用于循环作用电位记录的多井微电极阵列上的人类 iPSC 衍生心肌细胞网络

人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞(hiPSC-CMs)是越来越多的实验室1、2、3、4、5、6的黄金标准 ^,7,8,9,10.殴打胚胎体11,12,13 和单层3,^7,10,11,12, 13、14、15、16、17 微分是心肌细胞生产的首选方法,多电极阵列 (MEA) 已成为常见模式用于监测这些网络的电动力学18,19,20。虽然可以从场势(FPs)中提取的参数,如跳动率、振幅、持续时间和RR间隔,是自发殴打单层18、21^的基线电生理^反应。 22,23,作用电位(AP)组件背后的这些细胞外FP信号是很难^推断24。我们最近发表的关于发现MEA应用于直接循环AP测量的出版物,为在多个重极化阶段进行各种重极化阶段的示范性细胞内AP读出提供了方法证明批次的hiPSC衍生心肌细胞网络3。在这项研究中,我们证明,将电传脉冲输送到hiPSC衍生心肌细胞网络,使AP记录能够进行细胞内访问。这些瞬态AP记录取决于通过损伤部位3、25、26观察到的跨膜电位恢复。通过MEA和贴片夹记录的波形在我们的研究中显示了类似的AP形态,从而验证了^方法3的可靠性。

一些实验室报告说,使用定制的MEA18、21、26、27、28、29测量来自各种电原电池的AP。 ^30,但使用MEA进行一致和反复的AP测量的可靠性没有评估。目前,金标准贴片夹技术仅限于终端记录7,31,而基于MEA的AP测量是瞬态的,因此可以在同一单元上进行多次。我们还表明,在需要最小滤波的毫伏范围内,可以轻松录制高质量的 AP 信号。因此,研究人员不仅可以使用MEA进行急性和慢性药物研究。 此外,该技术允许在短时间内同时进行FP/AP测量,生成电生物群库。鉴于日益强调心律失常预测和药物相关的心毒性^{24,32,33,34,35,}AP 测量集成方法将加强药物的安全性和有效性评估。

在这里,我们提出关于 1) 预镀低温的 hiPSC-CM 以进行成熟,2) 分离和电镀多井 MEA 上的 hiPSC-CM,3) 记录来自 hiPSC-CM 网络的 FP 和 AP,4) 分段和提取数据进行分析,以及 5)还原数组以供多次重用。每个步骤都进行了优化,强调关键步骤,只要相关。讨论了细胞附件要求,以确保跳动的同步单层,并解释了重复电生理学研究的多孔MEA恢复程序。最后,提出了实验室开发的用于AP信号提取、质量保证和分段工作流程的定制GUI,以量化和分析AP参数。

1. 溶液和材料的准备(见材料表)

1. 6孔组织培养板基板涂层
   1. 在冰上或4°C处解冻涂层基板。
   2. 在冷 DMEM/F12 介质中制备 1:100 涂层基板稀释。通过缓慢移液混合溶液。
   3. 每孔6孔组织培养板的涂层基板溶液(步骤1.1.2)传输2 mL。
   4. 立即将涂布组织培养板置于细胞培养箱中的37°C和5%CO_2,至少7小时,并在7天内使用。
2. hiPSC-CM 培养介质
   1. 加入10 mL的CM介质补充在4°C至500 mL的CM基介质解冻。在4°C下储存长达2周。
   2. 对当天需要多少介质进行等分,并在使用前达到室温。
3. hiPSC-CM解冻介质:通过将hiPSC-CM培养基(步骤1.2)与10%胎儿牛血清(FBS)混合制备新鲜。在将 CM 解冻以进行悬浮之前,将介质带到室温。
4. Fibrointin 1mg/mL库存溶液:阿利胶200μL到1.5 mL无菌微熔管中,储存在4°C,供以后使用。在冰上新鲜制备浓度为 50 μg/mL 的工作溶液。
5. 多井清洁溶液:将 0.5 g 的酶洗涤剂与 50 mL 的无菌双蒸馏水 (ddH₂O) 结合。漩涡混合内容。过滤并储存在4°C下长达一周。

