本文介绍一种从哺乳动物细胞中富集内源性RNA结合位点或RNA:蛋白质（RNP）复合物的"足迹”的实验方案。该方法包括对RNP亚基进行两次免疫沉淀，因此被称为串联RNA免疫沉淀（RIPiT）。
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摘要
摘要
串联RNA免疫沉淀（RIPiT）是一种用于富集RNA:蛋白质（RNP）复合物中一对蛋白质的RNA足迹的方法。RIPiT包含两个纯化步骤：首先，对带有标签的RNP亚基进行免疫沉淀，随后进行温和的RNase消化和非变性亲和洗脱；接着对另一个RNP亚基进行第二次免疫沉淀，从而实现对特定复合物的富集。在对RNA和蛋白质进行变性洗脱后，将RNA足迹转化为高通量DNA测序文库。与更常用的紫外线（UV）交联后免疫沉淀（CLIP）技术富集RNA结合蛋白（RBP）结合位点的方法不同，RIPiT不依赖于UV交联。因此，RIPiT可应用于RNA互作组中大量不直接接触RNA或难以与RNA发生UV交联，但对RNA调控至关重要的蛋白质。RIPiT的两个纯化步骤还具有额外优势，即能够鉴定目标蛋白与另一个共因子协同作用时的结合位点。双重纯化策略也有助于通过降低背景信号来增强检测信号。本文提供了执行RIPiT实验并从分离的RNA足迹生成高通量测序文库的逐步操作流程，同时概述了RIPiT的优势与应用，并讨论了其部分局限性。
引言
在细胞内，RNA 与蛋白质形成复杂的结合，构成 RNA:蛋白质复合物（RNPs）。RNPs 以 RNA 结合蛋白（RBPs，即直接结合 RNA 的蛋白质）为核心进行组装，但也包含非 RBPs（即结合 RBPs 而不直接结合 RNA 的蛋白质），且通常具有动态特性。RBPs 及其辅助因子在 RNPs 内协同发挥作用，执行调控功能。例如，在无义介导的 mRNA 降解（NMD）通路中，UPF 蛋白（UPF1、UPF2 和 UPF3b）可识别提前终止的核糖体。每个 UPF 蛋白均能结合 RNA，但只有当它们共同组装时，才开始形成具有活性的 NMD 复合物。在此复合物中，非 RBP 的 SMG1 通过磷酸化进一步激活 UPF1，而 UPF1 的激活最终导致 mRNA 降解诱导因子的募集1,2。在此例中，RBPs 需要非 RBP 辅助因子的参与，以实现触发 NMD 的 RNP 复合物的募集与激活。RNPs 的另一特性是其组成上的异质性。以剪接体为例，其可存在于不同的 E、A、B 或 C 复合物形式中。不同的剪接体复合物含有部分重叠但又各具特征的蛋白质组分3。为了研究 RNPs 的功能，阐明某种 RBP 及其相关蛋白所结合的 RNA 至关重要。目前已有多种方法可用于实现这一目标，每种方法均有其独特的优势与局限性4,5,6,7。
目前广泛使用的方法是通过交联后免疫沉淀（CLIP）及其多种变体来鉴定RBP结合位点—— 该方法依赖于紫外光（UV）将RBP与RNA交联8。然而，这种方法对于核糖核蛋白复合物（RNP）中不直接接触RNA的非RBP蛋白并不有效。本文中，我们描述了一种适用于RBP和非RBP的替代方法，可用于分离并鉴定其RNA结合位点。该方法称为串联RNA免疫沉淀（RIPiT），包含两个免疫沉淀步骤，与单次纯化相比，可实现更高的特异性（图1）9,10。由于各个免疫沉淀（IP）步骤可在比CLIP更低的严格条件下进行，RIPiT不依赖于能够在免疫沉淀过程中耐受强去污剂存在的抗体。RIPiT最独特的优势在于可在两个纯化步骤中靶向两种不同的蛋白质；这为从其他相似复合物中富集出组成上独特的RNP复合物提供了有力手段11。
