通过串联RNA免疫沉淀测序（RIPiT-Seq）鉴定RNA:蛋白质复合物的足迹

摘要

本文介绍一种从哺乳动物细胞中富集内源性RNA结合位点或RNA:蛋白质（RNP）复合物的"足迹”的实验方案。该方法包括对RNP亚基进行两次免疫沉淀，因此被称为串联RNA免疫沉淀（RIPiT）。

摘要

串联RNA免疫沉淀（RIPiT）是一种用于富集RNA:蛋白质（RNP）复合物中一对蛋白质的RNA足迹的方法。RIPiT包含两个纯化步骤：首先，对带有标签的RNP亚基进行免疫沉淀，随后进行温和的RNase消化和非变性亲和洗脱；接着对另一个RNP亚基进行第二次免疫沉淀，从而实现对特定复合物的富集。在对RNA和蛋白质进行变性洗脱后，将RNA足迹转化为高通量DNA测序文库。与更常用的紫外线（UV）交联后免疫沉淀（CLIP）技术富集RNA结合蛋白（RBP）结合位点的方法不同，RIPiT不依赖于UV交联。因此，RIPiT可应用于RNA互作组中大量不直接接触RNA或难以与RNA发生UV交联，但对RNA调控至关重要的蛋白质。RIPiT的两个纯化步骤还具有额外优势，即能够鉴定目标蛋白与另一个共因子协同作用时的结合位点。双重纯化策略也有助于通过降低背景信号来增强检测信号。本文提供了执行RIPiT实验并从分离的RNA足迹生成高通量测序文库的逐步操作流程，同时概述了RIPiT的优势与应用，并讨论了其部分局限性。

引言

在细胞内，RNA 与蛋白质形成复杂的结合，构成 RNA:蛋白质复合物（RNPs）。RNPs 以 RNA 结合蛋白（RBPs，即直接结合 RNA 的蛋白质）为核心进行组装，但也包含非 RBPs（即结合 RBPs 而不直接结合 RNA 的蛋白质），且通常具有动态特性。RBPs 及其辅助因子在 RNPs 内协同发挥作用，执行调控功能。例如，在无义介导的 mRNA 降解（NMD）通路中，UPF 蛋白（UPF1、UPF2 和 UPF3b）可识别提前终止的核糖体。每个 UPF 蛋白均能结合 RNA，但只有当它们共同组装时，才开始形成具有活性的 NMD 复合物。在此复合物中，非 RBP 的 SMG1 通过磷酸化进一步激活 UPF1，而 UPF1 的激活最终导致 mRNA 降解诱导因子的募集^1,2。在此例中，RBPs 需要非 RBP 辅助因子的参与，以实现触发 NMD 的 RNP 复合物的募集与激活。RNPs 的另一特性是其组成上的异质性。以剪接体为例，其可存在于不同的 E、A、B 或 C 复合物形式中。不同的剪接体复合物含有部分重叠但又各具特征的蛋白质组分³。为了研究 RNPs 的功能，阐明某种 RBP 及其相关蛋白所结合的 RNA 至关重要。目前已有多种方法可用于实现这一目标，每种方法均有其独特的优势与局限性^4,

方案

1. 建立稳定表达四环素诱导型FLAG标签目的蛋白（POI）的HEK293细胞系

1. 在6孔板中，以10 × 10⁴ 个细胞/mL的密度，将携带稳定整合的Flp重组靶点（FRT位点）的HEK293细胞接种于生长培养基（DMEM培养基[DMEM] + 10%胎牛血清[FBS] + 1%青霉素-链霉素[penn/strep]）中。将细胞置于37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中过夜培养（后续所有步骤均采用此标准培养条件）。
2. 次日，细胞融合度应达到约70%。根据转染试剂的操作说明，以9:1的比例将pcDNA5-TETO-FLAG-POI与pOG44共转染至含FRT位点的HEK293细胞中。
   注意： FLAG标签的序列为DYKDDDDK（D = 天冬氨酸，Y = 酪氨酸，K = 赖氨酸）。
3. 转染24小时后，开始进行抗生素筛选。吸除培养基，加入含100 μg/mL潮霉素的新鲜生长培养基。72小时内，未转染的细胞应开始死亡。
4. 每48–72小时更换一次培养基，并补充新鲜潮霉素。
5. 经过约2周的筛选后，将出现稳定的转染细胞克隆。当克隆肉眼可见时，向培养板中加入1 mL胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。用DMEM重悬细胞，转移至新的10 cm培养皿中，并用含100 μg/mL潮霉素的新鲜生长培养基定容至10 mL。培养至细胞融合度约80%，以进一步扩增细胞，制....