2. 冷冻保存的HIPSC-CM用于成熟的预镀(图1)

注:本部分用于使用无进料单层方法3、16和低温保存在液氮中10天在1-2百万个细胞/瓶中进行解冻和培养的hiPSC-CM。一小瓶的细胞被镀入六孔组织培养板的两个基质涂层孔中。心肌细胞往往沉降在管的底部,因此在预镀时温和混合对于实现整个孔的细胞密度非常重要。

1. 将每瓶 hiPSC-CM 解冻成 15 mL 锥形管并达到室温的 FBS 2 mL。
2. 将冷冻保存的 hiPSC-CM 解冻小瓶,将其放入 37°C 水浴中,轻轻旋转,解冻不超过 3 分钟。
3. 立即将小瓶内容物转移到含有FBS的管中(参见步骤2.1),通过旋转和离心在200 x g下混合5分钟。
4. 吸气上清液,并在每瓶解冻的hiPSC-CM解冻介质(参见步骤1.3)的1 mL中重新悬浮细胞颗粒。使用转移移液器通过温和的三重调重新悬浮颗粒。评估细胞的生存能力。
5. 在步骤 2.4 中,每小瓶的 hiPSC-CM 解冻添加额外的 3 mL 解冻介质,并使用转移移液器轻轻暂停以进一步分离细胞团块。
6. 将 2 mL 的电池悬浮液轻轻放入每口基板涂层 6 孔板(参见步骤 1.1)。放置在细胞培养箱在37°C和5%CO2。
7. 在 24 小时后更换新鲜 hiPSC-CM 培养介质,此后每周更换 3 次,为期 20 天。
   注:电池应坚持在基板涂层上24小时,并在48小时镀层后自发跳动(见视频1和视频2)。

3. 多孔 MEA 板灭菌和涂层(图 2 和图 3)

注:此处所述的协议是准备 24 孔 MEA 板,在玻璃上带有 12 个微金 PEDOT 涂层电极,用于 HiPSC-CM 电镀。避免接触板的底部,因为这可能会损坏电极。

1. 在电镀电池前两天,在每个孔中加入 0.5 mL 的 hiPSC-CM 培养基(参见步骤 1.2),并执行基线记录以验证信号噪声比,以便对 MEA 进行质量检查。
2. 吸气介质,用无菌 ddH₂O 冲洗,并在紫外线下在层流罩内过夜。
3. 在细胞电镀前一天,在每个孔中加入0.1 mL的FBS,用于MEA表面的亲水处理。在室温下孵育30分钟。此步骤对于细胞附件是必需的。
4. 吸气FBS,每口净用0.5 mL的无菌ddH₂O冲洗。再重复一次。
5. 将板放在层流罩中干燥过夜。
6. 从库存中制备 50 μg/mL 纤维化在冷 DMEM/F12 介质中的工作稀释(参见步骤 1.4)。将溶液放在冰上。
7. 移液器 5 μL 的工作纤维质稀释(参见 3.6),并小心地将液滴分配到每个井的中心,以覆盖所有 12 个电极。在 24 口井中快速工作,以防止滴气干燥,这一点很重要。
8. 立即将纤维化涂层多孔 MEA 板放在含有无菌 ddH₂O 的加湿室内的凸起表面上,以覆盖整个盘面。将装有多孔MEA板的腔室放入细胞培养箱中3小时。
   注:将24孔MEA板放入加湿室对于防止纤维性滴在孵育期间干燥至关重要。

4. 多孔 MEA 板上的 hiPSC-CM 解散和电镀(图 3)

注:在MEA纤维细胞瘤孵育完成之前约1小时开始此步骤。确保细胞解散溶液在37°C下,iPSC-CM解冻介质在室温下。分离方法经过 30 天的优化,在基板涂层 6 孔板上培养的分化后 hiPSC-CM(参见步骤 2),以获得约 90% 的 MEA 电镀可行 CM。在三聚体时,应注意不要引入气泡,以防止细胞死亡。