对RIPiT实验流程进行微小调整可进一步提高核糖核蛋白（RNP）的富集效果。例如，某些RNP内的RNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用是瞬时的，因此可能难以有效纯化此类复合物的足迹。为稳定这些相互作用，可在细胞裂解和RIPiT操作之前，使用甲醛对细胞内的RNP进行交联。例如，我们观察到，外显子连接复合体（EJC）核心因子EIF4AIII与EJC解聚因子PYM12 之间的弱相互作用可通过甲醛处理得以稳定，从而富集到更多的RNA足迹（数据未显示）。在收集细胞并进行RIPiT之前，还可使用药物处理细胞，以稳定或富集处于特定状态的RNP。例如，在研究在翻译过程中从mRNA上解离的蛋白质时（如EJC13、UPF114），使用嘌呤霉素、环己酰亚胺或哈灵顿宁等翻译抑制剂处理，可增加蛋白质在RNA上的占据程度。
从RIPiT中回收的RNA量通常较低（0.5–10 pmol，即假设RNA平均长度为75 nt时，相当于10–250 ng RNA）。其主要原因是，特定蛋白中仅有很小一部分以核糖核蛋白复合物（RNP）形式与其他蛋白结合存在（第一步免疫沉淀中捕获的任何"游离”蛋白在第二步免疫沉淀过程中都会丢失）。为了利用如此微量的RNA构建RNA-Seq文库，本文还概述了一种适用于低RNA投入量的、基于先前发表方案的改进方法15,16 （图2），可在3天内获得适用于高通量测序的样品。
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方案
1. 建立稳定表达四环素诱导型FLAG标签目的蛋白（POI）的HEK293细胞系
- 在6孔板中，以10 × 104 个细胞/mL的密度，将携带稳定整合的Flp重组靶点（FRT位点）的HEK293细胞接种于生长培养基（DMEM培养基[DMEM] + 10%胎牛血清[FBS] + 1%青霉素-链霉素[penn/strep]）中。将细胞置于37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中过夜培养（后续所有步骤均采用此标准培养条件）。
- 次日，细胞融合度应达到约70%。根据转染试剂的操作说明，以9:1的比例将pcDNA5-TETO-FLAG-POI与pOG44共转染至含FRT位点的HEK293细胞中。
注意： FLAG标签的序列为DYKDDDDK（D = 天冬氨酸，Y = 酪氨酸，K = 赖氨酸）。 - 转染24小时后，开始进行抗生素筛选。吸除培养基，加入含100 μg/mL潮霉素的新鲜生长培养基。72小时内，未转染的细胞应开始死亡。
- 每48–72小时更换一次培养基，并补充新鲜潮霉素。
- 经过约2周的筛选后，将出现稳定的转染细胞克隆。当克隆肉眼可见时，向培养板中加入1 mL胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。用DMEM重悬细胞，转移至新的10 cm培养皿中，并用含100 μg/mL潮霉素的新鲜生长培养基定容至10 mL。培养至细胞融合度约80%，以进一步扩增细胞，制备永久性细胞库。
- 确定实验所需四环素（Tet）的最佳浓度，以获得FLAG-POI的最适表达水平。将细胞以12孔板形式培养，在0–1,000 ng/mL范围内对四环素进行梯度稀释，诱导16–24小时。使用针对目标蛋白（POI）的抗体对梯度诱导样品进行Western blot分析。
注意： 对于分子量约60 kDa以下的蛋白，可在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上分辨出FLAG标记蛋白与其内源性蛋白，从而比较FLAG-POI与内源蛋白的表达水平。对于较大分子量的蛋白，可通过比较四环素诱导组与未诱导组的信号强度进行分析。四环素储存液可配制成1 mg/mL溶于100%乙醇中。用于细胞培养的稀释液应使用无菌水或磷酸盐缓冲液（PBS）。四环素储存液应每月新鲜配制一次。