结果

一次成功的 RIPiT 实验将富集到目标蛋白以及其他已知的相互作用蛋白，而不会富集非相互作用蛋白。如图3A所示，在 RIPiT 洗脱液中检测到了 Magoh 和 EIF4AIII，但未检测到 HNRNPA1（第6泳道）。同时，通过放射自显影（图3B）或生物分析仪（图3C）检测与 RNP 复合物共纯化的 RNA 足迹。预期嘌呤霉素处理会增加 EJC 在 RNA 上的占据率，在嘌呤霉素处理的 RIPiT 样品中观察到更强的 RNA 足迹信号（图3B，比较第2和第3泳道）。为进行深度测序而制备样品时，需将接头连接至 RNA，然后使用与接头序列互补的引物将 RNA 逆转录为 DNA。在逆转录步骤中加入生物素标记的核苷酸，以便纯化逆转录产物。逆转录完成后，必须通过尿素-聚丙烯酰.......

讨论

本文讨论了成功进行RIPiT实验的一些关键考虑因素。首先，必须对每个免疫沉淀（IP）步骤进行优化，以在每一步骤中实现尽可能高的效率。对于本文所述的细胞输入量，所使用的FLAG琼脂糖微珠的量已在我们测试的多种蛋白质中被证明具有良好的稳健性。由于只有少量的相互作用蛋白能够与FLAG蛋白共免疫沉淀，因此第二次免疫沉淀所需的抗体用量通常较低（少于10 µg）。在放大实验规模之前，从小规模RIPiT实验（来自一个10 cm培养皿）出发，并在两次免疫沉淀过程中通过蛋白质印迹法检测各组分中的目标蛋白，对于评估实验的效率和特异性极为有用。在最终洗脱组分中，应能检测到目标蛋白以及复合物中任何其他预期的相互作用蛋白。同时，检测耗竭裂解液（即未结合到FLAG-琼脂糖或磁珠上的组分）中的蛋白也有助于准确评估免疫沉淀的效率以及形成复合物的蛋白比例。此外，该分析还可判断RNase消化条件是否充分，以区分核糖核蛋白（RNP）中的RNA依赖性相互作用与非RNA依赖性相互作用。因此，设置阴性对照同样至关重要，理想情况下应选择一个与目标RNP无关的RNA结合蛋白（RBP）作为对照。例如，在图3A<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Anti-FLAG 亲和凝胶	Sigma	A2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCi	PerkinElmer	BLU502A250UC
BD 一次性带鲁尔锁扣针头注射器（200 支）	Fisher	14-823-435
甜菜碱 5M	Sigma	B0300
生物素-dATP	TriLink	N-5002
生物素-dCTP	Perkin Elmer	NEL540001EA
Branson 超声破碎仪，型号 SSE-1	Branson
CircLigase I	VWR	76081-606	单链 DNA 连接酶 I
DMEM，高糖	ThermoFisher	11995-065
NEB DNA 上样缓冲液	NEB
Dynabeads Protein A 磁珠	LifeTech	10002D
Flp-In-T-REx 293 细胞系	ThermoFisher	R78007
GeneRuler 低分子量 DNA Marker	ThermoScientific	FERSM1203
潮霉素 B	ThermoFisher	10687010
Mini-PROTEAN TBE 凝胶（10 孔）	Bio-Rad	4565013
Mini-PROTEAN TBE-尿素凝胶	Bio-Rad	4566033
miRCAT-33 接头 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
Mirus transIT-X2 转染试剂	Mirus	MIR 6004
Mth RNA 连接酶	NEB	E2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，pH 6.7，100 mL）	Fisher	BP1752I-100
紫色凝胶上样染料（6×）	NEB	NEB #7025
Q5 DNA 聚合酶	NEB	M0491S/L
核糖核酸酶 I，E. coli，1,000 U	Eppicenter	N6901K
SPIN-X 柱	Corning	CLS8160-24EA
链霉亲和素磁珠	ThermoFisher	60210
Superscript III（SSIII）	ThermoScientific	18080044	逆转录酶
SybrGold	ThermoFisher	S11494	金黄色核酸凝胶染料
T4 多核苷酸激酶-2500U	NEB	M0201L
T4RNL2 Tr. K227Q	NEB	M0351S
四环素	Sigma	87128
耐热 5´ App DNA/RNA 连接酶	NEB	M0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′	Any		本方案仅适用于 Illumina 测序平台
Typhoon 5 生物分子成像仪	GE Healthcare Life Science	29187191