1. 从6井组织培养皿的每口培养基中吸出培养基,具有30天分化后HIPSC-CM培养(参见步骤2.7),每口井用2mL无菌D-PBS清洗。
2. 每口井加入1mL的预加热细胞解脱液溶液(见材料表),在37°C下孵育4分钟。使用转移移液器轻轻三聚,以松开细胞以进行分离。如果大多数细胞仍然粘附,在37°C下再孵育3分钟,然后再次三聚。这种额外的孵育应有助于最大的细胞恢复。不要孵育超过7分钟,因为这可能导致细胞活力低下。
3. 使用转移移液器,将所有分离的细胞集中到含有hiPSC-CM解冻介质的锥形管中(参见步骤1.3)。建议将细胞悬浮在至少两倍的介质体积(每孔收获2 mL)中,以阻止细胞分离溶液的活动。
4. 在 200 x g下离心 5 分钟。
5. 当颗粒松散地附着在表面并重新悬浮在 0.1 mL 的 hiPSC-CM 解冻介质中时,请小心吸附溶液。使用转移移液器通过温和的三重调将颗粒重新悬浮几次。
6. 在1.5 mL微熔管中,用18μL的介质稀释分离的细胞的Aliquote 2 μL。加入20 μL的Trypan蓝,混合用于细胞计数和活力评估。
7. 通过添加适当的hiPSC-CM解冻介质,将细胞密度调整到6,000个细胞/μL。轻触几次,暂停颗粒。hiPSC-CM 可轻松从玻璃表面分离,尤其是在高密度镀层时。我们优化了播种密度和电镀条件,以实现 15 天的电气记录。
8. 准备就绪后,将多孔 MEA 板放入层流罩,用于细胞播种。执行以下两个步骤至关重要,一次一口井,以防止纤维性肌瘤干燥。
   1. 使用 P10 移液器小心地取出纤维化液滴,而不接触电极。
   2. 立即将5μL细胞滴(30,000个细胞)分到覆盖所有12个电极的MEA板的井中心。重复此步骤,直到所有 24 口井都镀了。建议通过轻拂来间歇性混合细胞悬浮液。
9. 将多孔MEA板放回松散覆盖的加湿室中,然后返回细胞培养箱,温度为37°C,CO₂为5%,为细胞附着3小时。
10. 小心地将 200 μL 的 hiPSC-CM 解冻介质添加到每个井中,而不会使用 P200 移液器干扰细胞。将介质滴到井边。
11. 将多孔MEA板放回细胞培养箱中。
12. 在电镀后 24 小时时更换新鲜 hiPSC-CM 培养基。此时可以观察到心肌细胞的自发跳动(参见视频 3)。
13. 每 2 天更换一次介质,直到实验结束。

5. hiPSC-CM 电穿孔和信号采集(图 4 和 6)

注:此协议用于同时记录高通量电极信号(24口井各12个点)。24井多井MEA系统与采集软件一起使用(见材料表)。所有 MEA 记录均在 37°C 下进行。

1. 打开接口板并启动采集软件。留出足够的时间使多井 MEA 头台达到 37 °C 温度(参见图4中的箭头 1 )。
2. 将多孔 MEA 板从步骤 4 插入多孔 MEA 头台,将其覆盖在录制平台上,然后单击"插入"按钮(参见图4中的箭头 2)。在开始录音之前,让温度稳定下来。
3. 调整采集和电穿孔设置
   1. 单击"定义实验流"图标(参见图 4中的箭头 3),并将录制时间设置为 2 分钟或根据需要。
   2. 单击数据采集设置图标(参见图 4中的箭头 4),并将采样速率设置为 20 kHz,将高通滤波器设置为 0.1 Hz,将低通滤波器设置为 3500 Hz。
   3. 单击"刺激器设置"图标(参见图5)。在"刺激定义"选项卡下,将刺激定义为 1 mV、1 ms 和 1 Hz 的双相对称电压脉冲。在"刺激电极"选项卡下,通过突出显示所有相关电极来选择电穿孔位点。
4. 单击"浏览"按钮可可视化所有井中的信号。验证信号质量和稳定状态条件。在 mV 范围内具有 FP 信号的电极上做笔记。单击同一按钮停止探索。截至目前,尚未记录任何数据。
5. 单击Go!按钮开始录制。每个井中的电极将在原始数据窗口中显示 FP 信号(图6)。录制 30 小时后,单击"刺激"按钮,允许在所选站点上进行 30 s 的电穿孔;然后,点击同一按钮停止刺激,并继续录制剩余的60秒。
   注: 通过切换到"应用程序"下拉菜单中的"重新播放模式",可以播放录制的文件。

