本文提供了使用高分辨率荧光显微镜研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中蛋白质亚细胞定位动态及监测形态变化的逐步操作指南。
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摘要
摘要
对影响细菌细胞分裂和细胞形态的因素的研究通常需结合高分辨率荧光显微镜进行，因为在群体水平上观察到的现象可能无法真实反映单个细胞水平上的实际情况。活细胞时间序列显微成像技术使研究人员能够监测细胞分裂或细胞形态的动态变化，从而实时获取蛋白质亚细胞定位和基因表达时序的宝贵信息，有助于回答重要的生物学问题。本文中，我们描述了利用高分辨率去卷积显微镜监测Bacillus subtilis和Staphylococcus aureus表型变化的实验方案。本报告的目的是提供一套简单明了的实验流程，可供其他希望开展荧光显微镜实验以研究细菌及其他生物中不同生物学过程的研究人员参考和采用。
引言
近年来，显微镜技术的进步显著推动了细菌细胞生物学领域的发展1,2。在众多仪器中，能够进行延时荧光显微成像实验的显微镜仍是一种重要的工具。研究人员可以利用荧光蛋白（如基于绿色荧光蛋白（GFP）的转录和翻译报告融合蛋白）、荧光D-氨基酸（FDAA）3，或其他用于标记细胞壁、细胞膜和DNA的染料，实时监测多种生理事件。因此，荧光显微镜在微生物细胞生物学家当中持续广受欢迎。除了简单展示最终表型外，通过延时显微成像揭示所观察表型的形成过程，可显著提升研究发现的价值，并可能为潜在药物候选物所靶向的细胞过程提供线索4。
本文提供了使用全自动倒置宽场荧光显微镜（见材料表）进行高分辨率成像的操作方案。这些方案可适当调整，以适用于其他具备延时显微成像能力的荧光显微镜。尽管本文讨论的软件对应于材料表中指定的特定厂商提供的软件，但其他显微镜制造商通常随附的软件，或免费开源的ImageJ5，均具备等效的显微图像数据分析工具。对于不适合进行延时成像的实验条件，也可按照本文所述方法开展时间进程实验。本文所述的操作方案详细指导如何研究两种不同细菌物种的表型变化：B. subtilis 和 S. aureus。所用菌株详见表1。
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方案
1. 一般培养条件
- 取单个菌落接种于2 mL添加了抗生素（如需要）的适宜生长培养基中。将种子培养物置于摇床培养箱中，在22 °C下过夜培养。
注意：本文所用细菌的具体培养条件详见代表性结果部分。 - 将过夜培养物按1:20比例转接至装有新鲜培养基的125 mL三角瓶中，并根据需要添加抗生素。
- 在37 °C摇床培养箱中培养至对数中期（OD600 = 0.5）。
注意：可在适当的生长阶段直接向培养物中加入诱导剂或抑制剂。 - 按照下节所述方法，在所需培养条件下收获细胞，用于显微镜样品制备。
2. 样品制备
- 通过将0.25 g分子生物学级、低电渗（EEO）琼脂糖与25 mL培养基（根据需要添加适当抗生素，用于延时显微镜观察）或无菌水混合，制备1%琼脂糖溶液。使用微波炉加热约30秒，然后倒入无菌的100 mm × 15 mm培养皿中，静置使其凝固。