2. 四环素诱导和RIPiT实验流程的细胞培养
- 在15 cm培养皿中，以3 × 105 个细胞/mL的密度将稳定整合FLAG-POI的HEK293细胞接种于生长培养基中。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。
注意：通常情况下，三至五个15 cm培养皿可获得约2–20 pmol的RNA足迹，具体产量取决于目标RNP的丰度。若RNP需进行甲醛交联并在严格条件下纯化，则可能需要两倍的起始材料。 - 在收获细胞前16–24小时，向培养基中加入四环素至预先确定的最佳浓度，以诱导FLAG-POI的表达（参见步骤1.6）。
注意：无需更换生长培养基。细胞通常在接种后约72小时或培养皿汇合度达约80%时即可收获。应避免细胞过度生长至完全汇合。
3. 细胞收获、甲醛处理和细胞裂解
- 用预冷的 PBS 轻柔洗涤每个 15 cm 培养皿中的单层细胞，每次 15 mL。然后用 30 mL PBS 将细胞刮下。如果在收集细胞前对细胞进行了药物处理，则在 PBS 中添加相应药物。将所有细胞收集至 50 mL 圆底离心管中。
注意：为保留弱相互作用，可用甲醛对细胞进行交联：向步骤 3.1 得到的细胞悬液中加入甲醛，使其终浓度为 0.1%，室温下在摇床上孵育 10 分钟。加入 3 mL 猝灭缓冲液（表 1），再继续摇动 5 分钟。 - 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 10 分钟沉淀细胞，弃去上清液。
- 用 4 mL 冰冷的低渗裂解缓冲液（HLB；表 1）裂解细胞。使用 P1000 移液器重悬细胞。转移至 5 mL 离心管中，在冰上孵育 10 分钟。
- 将裂解液置于冰浴中，以 10% 振幅进行超声处理，脉冲 1 秒，间隔 2 秒，持续 30 秒。然后通过加入 108 μL 的 5 M NaCl 将盐浓度调整至 150 mM。
注意：甲醛交联样品可在裂解缓冲液中加入 0.1% SDS 和 0.1% 脱氧胆酸钠，以实现更严格的裂解和纯化。 - 在 4 °C 条件下，以 21,000 × g 离心 10 分钟澄清裂解液。取 20 μL 上清液（细胞提取物）置于标记好的离心管中，用于输入样品中蛋白水平的 Western 印迹分析（见 图 3A）。
注意：在裂解液离心过程中，可同时洗涤 FLAG 琼脂糖珠（见步骤 4.1）。FLAG 琼脂糖珠应预先用 4 mL 冰冷的等渗洗涤缓冲液（IsoWB，表 1）洗涤 3 次。
4. FLAG 免疫沉淀
- 将步骤 3.5 中剩余的上清液加入到一个 5 mL 离心管中的 750 μL 预先洗涤的 FLAG 琼脂糖微珠中（洗涤后的 FLAG 琼脂糖微珠床体积为 375 μL）。在 4 °C 下轻轻混匀孵育 1–3 小时。
注意： 此体积的 FLAG 琼脂糖微珠适用于多种蛋白质，但可根据需要进行优化。 - 在 4 °C 下以 400 × g 离心 1 分钟，使 FLAG 琼脂糖微珠沉淀。取 20 μL 上清液转移至已标记的离心管中，用于检测耗竭后细胞提取物中蛋白质水平的 Western 印迹分析（见 图 3A）。弃去其余上清液。
- 用 4 mL IsoWB 缓冲液重悬 FLAG 琼脂糖微珠以进行洗涤。在 4 °C 下以 400 × g 离心 1 分钟使微珠沉淀，小心移除上清液。重复此洗涤步骤 4 次。
注意： 对于甲醛交联免疫沉淀物的严格洗涤，可在前两次洗涤缓冲液中分别加入 0.1% 的 SDS 和脱氧胆酸钠。
5. RNase I 消化
- 将RNase I用750 μL IsoWB稀释至0.002–0.01 单位/毫升（所需足印大小对应的合适浓度需通过实验确定）。将IsoWB-RNase I加入洗涤后的FLAG琼脂糖珠中，于4 °C轻轻混匀孵育10分钟。