6. 多孔 MEA 板清洁,以便重复使用

1. 完成实验后,通过吸气每个孔中的所有介质内容,并小心避免接触电极表面,清洁多孔板中的所有孔。
2. 每口加1 mL无菌ddH₂O。吸气并重复一次。
3. 每口井添加 0.3 mL 的多井清洁溶液(参见步骤 1.5)。在室温下孵育过夜,以清除细胞和碎屑。
4. 第二天早上,吸出溶液,用1mL的无菌ddH₂O.孵育5-7分钟,吸气。重复5次。
5. 每口加0.5 mL无菌ddH₂O。记录已清洁多孔板的基线,以便对清洁的 MEA 进行质量检查(图 7)。
6. 储存在4°C,直到准备使用。

7. 数据文件转换和导出

注:每次录制将生成四个数据文件:MWR、MWC、MWD 和 MWS 文件。使用转换器软件,MWD 文件可以转换为 H5 文件,以便使用自定义脚本进行后续分析(请参阅补充文件 1)。

1. 启动转换器软件(参见材料表)。
2. 从"文件"菜单中选择"设置输入路径"。选择包含感兴趣数据文件的文件夹。
3. 从"文件"菜单中选择"设置输出路径"。选择要保存转换文件的文件夹。
4. 突出显示感兴趣的 MWD 文件。
5. 单击"导出到 HDF5"按钮。

8. 数据分割和分析(图8-10)

注:基于 Matlab 的自定义软件用于分段和提取各种 FP 和 AP 数据参数。可按需提供软件。

1. 使用 Matlab 运行波形分析代码(有关 GUI 主窗口的视图,请参见图8)。
2. 单击"文件"并选择"处理 .h5"。
3. 查找并选择根据上述步骤 7 创建的 mwd.h5 文件。
4. 单击"保存目录"按钮可更改输出文件的存储位置。
5. 通过选择感兴趣的电极/井组合,然后单击"队列"按钮,创建信号处理队列。重复此步骤以追加要处理到队列中的更多电极/井组合。
6. 如果细胞使用药物治疗,直接单击"医疗名称/药物浓度"来编辑队列(图8)。
7. 一旦队列是最终的,单击初始化波形按钮。这将启动初步处理,其中信号被识别和提取进行分割。
8. 单击"放大"按钮,然后使用光标选择可能感兴趣的操作区域(图 9)。
9. 单击"保留"按钮并查看面板。每个波形都检测到峰值(红色"x")和槽(黄色圆圈),并叠加规范化的动作电位。单击"保留"按钮,然后转到队列中的下一个跟踪 (图 10)。
10. 对队列中其余电极/井组合信号重复步骤 8.8-8.9。
    注:将生成一个 .csv文件,其中测量每个波形的 APD 参数。还会为每个.h5文件保存一个.mat文件,以便对分段数据进行其他处理。

解冻后hiPSC-CM的可行性和电镀密度对于多井MEA培养至关重要。将1-200万 hiPSC-CMs/vial预镀到具有50%或更高生存能力的6孔组织培养板的两口井中,将产生健康的单层培养物,在48 h时自发跳动。非肌细胞种群。这些单层在分离为多井MEA电镀时,通常会产生不一致的结果和质量信号,因此应丢弃。图 1显示了电镀后 48 h 时最佳与次优的 hiPSC-CM 培养示例。在基板涂层组织培养板上解冻CM,而不是直接在多孔MEA上解冻,允许细胞恢复和成熟3。不建议在阵列上直接电镀冷冻的 CM,因为它会产生不一致的结果。

