Method Article

手动复用荧光免疫学的优化、设计和避免陷阱

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

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1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

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多路荧光免疫组织化学是一项新兴技术,能够可视化完整形式固定的石蜡嵌入(FFPE)组织内的多种细胞类型。介绍了确保成功7色多路复用的指南,其中包含优化抗体和试剂、准备幻灯片、设计和避免常见问题的技巧的说明。

Abstract

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对完整组织进行微环境评估,用于分析细胞渗透和空间组织,对于了解疾病过程的复杂性至关重要。过去使用的主要技术包括免疫组织化学 (IHC) 和免疫荧光 (IF),这些技术能够使用 1 到 4 个标记将细胞可视化为快照。这两种技术都有缺点,包括难以染色不良的抗原靶点和与跨物种反应相关的局限性。IHC 是可靠和可重现的,但化学性质和对可见光光谱的依赖只允许使用几个标记,使共同本地化具有挑战性。使用IF拓宽了潜在的标记,但通常依赖于冷冻组织,由于形式固定后广泛的组织自荧光。流式细胞学,一种能够同时标记多个表位的技术,可消除IF和IHC的许多缺陷,然而,需要将细胞作为单个细胞悬浮液检查,从而失去了放弃重要生物的细胞的空间环境关系。多路复用荧光免疫组织化学 (mfIHC) 桥接这些技术,允许在形式固定石蜡嵌入 (FFPE) 组织中进行多表细胞表型,同时保留整体微环境架构和空间完整未破坏组织内细胞的关系。高荧光强度荧光荧光荧光荧光荧光荧光荧光 , 共价结合组织表位 , 使初级抗体的多种应用 , 而不必担心二次抗体的物种特异叉反应。尽管该技术已被证明能够产生可靠和准确的疾病研究图像,但由于广泛的优化和设计,创建有用的 mfIHC 染色策略的过程可能非常耗时且耗时。为了制作能够准确定位的细胞交互的可靠图像,并减轻手动分析的优化周期,这里介绍了用于幻灯片准备、优化抗体、多路复用设计以及错误的方法在染色过程中经常遇到。

Introduction

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完整的肿瘤微环境(TME)的可视化对于评估固体恶性肿瘤中的细胞渗透以及细胞与细胞的相互作用至关重要。多路荧光免疫组织化学(mfIHC)已成为研究癌症和相关疾病1、2、3、4, 5,6,7.这与设计用于分析大型数据集的新型软件和程序相结合,能够观察单元1、2、4之间的复杂相互作用。数据采集中的速率限制因子通常是分析前染色组织的质量。

以前用于 TME 中表型细胞的技术包括免疫组织化学 (IHC)、免疫荧光 (IF) 和流式细胞学,所有这些都存在重大限制。IHC使用形式固定石蜡嵌入(FFPE)组织部分,在被最常见的一种抗体染色之前,这些组织部分是去蜡化和再水化的。使用马萝卜过氧化物酶 (HRP) 结合二级抗体和化学反应允许可视化单个抗原....

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Protocol

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所有工作都已获得密歇根大学内部审查委员会的批准。

1. 优化初级抗体和滑动制备

  1. 使用常规 IHC 确定多路复用抗体的理想浓度。
    1. 通过手动常规免疫组织化学(IHC)13测试多路复用抗体。
    2. 使用具有丰富细胞类型的特定组织,用于测试的每个抗体,例如使用扁桃体组织进行CD3抗体测试。
    3. 使用公司推荐的IHC参考浓度,然后以推荐浓度的抗体浓度完成IHC,以及高于和低于推荐浓度的浓度。
  2. 在幻灯片上准备正式固定石蜡嵌入组织。
    1. 使用微体,在厚度在4至6μm之间切割FFPE组织块,并应用于带电的幻灯片。
      注:使用蒸馏水可确保在整个多路复用过程中正确安装和粘附。
    2. 将幻灯片平放,组织侧朝上,并在 37°C 下过夜干燥。
    3. 将幻灯片存放在远离极端温度的幻灯片盒中,直到准备好完成多路复用。

2. 一般染色方法

  1. 洗涤和抗原检索溶液的制备
    1. 通过混合9 L的去离子水、1 L的三分缓冲盐水(TBS)和10 mL的聚山梨酸20,制备0.1%TBST的洗涤溶液。
    2. 准备两种抗原检索溶液(pH 6和pH9;材料表)用去离子水稀释....

