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方法文章

优化、设计及规避手动多重荧光免疫组织化学中的陷阱

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DOI：

10.3791/59915

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2019年7月26日

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1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

本文内容

摘要

多重荧光免疫组织化学是一种新兴技术，可在完整的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中实现多种细胞类型的可视化。本文提供了成功进行七色多重染色的指导原则，包括抗体和试剂优化、切片制备、实验设计以及避免常见问题的建议。

摘要

对完整组织的微环境进行评估，以分析细胞浸润和空间结构，在理解疾病过程的复杂性方面至关重要。过去使用的主要技术包括免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF），这些技术可利用1至4种标记物对细胞在特定时间点的状态进行可视化观察。这两种技术均存在局限性，例如难以对抗原性较弱的靶标进行染色，以及存在种间交叉反应性等问题。IHC具有可靠且可重复的优点，但由于其化学反应特性以及依赖可见光光谱，仅能使用少数几种标记物，且难以实现共定位分析。IF技术可扩展潜在标记物的数量，但通常依赖于冷冻组织，因为经甲醛固定后组织会产生较强的自发荧光。流式细胞术能够同时标记多个表位，克服了IF和IHC的许多缺陷，但需要将细胞制备为单细胞悬液，从而丢失了细胞的空间背景，破坏了重要的生物学关系。多重荧光免疫组织化学（mfIHC）整合了上述技术的优势，可在保留完整未破坏组织整体微环境结构和细胞空间关系的前提下，对甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织中的细胞进行多表位表型分析。通过高强度荧光染料与组织表位形成共价键，可实现多种一抗的重复应用，同时避免二抗引起的种属特异性交叉反应。尽管该技术已被证实可生成可靠且准确的疾病研究图像，但建立有效的mfIHC染色策略往往耗时较长且要求精确，需进行大量优化与设计。为获得能够真实反映原位细胞相互作用的高质量图像，并缩短手动分析所需的优化周期，本文介绍了载玻片制备、抗体优化、多重染色设计以及染色过程中常见错误的应对方法。

引言

完整肿瘤微环境（TME）的可视化对于评估实体恶性肿瘤中的细胞浸润以及细胞间的相互作用至关重要。多重荧光免疫组织化学（mfIHC）已成为研究癌症及相关疾病中细胞多抗原表型分析的有效工具1,2,3,4,5,6,7。结合专为分析大规模数据集而设计的新型软件和程序，可实现对细胞间复杂相互作用的观察1,2,4。数据分析前染色组织的质量往往是数据获取的限速因素。

以往用于对肿瘤微环境（TME）中细胞进行表型分析的技术包括免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）和流式细胞术，这些方法均存在显著局限性。IHC 使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织切片，经脱蜡和再水化后，通常使用一种抗体进行染色。通过使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗并引发化学反应，可实现单一抗原表位的可视化8。尽管 IHC 方法可靠，且所用 FFPE 组织易于操作，但可见光谱的限制意味着仅能可靠区分一至两种标志物，抗原共定位分析也十分困难8。为增加可在单一切片上检测的标志物数量，从而扩大可检测的抗原范围，可改用荧光技术，因其可利用更宽的可见光谱范围。在 IF 中，冷冻或 FFPE 组织被转移至载玻片，使用与不同荧光染料偶联的抗体进行染色。虽然该方法可增加可检测抗原的数量，但仍存在若干重要局限性。首先，由于每种抗体通常仅连接一个荧光染料，其荧光强度往往不足以克服组织自发荧光。正因如此，大多数 IF 实验使用冷冻组织，而冷冻组织储存成本高且操作困难。此外，由于光谱重叠和跨物种交叉反应性，尤其是使用非偶联抗体时，可用的荧光标签数量有限。流式细胞术需将新鲜组织处理为单细胞悬液，并用荧光标记抗体进行染色，数十年来一直是免疫表型分析的金标准9,10。流式细胞术的优势在于可标记多种抗体，且大多数抗体为偶联形式，因此无需担心物种间的交叉反应性。由于细胞由仪器而非人眼“观察”，可用的荧光染料种类远多于传统方法，但这也带来一定代价。补偿需手动完成，可能显著影响结果，导致假阳性和假阴性细胞群的出现。流式细胞术最显著的局限性在于，为获得单细胞悬液，组织结构及随之的空间信息完全丢失。

