一种基于小鼠细胞系的慢性CDK9抑制模型，用于研究癌症中广泛存在的非遗传性转录延伸缺陷（TEdeff）

摘要

本方案详细描述了一种非遗传性转录延伸缺陷的小鼠癌变体外模型。在此模型中，通过持续抑制CDK9来阻抑RNA聚合酶II在促炎反应基因上的有效延伸过程，从而模拟并研究临床上观察到的TE^deff现象，该现象存在于约20%的人类癌症类型中。

摘要

我们先前报道过，一部分癌症的特征是全局性转录失调，并伴有广泛的mRNA转录延伸（TE）缺陷——我们将此类癌症称为TE^deff值得注意的是，TE^deff 癌症的特征在于大量基因（如干扰素/JAK/STAT 和 TNF/NF-κB 信号通路相关基因）中出现异常转录和错误的 mRNA 加工，从而导致这些通路受到抑制。TE^deff 肾细胞癌和转移性黑色素瘤患者中肿瘤的亚型与免疫治疗的不良反应和预后显著相关_. 鉴于研究转座元件（TE）的重要性^deff 癌症——因其预示着免疫治疗面临重大障碍——本方案的目标是建立一种体外TE^deff 小鼠模型用于研究这些普遍存在的非遗传性转录异常在癌症中的作用，以获得新的见解、现有药物的新用途，或针对此类癌症找到新的治疗策略。我们详细描述了通过长期使用flavopiridol介导的CDK9抑制，阻断RNA聚合酶II（RNA Pol II）羧基末端重复结构域（CTD）上丝氨酸2残基的磷酸化，从而抑制RNA Pol II进入有效的转录延伸阶段。鉴于转录延伸（TE）^deff 癌症并未根据特定的体细胞突变进行分类，因此采用药理学模型具有优势，能够最好地模拟在这些癌症中广泛存在的转录和表观遗传缺陷。使用优化的亚致死剂量的flavopiridol是目前唯一有效的策略，可建立一种可推广的非遗传性广泛转录延伸及mRNA加工缺陷模型，紧密模拟临床观察到的转录延伸（TE）缺陷^deff 特征。因此，该TE模型^deff 可用于解析使细胞自主抵抗免疫介导攻击的内在因素。

引言

几乎所有活性基因表达中的一个关键限速步骤是RNA聚合酶II（RNA Pol II）从启动子近端暂停转变为 productive 延伸^1,2。鉴于转录延伸的表观遗传失调在多种被定义为TE^deff的人类恶性肿瘤进展中起促进作用，导致促炎反应通路信号传导不足，从而对免疫治疗产生较差的响应和不良预后³，本方案的总体目标是建立一种有用的体外模型，用于研究癌症中广泛存在的非遗传性转录异常。基于此，长期药理学抑制CDK9是一种有效的策略，可用于构建具有普适性的非遗传性广泛转录延伸障碍及mRNA加工缺陷模型。采用长期CDK9抑制的理论依据在于，其可阻断RNA Pol II羧基末端重复结构域（CTD）上丝氨酸2位点的磷酸化，从而抑制RNA Pol II进入 productive 转录延伸阶段。此外，我们课题组先前描述的TE^deff癌症³并未归类于任何特定的体细胞突变类型。因此，非遗传性（药理学）模型具有优势，能够最佳模拟这些癌症中观察到的广泛转录和表观遗传缺陷。本文详细阐述了小鼠癌细胞长期氟哌啶醇处理模型的建立与表征方法。该方法可显著干扰基因组长度较长、启动子处于待命状态且具有可诱导表达特征（如TNF/NF-κB和干扰素/STAT信号通路）的基因的转录延伸过程，而这些通路的调控主要发生在转录延伸....

方案

辛辛那提儿童研究基金会的机构动物护理和使用委员会以及机构生物安全委员会已批准所有动物实验程序（IACUC方案编号#2017-0061和IBC方案编号#IBC2016-0016），这些实验均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》中所述标准进行。

1. 通过flavopiridol处理对RNA聚合酶II进行慢性抑制——基本策略

1. 在10 cm培养皿中，用相应的培养基（Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]、10%胎牛血清[FBS]、1%青霉素-链霉素[Pen/Strep]），以低密度（0.2 × 10⁶）接种B16/F10小鼠黑色素瘤细胞，并在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中过夜培养。
2. 次日，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入含亚致死剂量（估计为25 nM）flavopiridol的新鲜培养基——该药物为RNA聚合酶II延伸因子p-TEFb（cyclin T/CDK9）的抑制剂——持续处理一周，期间不再进行传代培养。
3. 经一周flavopiridol处理后，进行验证性检测，以评估该模型是否能够重现TE^deff癌症中所见的多种转录延伸缺陷特征。

2. 确认性免疫印迹实验，用于评估所构建的小鼠TE^deff模....