- 根据需要取5–50 µL细胞培养物，并对细胞进行染色。在此阶段使用适当的染料对细胞进行染色（例如，为实验添加荧光染料FM4-64（膜染色剂）（图1））。
- 用移液器吸取5 µL待成像的培养样品或已染色样品，滴加到35 mm玻璃底培养皿底部（微孔直径14 mm，未包被的No. 1.5盖玻片；参见材料表）。
注意：切勿使用聚-L-赖氨酸包被的盖玻片，尤其是在延时显微镜观察中，因其可能诱导不同的生长模式（我们亦观察到聚-D-赖氨酸存在类似现象；数据未显示）和/或影响蛋白质动态6。 - 为减少染料用量，可直接在玻璃底培养皿上对3–4 µL细胞悬液（在OD600 = 0.5时收获；每1 mL培养物中约含2.7 × 107个和3.4 × 107个细胞，分别为B. subtilis和S. aureus）进行染色。
- 将预先切割好的琼脂糖块（直径11 mm，或任何所需尺寸以覆盖盖玻片区域；可用无菌移液管开口端或剃刀片切割）置于样品上方，轻轻按压，确保琼脂糖块平整贴合于盖玻片表面。
- 用移液器吸取5 µL待成像的培养样品或已染色样品，滴加到35 mm玻璃底培养皿底部（微孔直径14 mm，未包被的No. 1.5盖玻片；参见材料表）。
- 成像后（见下节），若视野中细胞数量不理想，可通过离心浓缩或稀释的方式调整样品的细胞密度，并根据需要使用培养基/缓冲液调节样品中细胞的比例。
注意：为最大限度减少培养基自身产生的自发荧光，可在成像前用缓冲液（例如标准1×磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，并将细胞重悬于适量缓冲液中。需注意，在此步骤中较小的细胞或囊泡可能在离心过程中无法保留，从而丢失。 - 使用移液器向培养皿内（盖玻片周围）加入水（约5 µL液滴），以防止琼脂糖垫干燥，并有助于在整个图像采集过程中维持湿度，尤其适用于延时实验。
- 将培养皿置于显微镜的孵育室（制造商提供的内置不透光隔室）中，平衡15–20分钟，使其温度与孵育室内温度一致。
注意：在成像前数小时开启加热装置，并将孵育室设定至所需温度，以确保设备充分达到并稳定于目标温度。对于长时间延时成像，可在显微镜腔室内远离工作区域的位置放置盛水的烧杯或锥形瓶，以维持湿度。
3. 成像
- 实验当天，打开显微镜系统，启动成像软件（参见 材料表) ，然后单击桌面上相应的图标。通过单击 初始化显微镜 在软件启动对话框中选择该选项（按钮上标有显微镜图标）。初始化前，务必使用显微镜粗调旋钮将物镜完全降下。
注意：初始化完成后，除了开始菜单外，还应出现三个额外的对话框：resolve3D、数据采集和滤波监测器。 - 在制造商提供的100倍油镜物镜（数值孔径 = 1.4，工作距离 = 0.12 mm）上滴加一滴折射率为1.517的浸油（见 材料表).
注意：选择适合成像温度的浸油至关重要。 - 将装有样品的玻璃底培养皿放入金属载物台外壳（棺形架）中，并轻轻滑入载物台夹具。
- 使用粗调旋钮将物镜抬升，直至油滴与培养皿的玻璃底面接触。通过目镜并调节细调旋钮，使样本清晰对焦。当细胞清晰可见后，将显微镜主体前方的切换开关向左拨动，将光路从目镜切换至相机模式。
- 使用成像软件开始实验。在 resolve3D 窗口中，选择 设计/开展实验 烧瓶图标。此时应出现一个名为 设计/开展实验.