- 在4 °C下以400 × g离心1分钟收集珠子。取20 μL上清液（RNase I洗脱液）置于标记好的离心管中，用于Western blot分析。弃去IsoWB-RNase I，并按照步骤4.3所述方法用IsoWB洗涤FLAG琼脂糖珠4次。
6. 亲和洗脱
- 配制洗脱缓冲液（将FLAG肽以250 ng/mL的浓度溶于IsoWB中）。取375 μL洗脱缓冲液加入FLAG琼脂糖珠中，于4 °C轻轻振荡孵育1–2小时。离心收集FLAG琼脂糖珠，并取15 μL洗脱液用于FLAG免疫沉淀中蛋白质的Western blot检测（见图3A）。
注意：在进行亲和洗脱的同时，可开展第7部分操作。
7. 磁珠-抗体偶联
- 在1.5 mL离心管中，用1 mL IsoWB缓冲液将50 μL磁珠（例如Dynabeads；材料表）洗涤3次。将磁珠重悬于100 μL偶联缓冲液中。加入适量抗体（免疫沉淀所用抗体的确切用量需根据每种抗体的经验确定）。
注意：对于兔来源的抗体，蛋白A磁珠效果最佳；而对于小鼠来源的抗体，蛋白G磁珠更为合适。磁珠兼容性图表可在供应商网站查询，以选择适用于每种抗体的磁珠。 - 用偶联缓冲液洗涤磁珠2次（表1）。室温孵育混合物至少10分钟。将磁珠重悬于375 μL RIPiT稀释缓冲液中。置于冰上保存，直至进行下一步操作。
8. 第二次免疫沉淀
- 将步骤6.1中剩余的FLAG亲和洗脱液加入与目的蛋白特异性抗体偶联的磁珠中。4 °C下轻柔混匀孵育1–2小时。置于磁力架上捕获磁珠，并收集15 μL上清液，用于通过Western blot分析未结合的蛋白质。用1 mL IsoWB缓冲液洗涤磁珠7次。
9. 变性洗脱
- 向磁珠中加入 100 μL 清亮的样品缓冲液（表 1），使用 P200 移液器重悬。冰上孵育 10 分钟。定期轻轻振荡以重新悬浮磁珠。
- 将磁珠置于磁力架上捕获，收集 15 μL 洗脱液，用于通过 Western 印迹分析 RIPiT 洗脱液中的蛋白质（见 图 3A）。将剩余洗脱液转移至一个新的已标记的 1.5 mL 离心管中。
注意：如果样品经过甲醛交联，则必须在 65 °C 孵育 1 小时以逆转交联。 - 对在不同步骤收集的样品（输入样品、FLAG 免疫沉淀耗尽组分、FLAG 免疫沉淀组分、第二次免疫沉淀耗尽组分、第二次免疫沉淀洗脱液）进行 Western 印迹分析。使用针对两种诱饵蛋白的抗体、已知的其他互作蛋白抗体，以及至少一种非相互作用 RNA 结合蛋白（RBP）抗体作为阴性对照进行杂交检测（图 3A）。
10. RNA 提取与末端修复
- 向 RIPiT 洗脱液中加入 320 μL 无 RNase 的 ddH2O、400 μL 苯酚-氯仿-异戊醇（PCIAA，pH 4.5），涡旋振荡 30 秒，然后在室温下以 12,000 × g 离心 5 分钟。将 350 μL 水相转移至另一离心管中。加入 35 μL 3 M 醋酸钠、1 μL 1 M MgCl2、10 μg 糖原和 1 mL 100% 乙醇。在 -20 °C 下孵育过夜。
- 为沉淀 RNA，在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 30 分钟。用 70% 乙醇洗涤 RNA。
- 为去除 RNase I 切割后 RNA 3' 端残留的磷酸基团，将 RNA 沉淀重悬于 17 μL 无 RNase 的 ddH2O 中，加入 2 μL 10× T4 多核苷酸激酶（PNK）缓冲液（材料表）和 1 μL T4 PNK。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