结果

在此，我们提供一个详细的方案（图1以建立一种组织工程（TE）方法^deff 由慢性亚致死剂量诱导获得的细胞模型（图2) 使用25 nM的flavopiridol处理。在 图3，经三天黄酮吡咯（flavopiridol）处理后，B16 OVA 细胞表现出部分 TE 特征^deff 但在治疗一周后，B16/F10 OVA细胞显示出RNA聚合酶II羧基末端结构域（CTD）丝氨酸2位点磷酸化水平显著降低，同时H3K36me3也明显减少——H3K36me3是一种参与界定外显子边界的组蛋白修饰，可抑制失控的隐匿性转录。因此，TE^deff 细胞模型显示出关键的mRNA加工缺陷，表现为异常加帽和非多聚腺苷酸化mRNA的比例显著升高（图4A，B）。此外，还观察.......

讨论

RNA Pol II 延伸调控已成为调节刺激响应性基因表达的关键机制，从而有利于恶性细胞的生存^5,7,8。从启动子近端暂停状态进入延伸阶段并实现后续的 mRNA 生成，依赖于 P-TEFb 的激酶活性^9,10,11。本模型采用黄酮吡咯（flavopiridol，25 nM）——一种对关键的周期蛋白依赖性激酶 CDK9 具有抑制作用的化合物——来模拟 TE^deff 癌症中 Pol II 延伸过程中所观察到的缺陷；该表型此前由本研究团队首次发现³。

CDK9激酶活性长期以来被认为对Pol II大亚基CTD上丝氨酸2位点的磷酸化至关重要。关键的是，我.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
hhis6FasL	Cell Signaling	5452
10X TBS	Bio-Rad	170-6435
12 孔板	Falcon	353043
20% 甲醇	Fisher Chemical	A412-4
24 孔板	Falcon	351147
4–18% SDS 聚丙烯酰胺凝胶	Bio-Rad	4561086
4% 多聚甲醛	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
5% 脱脂奶粉	Bio-Rad	170-6404
7-甲基鸟苷抗体	BioVision	6655-30T
96 孔板	Cellstar	655180
AF647 标记的小鼠 CD8	Biolegend	100727
抗生素和抗真菌剂	Gibco	15240-062
抗 His 抗体	Cell Signaling	2366 P
抗兔	Cell Signaling	7074	稀释比例 1:5000
抗大鼠	Cell Signaling	7077S	稀释比例 1:5000
Bradford 蛋白定量试剂盒	Bio-Rad	5000121
BSA	ACROS Organics	24040-0100
BV421 标记的小鼠 CD45	Biolegend	109831
结晶紫	Sigma	C3886-100G
DMEM	Gibco	11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25	Ambion	61002
FBS	Gibco	45015
可固定的活/死细胞染色染料 e780	eBioscience	65-0865-14
黄酮吡咯	Selleckchem	S1230
H3k36me3	Abcam	ab9050	稀释比例 1:2000
IFN-α	R&D systems	12100-1
IFN-γ	R&D systems	485-MI-100
IMDM	Gibco	12440053
Immobilon Western 化学发光 HRP 底物	Millipore	WBKLS0500
MojoSort 小鼠 CD8 T 细胞分离试剂盒	Biolegend	480007
NF-κB	Cell Signaling	8242s	稀释比例 1:1000
PBS	Gibco	14190-144
p-NF-κB	Cell Signaling	3033s	稀释比例 1:1000
p-Ser2-RNAPII	Active Motif	61083	稀释比例 1:500
p-Ser5-RNAPII	Active Motif	61085	稀释比例 1:1000
p-STAT1	Cell Signaling	7649s	稀释比例 1:1000
RiboMinu 真核生物试剂盒	Ambion	A10837-08
RIPA 裂解缓冲液	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948
RNAPII	Active Motif	61667	稀释比例 1:1000
STAT1	Cell Signaling	9175s	稀释比例 1:1000
TNF-α	R&D systems	410-MT-010
总 H3	Cell Signaling	4499	稀释比例 1:2000
Trizol 试剂	Sigma	T9424
吐温	Sigma	T8787-50ML
Tween 20	AA Hoefer	9005-64-5
β-肌动蛋白	Cell Signaling	12620S	稀释比例 1:5000
β-巯基乙醇	G Biosciences	BC98