- 使用Z-stack数量和样品厚度进行设置 设计 然后 切片 标签页上的 设计/开展实验 对话框
注意：在代表性结果部分的实验中，静态图像采用间隔为200 nm的17层Z轴堆栈，延时显微镜采用间隔为200 nm的4层Z轴堆栈。 - 为测量样品中细胞的厚度，使用键盘上下箭头逐级手动调节Z平面。 resolve3D 对话框。标记细胞失焦的位置，作为图像采集的上限和下限。在运行实验前导入此信息。
- 为减少延时成像过程中的光毒性和光漂白现象，应降低Z轴层厚扫描次数，并选择细胞的中位平面进行图像采集。
- 使用Z-stack数量和样品厚度进行设置 设计 然后 切片 标签页上的 设计/开展实验 对话框
- 使用实验所需的合适滤光片组 设计 然后 通道 标签页上的 设计/开展实验 对话框（TRITC：激发 542/27；发射 597/45；FITC/GFP：激发 475/28；发射 525/48；mCherry：激发 575/25；发射 632/60；Cy5：激发 632/22；发射 676/34）
- 同时，选择用于采集偏光/微分干涉差（POL/DIC）信息的参考通道。在成像前，通过选择相应选项，调节所选各个通道的透光率（光强）和曝光时间。 resolve3D 对话框
注意：在不用于正式实验的测试视野中，先对这些参数进行测试，以确认所选参数能否获得有意义的荧光数据，同时避免遗漏弱信号或造成信号过饱和。随后将优化后的参数导入正式实验设置中。
- 同时，选择用于采集偏光/微分干涉差（POL/DIC）信息的参考通道。在成像前，通过选择相应选项，调节所选各个通道的透光率（光强）和曝光时间。 resolve3D 对话框
- 通过选择打开点列表 要点列表 按钮 resolve3D 对话框。此时应出现一个新对话框，标题为 要点列表使用显微镜载物台控制装置找到合适的视野，然后在点列表对话框中选择标记点选项，对实验中将要使用的多个视野进行标记。
注意：每次显微镜重新对焦到点列表中的某个点时，都必须选择一个替换点。这可以通过将显微镜对焦到列表中的相应点，然后选择该点来完成 替换点 按钮。重新对焦时切勿触碰模拟粗/细调焦旋钮；仅通过软件进行对焦调节。 - 设置延时参数时，先选择设计，然后 延时摄影 在设计/运行实验对话框中点击选项卡。选中延时摄影复选框。根据延时图像/总时间输入相应的延时参数。
- 从点列表中选择要成像的点作为设定点 设计 然后 点 在“设计/运行实验”对话框中点击选项卡。选择“访问点列表”选项，并在文本框中输入要成像的点，各点之间用逗号或连字符分隔（若为连续序列）。
- 在开始实验之前，使用以下方法编辑文件名和文件位置 运行 在设计/运行对话框中点击标签。可通过选择来更改文件位置 设置 按钮，选择数据文件夹，然后选择相应的文件夹或创建新文件夹。通过在图像文件名文本框中输入新的文件名来更改文件名。
- 实验开始时，选择 播放 按钮 开始实验对话 盒子
注意：进行延时成像时，需在整个实验过程中使用微分干涉差（DIC）设置持续检查每个视野的焦距，因为细胞随时间推移容易失焦，需重新对焦并更新点位列表中的信息，以避免不必要的光漂白。
4. 图像处理
- 打开所需的原始（R3D）图像文件以生成图示。
注意：可使用成像软件启动对话框中的数据文件夹按钮查找最近保存的文件。 - 运行去卷积程序，以去除离焦荧光光7,8，以生成去卷积的D3D图像文件。选择 过程 启动对话框中的选项卡，然后选择 去卷积. 此时将出现一个名为 去卷积.
- 通过将每个图像文件左上角的相应图像编号拖动到去卷积对话框的输入位置，来设置去卷积参数。在去卷积对话框中，选择 更多选项 按钮，并取消选择 裁剪边框滚降 之后 处理 复选框（否则图像无法叠加到相应的 DIC 文件上）。
- 点击 做它 单击去卷积对话框中的按钮以对原始图像文件进行去卷积。
注意：可根据软件制造商指导手册中的建议调整去卷积参数，以获得理想结果。
- 如有需要，可在任意或所有波长（颜色）通道中进行手动背景噪声扣除以及亮度/对比度调整。通过选择 对比度调节 反卷积图像文件上的按钮。
- 将图像另存为TIFF文件，首先选择 文件 顶部的选项 D3D 对话框。然后选择“另存为TIFF”，识别并选择适当的Z轴层叠图像（处于焦点范围内），选择或取消选择所需的滤光片组。
- 使用任何制造商提供的软件或免费程序（如 ImageJ）进行数据量化5.