注意： T4 PNK 的 3' 磷酸酶活性在 pH 6 时活性最佳17。PNK 反应缓冲液是为 T4 PNK 的 5' 激酶活性优化的，其 pH 为 7.6。尽管已有尝试调节末端修复反应的 pH 值，但该步骤仍可进一步优化。 - 向离心管中加入 380 μL 无 RNase 的 ddH2O 和 400 μL pH 4.5 的 PCIAA。涡旋振荡 30 秒，以 12,000 × g 离心 5 分钟。收集水相，加入 35 μL 3 M 醋酸钠、1 μL 1 M MgCl2、10 μg 糖原和 1 mL 100% 乙醇。
- 在 -20 °C 下孵育过夜。按上述方法离心沉淀并用 70% 乙醇洗涤 RNA。将 RNA 重悬于 4.5 μL 无 RNase 的水中。
11. RNA 足迹大小与丰度的估算
- 成功的RIPiT实验预期可获得1 pmol或更多的RNA片段。为定量实际产量，将0.7 μL的RIPiT RNA（约总产量的1/6）转移至新管中。加入2 μL 10x T4 PNK缓冲液、1 μL 1 mM ATP、40 μCi γ32P-ATP（0.5−1.0 μL原液）和1 μL T4 PNK。调整总体积至10 μL，并在37 °C孵育30分钟。
- 同时进行平行的PNK反应，标记低分子量DNA Ladder以及0.1 pmol的合成RNA或DNA寡核苷酸（20-40 nt），作为大小和数量的标准参照。
- 将标记的RNA/DNA在26%尿素-PAGE凝胶（20 × 27 × 0.45 mm3）上进行电泳分离。凝胶需在35 W功率下预电泳30分钟。在预电泳前及加样前冲洗加样孔，并在35 W下持续电泳，直至溴酚蓝染料前沿接近凝胶末端。
- 小心将凝胶从玻璃板上取下，置于一张8 × 11英寸的滤纸上。将凝胶面朝上放入凝胶干燥装置中，并覆盖一层塑料膜。在真空条件下80 °C干燥1小时。
- 将干燥后的凝胶置于磷屏成像仪中过夜曝光，或直至检测到足够信号。扫描磷屏图像。高质量的RIPiT来源RNA应在泳道中呈现弥散条带，且无明显主条带（图3B）。为定量RNA，将RIPiT泳道中目标大小RNA片段的信号强度与0.1 pmol标记合成寡核苷酸的信号进行比较。
注意：也可使用高灵敏度生物分析仪（bioanalyzer）验证RNA足迹的大小和含量（图3C）。
12. 接头连接
- 制备RIPiT RNA，使至少3 pmol的RNA溶解于3.8 μL水中。
- 在0.2 mL的聚合酶链式反应（PCR）管中，加入3.8 μL RNA和1 μL miR-CAT-33预腺苷化接头（7 μM）（材料表）。将混合物置于热循环仪中，65 °C孵育10分钟，16 °C孵育5分钟，然后保持在4 °C。
注意：预腺苷化接头可直接从寡核苷酸合成服务公司订购，也可使用Mth RNA连接酶（材料表）对任意合成服务公司提供的定制非腺苷化DNA寡核苷酸进行腺苷化修饰，并通过凝胶纯化。 - 向同一管中加入1.5 μL 10× T4 RNA连接酶缓冲液、7.5 μL 50%聚乙二醇8000（PEG-8000）、0.75 μL 20 mM二硫苏糖醇（DTT）和0.45 μL T4 RNL2 Tr. K227Q（材料表）。
注意：50% PEG-8000随RNA连接酶和缓冲液一同提供。PEG-8000溶液黏稠，应缓慢移液。 - 将反应体系在热循环仪中30 °C孵育6小时，随后在65 °C加热10分钟以灭活连接酶，然后保持在4 °C。
13. 逆转录
- 向步骤 12.4 的连接反应管中加入 11.25 μL 4x 脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合液（包含普通与生物素标记的 dNTP 混合物，见表 1）、1.0 μL 10 μM 的反转录引物（材料表）以及 6.8 μL 无 RNase 的水。在 65 °C 下孵育 5 分钟，随后置于 4 °C 保存。