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Results

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获得 7 色多路测定的整个过程遵循重复模式。图 1以图表形式描述该过程。一旦幻灯片被切割和干燥,或从实验室收到,并在60°C的杂交炉中烘烤1小时,然后继续脱蜡和补液,修复幻灯片在形式再次,然后抗原检索。每一轮多路复用从抗原检索开始,在抗体去除时完成(图1)。

优化流程中的每个步骤对于实现清晰且可利用的图像至关重要。IHC 应首先使用具有 pH 6 和 pH 9 的抗原检索缓冲液对每种抗体进行测试,以直观地显示哪种抗原检索缓冲液对该特定抗体最有效。一般来说,核靶点对抗原检索有缓冲pH9。例如,FOXP3 在使用 pH 9 的抗原检索缓冲液时效果最佳,而 CD3 最适合 pH 6 的抗原检索缓冲液。从 IHC 过程获取的图像应用于验证多路分析的特异性。

需要单体来确定多路复用中每个抗体的顺序。当使用 4 色或 7 色试剂盒时,每个抗体在阵列中具有首选顺序。对于将使用的抗体数量,收集适当的控制幻灯片(即,对于一种颜.......

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Discussion

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固体肿瘤活检和手术切除的结块组织标本仍然是疾病分析和患者预后的重要诊断和预测工具。多路复用荧光免疫组织化学(mfIHC)是一种将免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和流式细胞学的优点相结合的新技术。以前在原位探测细胞的方法允许评估细胞与细胞在组织环境中的排列8,然而,可探测的表位数量少限制了复杂的分析。流式细胞测定,虽然在分析标本中的许多细胞类型时很有用,但由于将样品制备为单个细胞悬浮液9,10而失去空间环境。mfIHC通过保留细胞微环境的空间环境,增加可标记的表位数量,同时放大每个标记的表位11的信号来桥接这些技术。以前的研究已经使用mfIHC对细胞渗透在癌症和非癌症组织标本1,2,3,4,5,15的细胞。

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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作者要感谢EdStack,以前来自珀金埃尔默,他协助设置和优化原始多路复用染色。作者还希望感谢来自阿科亚生物科学的克里斯汀·施密特使用分析软件的提示。本出版物中报道的研究得到了国家癌症研究所的支持,奖励编号为P30CA046592, K08CA201581(tlf),K08CA234222(js),R01CA15158807(mpm),RSG1417301CSM(mpm),R01CA19807403(mpm),U01CA22414501(mpm,hc),CA170568 (hc)。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。杰弗瑞·科尔比结肠癌和汤姆·刘纪念研究基金提供了额外的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% 乙醇FisherHC8001GAL
70% 乙醇FisherHC10001GL
95% 乙醇FisherHC11001GL
分析软件Akoya BiosciencesCLS135783inForm 版本 2.3.0
抗淬灭封片剂ThermoFisherP36961ProLong 金刚石
封闭液VectorSP-6000Bloxall
牛血清白蛋白 （BSA）Sigma Life SciencesA9647-100G
盖玻片Fisher12-548-5E
精细任务擦拭Kimberly-Clark34120
荧光稀释剂Akoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA 稀释剂
荧光团 520Akoya生物科学FP1487001KT1：100
荧光基团 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1：100
荧光基团 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1：100
荧光基团 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1：100
荧光基团 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1：100
荧光基团 690Akoya Biosciences FP1497001KT1：100
荧光团 DAPIAkoya BiosciencesFP14903 滴 TBST 或 PBS
耐热盒Tissue-Tek25608-904塑料载玻片盒-绿色
加湿室Ibi ScientificAT-12
杂交炉FisherBiotech
疏水屏障笔VectorH-4000ImmEdge
显微镜Perkin ElmerCLS140089Mantra 定量病理工作站
微波PanasonicNN-A661S，采用逆变技术
性缓冲福尔马林Fisher ScientificSF100-410% 中性缓冲福尔马林
pH 6 抗原修复缓冲液Akoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 抗原修复缓冲液Akoya BiosciencesAR900AR9
磷酸盐缓冲盐水FisherBP3994PBS
塑料载玻片盒Tissue-Tek25608-906
保鲜膜FisherNC9070936
聚山梨醇酯 20FisherBP337-800吐温 20
初级抗体 CD163LeciaNCL-LCD1631：400
一抗 CD3DakoA04521：400
一抗 CD8Spring BioM53901：400
一抗 FOXP3DakoM35151：400
一抗 全角蛋白细胞信号传导126531：500
一抗 PD-L1细胞信号转导136841：200
二抗Akoya BiosciencesARH1001EA蛋白石聚合物
载玻片染色套装电子显微镜科学6254001
Tris 缓冲盐水康宁46-012-CMTBS
垂直载玻片架电子显微镜科学50-294-72
二甲苯费舍尔
中X3P1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

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