- 进行细胞大小定量时，点击 工具 点击相应的 D3D 图像文件，然后选择 测量距离 选项。通过鼠标左键单击选定目标图像文件上的起点和终点来测量距离。
注意：进行细胞大小定量时，最好对图像进行放大操作。 - 用于荧光信号定量分析，使用 数据检查器 选项位于下方 工具 单击相应的 D3D 图像文件。
注意：进行荧光信号定量时，最好放大图像并仅选择相关的滤光片。 - 为定量荧光信号，使用列/行选项设置为特定尺寸的方框，选取待定量信号区域并记录数值。采用相同尺寸的方框选择细胞外紧邻区域以测量背景信号。将细胞内荧光信号测得值减去背景信号值，得到校正后的荧光强度。
- 进行细胞大小定量时，点击 工具 点击相应的 D3D 图像文件，然后选择 测量距离 选项。通过鼠标左键单击选定目标图像文件上的起点和终点来测量距离。
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结果
GpsB 表型
此前我们已证明，Sa-GpsB 是一种必需蛋白，使用反义 RNA 沉默 GpsB 会导致细胞裂解9。本文中，我们描述了如何利用本文所述的延时显微镜方案，捕捉到多种细胞分裂表型的出现以及蛋白定位的变化。为此，我们培养了先前报道的 S. aureus 菌株 RB143 [SH1000 携带 pEPSA5（空载体）] 和 GGS8 [SH1000 携带 pGG59 (Pxyl-gpsBantisense bla cat)]9。具体操作如下：将菌株 RB143 和 GGS8 接种于 15 mL 试管中含 5 µg/mL 氯霉素（chlor）的 2 mL 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，于 22 °C 摇床过夜培养。将过夜培养物按 1:20 比例转接至 125 mL 锥形瓶中含新鲜 TSB + chlor 的 10 mL 培养基中，于 37 °C ...
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讨论
显微镜技术一直是微生物研究中的核心手段。由于微生物细胞尺寸在微米级别，单细胞水平的研究传统上依赖于电子显微镜（EM）。尽管近年来电子显微镜已成为一种非常强大的技术，但它除了用户可及性有限外，自身也存在固有的局限性16。荧光显微镜技术的进步以及多种荧光探针（如FDAA3）的开发，为微生物细胞生物学家提供了丰富的工具，用于在活细胞中研究各种细胞过程。研究人员还在积极构建荧光工具，以监测活细胞中信号分子（如c-di-GMP等）水平的变化17,18。此外，高分辨率的时间序列荧光显微镜使研究者能够实时观察动态变化，并研究相关的表型特征。
我们提供了使用高分辨率荧光显微镜进行显微成像实验的详细方案（参见材料表）。然而，这些方案中的步骤可根据用户需求和所用显微镜的具体情况进行调整。我们以S. aureus和B. subtili...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢实验室成员对本文提出的宝贵意见。本研究由南佛罗里达大学的启动资金（PE）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Fisher BioReagents | BP160-100 | 分子生物学级 - 低电渗流（Low EEO） |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 显微镜检测 |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | 显微镜检测 |
| 玻璃底培养皿 | MatTek | P35G-1.5-14-C | 显微镜检测 |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | 无二恶烷 |
| 显微镜 | GE | DeltaVision Elite | 定制 Olympus IX-71 倒置显微镜支架；定制照明塔和透射光照明模块。物镜：PLAPON 60X（数值孔径 1.42，工作距离 0.15 mm）；OLY 100X OIL（数值孔径 1.4，工作距离 0.12 mm）；100X 物镜用 DIC 棱镜（Nomarski）；CoolSnap HQ2 相机；SSI 7 色光源组件；环境控制腔室 - 不透光。 |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ 抑制剂 |
| SoftWorx | GE | 厂商提供的成像软件 |
参考文献
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