- 将反应管转移至冰上，加入 9.0 μL 不含 MgCl2 的 5x 第一链（FS）缓冲液（表 1）、2.25 μL 100 mM DTT 和 1.2 μL 反转录酶（终体积为 45 μL，材料表）。
- 在热循环仪中于 55 °C 孵育 30–60 分钟。随后在 70 °C 加热 15 分钟以灭活反转录酶，并将样品保持在 4 °C。
14. RT 产物的纯化
- 向RT反应体系中加入45 μL的2×尿素上样缓冲液（表1）。将1 μg低分子量DNA Ladder稀释于45 μL中，并加入45 μL的2×尿素上样缓冲液。
- 制备10%尿素-PAGE凝胶（20 × 28 × 0.15 cm3；表1），使用8孔梳。用注射器或移液器将0.5×Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液冲洗加样孔。
注意： 上述自制凝胶在分离延伸的RT产物与未延伸的RT引物方面具有更好的分辨率。作为替代方案，也可使用预制的尿素-PAGE凝胶（材料表）。由于预制凝胶每孔最大上样体积较小，样品需分装至多个孔中。预制凝胶应以150−200 V电压运行。 - 以35 W预电泳30分钟。再次冲洗加样孔，上样后继续以35 W电泳，直至溴酚蓝染料前沿迁移至距凝胶末端约1英寸处。
注意： 预电泳和最终电泳过程中应使用金属散热片，防止凝胶过热。 - 将凝胶置于用0.5×TBE配制的1×金氏核酸凝胶染色液中染色5分钟。该染料对光敏感，应避免光照。
- 使用荧光成像仪，以520 nm激发波长和580 nm发射波长对凝胶进行成像记录。若无荧光成像仪，可使用蓝光透射仪观察。RT产物应表现为位于未延伸RT引物上方的一条弥散条带（图4）。
注意： 尽管金氏核酸凝胶染色剂在配备紫外光源的凝胶成像系统中易于观察，但必须避免将宝贵的RT产物暴露于紫外光下，以防损伤。 - 在蓝光透射仪下观察凝胶，并切下含有RT产物的凝胶区域。建议切割包含30–200 nt延伸产物的DNA条带（图4）。将切下的凝胶置于洁净表面，切成小片以增加表面积。小心转移至1.5 mL离心管中，并加入800 μL DNA洗脱缓冲液（表1）。
- 将凝胶碎片与DNA洗脱缓冲液在室温下轻柔振荡孵育过夜。
- 将混合液通过置于2 mL收集管中的醋酸纤维素滤柱，以分离洗脱缓冲液与凝胶碎片（材料表）。
- 在1.5 mL离心管中，用500 μL链霉亲和素磁珠洗涤缓冲液（表1）洗涤10 μL链霉亲和素磁珠，共洗涤三次。注意避免磁珠干燥。最后将磁珠重悬于10 μL DNA洗脱缓冲液（表1）中。
- 将步骤14.8中从凝胶碎片分离得到的洗脱缓冲液转移至含有已洗涤链霉亲和素磁珠的离心管中。
- 室温下轻柔振荡孵育至少8小时。将磁珠置于磁力架上，吸除上清液，用10 μL无RN酶水重悬磁珠，转移至0.2 mL PCR管中。
15. RT 产物的环化
- 在链霉亲和素磁珠上捕获的反转录产物在磁珠结合状态下进行环化。向磁珠悬液中加入 2.0 μL 10x 环化反应缓冲液、1.0 μL 1 mM ATP、1.0 μL 50 mM MnCl2、4.0 μL 5 M 甜菜碱、1.0 μL ssDNA 连接酶 I（材料表）、以及 1.0 μL 无 RNase 水。
- 将环化反应置于热循环仪中，在 60 °C 下孵育 4 小时。随后在 80 °C 加热 10 分钟以灭活 ssDNA 连接酶 I，然后保持在 4 °C。
16. 测试 PCR
- 在进行大规模PCR之前，使用部分环化产物来确定每个样本的最佳扩增循环数。此步骤有助于防止过度扩增，并在PCR循环数较高、反应组分趋于耗尽时减少PCR副产物的产生。