除了分离的CM的质量外,多孔MEA上的细胞附件也高度依赖于细胞密度和纤维素涂层技术。纤维素滴的大小至关重要,因为 CM 符合纤维素涂层区域的边界。因此,只有5 μL的纤维细胞溶液直接在电极阵列区域上分配。为确保水滴不会分散,在涂布时,井面必须完全干燥。图 2显示了多孔 MEA 板的布局,该板具有分步预处理的示意图,以实现最佳制备。此外,为了防止纤维性肌干燥,在不超过3小时的孵育期内,必须将多孔MEA板置于加湿室中(见步骤3.8)。一旦孵育期完成,在CM电镀之前从每口井中取出纤维化滴,然后进入下一个电镀。快速、仔细地分配 CM 是成功实现细胞连接的关键。

在分化后30天,hiPSC-CM培养物使用酶细胞分离方法分离多孔MEA电镀分离(参见步骤4)。CM 将在 3 小时后附着在纤维素涂层 MEA 表面,覆盖阵列的单层在 24 小时后电镀后可见(图 3)。在24-48 h处观察到单层的同步跳动,细胞滴分散会影响培养密度,甚至导致干燥和细胞死亡。直接在阵列上精确放置细胞至关重要,因此必须采用该技术以实现最佳电镀。电池粘附在参考电极上会阻碍电信号产生。有关最佳 CM 放置图像以及 24 小时后培养的图像,请参阅图3。

在多井 MEA 上培养的 CM 在电镀后 48 小时接受电气活动的质量检查。通常,FP信号振幅在大约4天3中从μV范围增加到mV。如果网络中 50% 的电极和 70% 的总网络不产生 FP 信号,则网络或区域性不理想,应丢弃。仅处理通过质量检查的区域性以进行 FP 和 AP 分析。图 6显示了良好和低于标准的 FP 信号的示例。

电穿孔介导的AP录音可以从MEA电镀后48小时培养物中多次获得。利用电穿孔,我们从多个hiPSC衍生的心肌细胞网络中获得了细胞内访问记录的高分辨率AP。为 30 秒提供低压脉冲(1 V、1 ms、1 Hz),用于将 FP 瞬态、可逆转换转换为 AP。电穿孔允许在大约 75% 的电极中成功进行细胞内访问,进行 AP 测量。电信号记录2分钟,包括30秒电前、电穿孔期间30秒和电穿孔后1分钟。对所有站点评估 10 s AP 波形 10 s 后电穿孔的列车,以便进行信号质量和分析。任何不符合纯 AP 信号的跟踪都会被丢弃。为了调查AP振幅是否与FP信号相关,我们电镀了所有288个站点,以同时记录波形。代表FP和AP信号从两个不同的电极从同一电池位点记录,如图11A所示。我们观察到从同一单元位点记录的FP振幅和电穿孔后AP振幅之间没有相关性。此外,在0、24、48、72和96小时处对同一电池位点进行多次电孔对AP形状没有显著影响(图11B)。

鉴于系统的高通量特性,提取和量化感兴趣的参数(如 RR 间隔、瞬时频率和差分作用电位持续时间)的手动技术既低效又耗时。研究界可应要求提供定制的 MATLAB 脚本,以 1 μs 的分辨率执行波形测量。电穿孔时间点与提取信号叠加,以识别 10 s 的 AP 电穿孔后,以进行信号提取、质量保证和分段工作流(图8,图 9,图10. 用户界面允许使用覆盖电穿孔指示器作为指南选择所需的段。分段波形由子例程处理,以进一步识别单个 AP 波形。这通过峰值检测完成,每个周期都确定最高电压和最低电压。此过程完成后,振幅将规范化,关联时间矢量将偏移以定义峰值为 1 的时间零。沿各个周期的交点插值用于确定 APD 测量值。因此,AP 波形分割的部分自动化工作流允许在短时间内对跨多个培养体的各种 APD 参数进行高效的数据分析。为进一步自动化FP和AP的纳入和排除标准,正在进行实时数据分析。

多孔MEA板的一个显著优点是它可以重复使用多次。这种修复使重复的电生理学研究,成本效益高,数据收集一致。图12显示了6次恢复后同一阵列的AP记录。多个重用中,信噪比相似。为了证明重复电生理学研究阵列的可靠性,从三个恢复批次中总共汇集了 3815 个 AP 波形,并提取了 AP 持续时间数据,以检查结果的可重复性。显示单个波形 APD30、APD80、三角测量(APD80+APD30)和小数缩短((APD80+APD30)的分布图(图13)。

