学家当中持续广受欢迎。除了简单展示最终表型外，通过延时显微成像揭示所观察表型的形成过程，可显著提升研究发现的价值，并可能为潜在药物候选物所靶向的细胞过程提供线索⁴。

本文提供了使用全自动倒置宽场荧光显微镜（见材料表）进行高分辨率成像的操作方案。这些方案可适当调整，以适用于其他具备延时显微成像能力的荧光显微镜。尽管本文讨论的软件对应于材料表中指定的特定厂商提供的软件，但其他显微镜制造商通常随附的软件，或免费开源的ImageJ⁵，均具备等效的显微图像数据分析工具。对于不适合进行延时成像的实验条件，也可按照本文所述方法开展时间进程实验。本文所述的操作方案详细指导如何研究两种不同细菌物种的表型变化：B. subt....

方案

1. 一般培养条件

1. 取单个菌落接种于2 mL添加了抗生素（如需要）的适宜生长培养基中。将种子培养物置于摇床培养箱中，在22 °C下过夜培养。
   注意：本文所用细菌的具体培养条件详见代表性结果部分。
2. 将过夜培养物按1:20比例转接至装有新鲜培养基的125 mL三角瓶中，并根据需要添加抗生素。
3. 在37 °C摇床培养箱中培养至对数中期（OD₆₀₀ = 0.5）。
   注意：可在适当的生长阶段直接向培养物中加入诱导剂或抑制剂。
4. 按照下节所述方法，在所需培养条件下收获细胞，用于显微镜样品制备。

2. 样品制备

1. 通过将0.25 g分子生物学级、低电渗（EEO）琼脂糖与25 mL培养基（根据需要添加适当抗生素，用于延时显微镜观察）或无菌水混合，制备1%琼脂糖溶液。使用微波炉加热约30秒，然后倒入无菌的100 mm × 15 mm培养皿中，静置使其凝固。
2. 根据需要取5–50 µL细胞培养物，并对细胞进行染色。在此阶段使用适当的染料对细胞进行染色（例如，为实验添加荧光染料FM4-64（膜染色剂）（图1））。
   1. 用移液器吸取5 µL待成像的培养样品或已染色样品，滴加到35 mm玻璃底培养皿底部（微孔直径14 mm，未包被的No. 1....

结果

GpsB 表型
此前我们已证明，Sa-GpsB 是一种必需蛋白，使用反义 RNA 沉默 GpsB 会导致细胞裂解⁹。本文中，我们描述了如何利用本文所述的延时显微镜方案，捕捉到多种细胞分裂表型的出现以及蛋白定位的变化。为此，我们培养了先前报道的 S. aureus 菌株 RB143 [SH1000 携带 pEPSA5（空载体）] 和 GGS8 [SH1000 携带 pGG59 (P_xyl-gpsB^antisense bla cat)]⁹。具体操作如下：将菌株 RB143 和 GGS8 接种于 15 mL 试管中含 5 µg/mL 氯霉素（chlor）的 2 mL 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，于 22 °C 摇床过夜培养。将过夜培养物按 1:20 比例转接至 125 mL 锥形瓶中含新鲜 TSB + chlor 的 10 mL 培养基中，于 37 °C .......

讨论

显微镜技术一直是微生物研究中的核心手段。由于微生物细胞尺寸在微米级别，单细胞水平的研究传统上依赖于电子显微镜（EM）。尽管近年来电子显微镜已成为一种非常强大的技术，但它除了用户可及性有限外，自身也存在固有的局限性¹⁶。荧光显微镜技术的进步以及多种荧光探针（如FDAA³）的开发，为微生物细胞生物学家提供了丰富的工具，用于在活细胞中研究各种细胞过程。研究人员还在积极构建荧光工具，以监测活细胞中信号分子（如c-di-GMP等）水平的变化^17,18。此外，高分辨率的时间序列荧光显微镜使研究者能够实时观察动态变化，并研究相关的表型特征。

我们提供了使用高分辨率荧光显微镜进行显微成像实验的详细方案（参见材料表）。然而，这些方案中的步骤可根据用户需求和所用显微镜的具体情况进行调整。我们以S. aureus和B. subtili.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Fisher BioReagents	BP160-100	分子生物学级 - 低电渗流（Low EEO）
DAPI	Invitrogen	D3571	显微镜检测
FM4-64	Invitrogen	T3166	显微镜检测
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C	显微镜检测
IPTG	Fisher BioReagents	BP1755-10	无二恶烷
显微镜	GE	DeltaVision Elite	定制 Olympus IX-71 倒置显微镜支架；定制照明塔和透射光照明模块。物镜：PLAPON 60X（数值孔径 1.42，工作距离 0.15 mm）；OLY 100X OIL（数值孔径 1.4，工作距离 0.12 mm）；100X 物镜用 DIC 棱镜（Nomarski）；CoolSnap HQ2 相机；SSI 7 色光源组件；环境控制腔室 - 不透光。
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	FtsZ 抑制剂
SoftWorx	GE		厂商提供的成像软件