- 配制45 μL PCR反应体系，包含4.0–6.0 μL来自步骤15.2的环化产物、9.0 μL 5x反应缓冲液、0.9 μL 10 M dNTPs、2.25 μL 10 μM PE1.0引物（材料表）、2.25 μL 10 μM PE2.0引物（材料表）、0.045 μL高保真DNA聚合酶（材料表）以及水。
- 充分混匀反应体系，并均分为三个15 μL的反应。这三个反应分别进行不同循环数的PCR扩增。预期最佳循环数在7至14之间，因此应分别进行8、11和14个循环的测试PCR。
- 采用以下PCR程序：98 °C 预变性30 s；98 °C 变性5 s；65 °C 退火10 s；72 °C 延伸15 s；72 °C 最终延伸2 min；12 °C 保存。
- 加入3 μL 6x上样缓冲液，在10%非变性PAGE凝胶上电泳，直至蓝色染料前沿迁移至凝胶长度的3/4处。使用金氏核酸染料染色，并按照步骤14.4和14.5进行成像（图5）。
- 为选择最佳PCR循环数，比较不同循环数下PCR产物的扩增情况。选择能够产生最多预期大小产物、且无过度扩增副产物（例如，出现远大于预期产物的DNA弥散条带）的循环数，同时应未见PE1.0和PE2.0引物的明显消耗（参见图5中的红色箭头）。
17. 大规模 PCR
- 按照步骤16.2制备45 μL PCR反应体系，并重复PCR反应。在10%非变性PAGE凝胶上以150 V电压电泳分离PCR产物，使用1x金氏核酸染料染色，并在蓝光透射仪上成像。
- 从凝胶中切下PCR产物，转移至3 mL注射器中。用注射器碾碎凝胶，并将其挤入1.5 mL离心管。
注意：逆转录产物在环化后未延伸时会产生151 bp的PCR产物。因此，此步骤应选择大于151 bp的产物进行回收（图6）。 - 加入900 μL DNA洗脱缓冲液，在室温下轻柔振荡孵育过夜。
- 将凝胶悬液转移至置于2 mL收集管中的醋酸纤维素滤柱。在4 °C下以12,000 × g 离心3分钟，收集上清至新管中。
- 向碾碎的凝胶中再加入400 μL DNA洗脱缓冲液，转移至1.5 mL离心管中。继续轻柔振荡孵育额外4小时，进行第二次洗脱。
- 合并所有洗脱液，均分为3个管，每管400 μL。通过加入1 mL 100%乙醇和10 μg糖原沉淀DNA。涡旋混匀后，在-20 °C孵育至少2小时。
- 在4 °C下以12,000 × g 离心30分钟收集DNA沉淀，用70%乙醇洗涤DNA沉淀。
- 用移液器小心吸除全部乙醇，迅速将DNA沉淀重悬于20 μL水中。
注意：此步骤中应避免DNA沉淀完全干燥，因为干燥可能导致DNA变性。 - 取少量DNA样品，通过荧光计和高灵敏度DNA生物分析仪检测PCR产物的大小和浓度。样品现在可用于提交至任一测序平台进行测序。
- 测序所得的读段可进行处理（例如去除接头序列，修剪保留Phred质量分数大于30的序列>），比对至参考基因组，并在UCSC基因组浏览器等可视化平台中展示（图7）。
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结果
一次成功的 RIPiT 实验将富集到目标蛋白以及其他已知的相互作用蛋白，而不会富集非相互作用蛋白。如图3A所示，在 RIPiT 洗脱液中检测到了 Magoh 和 EIF4AIII，但未检测到 HNRNPA1（第6泳道）。同时，通过放射自显影（图3B）或生物分析仪（图3C）检测与 RNP 复合物共纯化的 RNA 足迹。预期嘌呤霉素处理会增加 EJC 在 RNA 上的占据率，在嘌呤霉素处理的 RIPiT 样品中观察到更强的 RNA 足迹信号（图3B，比较第2和第3泳道）。为进行深度测序而制备样品时，需将接头连接至 RNA，然后使用与接头序列互补的引物将 RNA 逆转录为 DNA。在逆转录步骤中加入生物素标记的核苷酸，以便纯化逆转录产物。逆转录完成后，必须通过尿素-聚丙烯酰...