图1:冷冻保存的hiPSC-CM的预镀,用于成熟。(A) 细胞处理预电1小瓶10天分化后冷冻保存的hiPSC-CM. (B) 成功(左)和不成功(右)hiPSC培养的相对比图像。刻度条: 275 μm.有关差异后 14 天和 24 天的成功差异文化示例,请参阅视频 1和视频2。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:多孔MEA板的设置和制备。(A) 多孔 MEA 板示意图:该板由 24 口井(A1 到 D6)组成,每个井包含 12 个微电极阵列和 4 个外围参考电极。电极直径:30 μm /电极间距离:300μm。可同时从288个电极获得记录。(B) 在HIPSC-CM电镀之前进行灭菌和亲水处理步骤。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:多孔MEA板上的hiPSC-CM解散和电镀。(A) 每口井的 hiPSC-CM MEA 电镀步骤的原理图。(B) 显微图像,说明覆盖所有12个电极的正确细胞滴放置,而不扩散到4个参考电极。(C) 模称(左)和次优(右)hiPSC-CM在MEA上在24小时镀层后形成相对比的微观图像。刻度条 = 275 μm。有关成功的 MEA 电镀示例,请参阅视频3。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:多井屏幕采集软件。箭头指示文本中引用的关键特性和功能的位置:温度控制 (1) 面板允许在整个实验过程中实时监控温度。插入/弹出 (2) 按钮接合并释放多孔 MEA 板。定义实验流 (3) 功能允许用户设置录制的持续时间。数据采集设置 (4) 功能允许用户设置采样率和采集滤波器设置。请点击此处查看此图的较大版本。

图 5:hiPSC-CM电穿孔和信号采集.刺激定义选项卡允许用户定义电波脉冲参数。刺激电极选项卡允许用户选择电镀电极。可以选择 288 个电极的任意组合。请点击此处查看此图的较大版本。

图6:电气活动多井MEA的质量检查。多井-屏幕采集软件,显示原始数据窗口,具有最佳 (A) 和低于标准 (B) FP 信号的代表性示例.请点击此处查看此图的较大版本。

图 7:来自新和恢复的阵列的 FP 和 AP 信号。多井 MEA 酶清洁步骤 (A)新阵列的基线信号显示最小信噪比 (B) 和 FP 信号显示网络 (C) 的电气活动。请点击此处查看此图的较大版本。

图8:数据分割和分析。波形分析的GUI主窗口视图。请点击此处查看此图的较大版本。

图9:数据分割和分析。初始化波形按钮,用于识别和提取 AP 波形进行分割,并通过放大和选择感兴趣的操作潜在区域开始初步处理。红色圆圈是电穿孔指示器。请点击此处查看此图的较大版本。

图10:数据分割和分析。每个波形检测峰值(红色'x')和槽(黄色圆圈),并叠加标准化AP,以对波形进行质量检查。请点击此处查看此图的较大版本。

图 11:来自同一单元站点的多个录像的 AP 振幅依赖 FP 信号。从两个独立电极记录的μV 范围 (A、 左上面板) 或 mV 范围 (A, 右上面板) 中的 FP 振幅产生 mV 范围的 AP 振幅(A、左下角和右面板),显示 FP 振幅与电穿孔后 AP 振幅。每个录制的规范化 AP 波形叠加,如每个录制所示。在0至96小时时,同一电池位点的多次电波产生高质量的AP波形,可以跟踪膜电动力学(B)。请点击此处查看此图的较大版本。

图 12:六次还原后的 AP 录制。同时记录的 AP 波形,从同一孔的 12 个电极上同时记录 10 s 电穿孔后。请点击此处查看此图的较大版本。

图 13:来自多个还原的 APD 参数直方图。单个波形 APD30 (A)、 APD80 (B)、 三角测量 (APD80+ APD30) 和分数缩短 ((APD80+ APD30) /(APD80)的分布图(D) 显示.请点击此处查看此图的较大版本。

补充文件。视频 1-3。请点击此处下载此文件。

作者没有什么可透露的。