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讨论
本文讨论了成功进行RIPiT实验的一些关键考虑因素。首先，必须对每个免疫沉淀（IP）步骤进行优化，以在每一步骤中实现尽可能高的效率。对于本文所述的细胞输入量，所使用的FLAG琼脂糖微珠的量已在我们测试的多种蛋白质中被证明具有良好的稳健性。由于只有少量的相互作用蛋白能够与FLAG蛋白共免疫沉淀，因此第二次免疫沉淀所需的抗体用量通常较低（少于10 µg）。在放大实验规模之前，从小规模RIPiT实验（来自一个10 cm培养皿）出发，并在两次免疫沉淀过程中通过蛋白质印迹法检测各组分中的目标蛋白，对于评估实验的效率和特异性极为有用。在最终洗脱组分中，应能检测到目标蛋白以及复合物中任何其他预期的相互作用蛋白。同时，检测耗竭裂解液（即未结合到FLAG-琼脂糖或磁珠上的组分）中的蛋白也有助于准确评估免疫沉淀的效率以及形成复合物的蛋白比例。此外，该分析还可判断RNase消化条件是否充分，以区分核糖核蛋白（RNP）中的RNA依赖性相互作用与非RNA依赖性相互作用。因此，设置阴性对照同样至关重要，理想情况下应选择一个与目标RNP无关的RNA结合蛋白（RBP）作为对照。例如，在图3A<...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM120209（GS）支持。作者感谢俄亥俄州立大学综合癌症中心（OSUCCC）基因组共享资源中心提供的服务（癌症中心支持基金 NCI P30 CA16058）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Anti-FLAG 亲和凝胶 | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD 一次性带鲁尔锁扣针头注射器（200 支） | Fisher | 14-823-435 | |
| 甜菜碱 5M | Sigma | B0300 | |
| 生物素-dATP | TriLink | N-5002 | |
| 生物素-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson 超声破碎仪，型号 SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | 单链 DNA 连接酶 I |
| DMEM，高糖 | ThermoFisher | 11995-065 | |
| NEB DNA 上样缓冲液 | NEB | ||
| Dynabeads Protein A 磁珠 | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 细胞系 | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler 低分子量 DNA Marker | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| 潮霉素 B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE 凝胶（10 孔） | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-尿素凝胶 | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 接头 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| Mirus transIT-X2 转染试剂 | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA 连接酶 | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，pH 6.7，100 mL） | Fisher | BP1752I-100 | |
| 紫色凝胶上样染料（6×） | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA 聚合酶 | NEB | M0491S/L | |
| 核糖核酸酶 I，E. coli，1,000 U | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X 柱 | Corning | CLS8160-24EA | |
| 链霉亲和素磁珠 | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III（SSIII） | ThermoScientific | 18080044 | 逆转录酶 |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | 金黄色核酸凝胶染料 |
| T4 多核苷酸激酶-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| 四环素 | Sigma | 87128 | |
| 耐热 5´ App DNA/RNA 连接酶 | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Any | 本方案仅适用于 Illumina 测序平台 | |
| Typhoon 5 生物分子成像仪 | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
参考文献
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