使用自动化荧光显微镜结合新型软件的多重荧光免疫组化（mfIHC）技术，融合了免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）和流式细胞术的优势，能够在无需补偿的情况下实现多抗原组织染色、信号放大并保留空间关系。将福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织置于带电荷的载玻片上，经过抗原修复后，首先加入针对目标抗原的一抗，随后加入带有辣根过氧化物酶（HRP）化学标签的二抗，此过程类似于常规IHC。在二抗结合后，HRP特异性反应导致荧光染料共价结合至目标表位11。组织标记完成后，通过再次加热载玻片，去除先前施加的一抗和二抗复合物，仅保留与组织表位结合的荧光标签11。该步骤使得可重复使用来自任何物种的多种抗体，而无需担心交叉反应性11,12。为最大限度减少对多种荧光染料进行人工补偿的需求，本方法选用一组光谱重叠较少的荧光染料，并包含细胞核复染，以完成mfIHC染色。为校正FFPE组织中常见的自发荧光，软件利用空白载玻片图像从最终图像中减去自发荧光信号，这一操作得以实现的原因在于荧光染料信号放大后，抗原特异性荧光信号显著增强。借助专为大规模数据集设计的新型分析程序，可识别细胞位置并分析其空间背景1,2,4。该技术最主要的局限性在于优化所需时间较长。本文提供了详细的实验方法，包括实验设计、染色及成像策略的具体操作指南。对于尚未配备优化的自动化染色系统、但希望通过手动方法更深入理解完整FFPE组织中细胞间相互作用空间背景的研究实验室而言，mfIHC技术将具有重要应用价值。

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方案

所有工作均已获得密歇根大学内部审查委员会的批准。

1. 优化一抗和切片制备

  1. 使用常规免疫组化法确定多重检测中抗体的最佳浓度。
    1. 通过手动常规免疫组化（IHC）13对拟用于多重检测的抗体进行测试。
    2. 使用含有丰富目标细胞类型的特定组织进行每种抗体的检测，例如使用扁桃体组织进行CD3抗体检测。
    3. 采用公司推荐的IHC参考浓度，并在推荐浓度基础上，同时使用高于和低于推荐浓度的抗体浓度完成IHC实验。
  2. 将福尔马林固定石蜡包埋组织切片至载玻片上。
    1. 使用切片机将FFPE组织块切成4至6 µm厚度，并贴附于带电荷的载玻片上。
      注：使用蒸馏水可确保组织在多重检测过程中正确贴附和牢固粘附。
    2. 将载玻片平放，组织面向上，在37 °C下过夜干燥。
    3. 将载玻片存放在玻片盒中，避免极端温度，直至准备进行多重检测。

2. 通用染色方法

  1. 洗涤液和抗原修复溶液的制备
    1. 通过将9 L去离子水、1 L三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）和10 mL吐温-20混合，配制0.1% TBST洗涤液。
    2. 将两种抗原修复溶液（pH 6和pH 9；材料表）用去离子水稀释至1×浓度。
  2. 脱蜡与复水
    1. 将载玻片平放，组织面向上，在杂交炉中60 °C烘烤1小时1。从烘箱中取出载玻片，冷却至少5−10分钟，然后放入垂直的载玻片架中。
    2. 使用载玻片染色装置1，依次将载玻片浸入二甲苯（三次），随后分别用100%乙醇、95%乙醇和70%乙醇各处理10分钟。
    3. 将载玻片架浸入塑料染色盒中的去离子水中洗涤2分钟，然后转移至盛有中性缓冲甲醛溶液的塑料染色盒中，浸没固定30分钟13。再用去离子水洗涤2分钟，随后进行抗原修复。
  3. 抗原修复
    1. 将载玻片架放入耐热盒中，加入pH 6或pH 9的抗原修复缓冲液至内标线（约300 mL）。
      注：抗原修复缓冲液可选用pH 6或pH 9，具体需根据表位优化。但建议对识别核内表位的抗体使用pH 9，其余抗体使用pH 6。
    2. 用塑料封膜覆盖盒子，并用橡皮筋固定。将盒子置于微波炉中旋转盘边缘（微波炉必须具备逆变技术以实现均匀加热）。先以100%功率加热45秒，再以20%功率加热15分钟13。
      注：微波处理条件可能需根据所用微波炉型号进行优化。
    3. 让载玻片冷却约15−20分钟。
  4. 在载玻片冷却期间，配制抗体和荧光染料的工作液。
    1. 将0.5 g牛血清白蛋白颗粒溶解于50 mL TBST中，配制一抗稀释液。也可使用50 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶解颗粒。
    2. 根据第1节确定的最佳浓度，用一抗稀释液配制每种一抗的工作液。每张载玻片预计使用约200 µL。
    3. 用荧光染料稀释液将每种荧光染料按1:100比例稀释，配制荧光染料工作液。
      注：此比例可能需根据具体抗体进行优化。每张载玻片预计使用约100 µL。
    4. 在染色最后一天，向1 mL TBST中加入3滴DAPI，配制4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）工作液。
  5. 载玻片染色（洗涤与封闭）
    1. 冷却后从微波炉中取出盒子，揭去塑料封膜，将载玻片用去离子水洗涤2分钟，随后在盛有TBST的塑料染色盒中再洗涤2分钟13。
    2. 用精细擦拭纸小心擦干组织周围区域（避免组织干燥），使用疏水屏障笔沿组织边缘划圈标记。注意不要让擦拭纸或笔触碰到组织本身。
    3. 将每张载玻片放入湿化室，滴加封闭液（约4滴）覆盖组织，室温（RT）孵育10分钟。
  6. 载玻片染色（一抗孵育）
    1. 取出每张载玻片，轻敲载玻片边缘使封闭液流下，并用精细擦拭纸吸除组织周围的多余封闭液。
    2. 将载玻片放回湿化室，加入约200 µL一抗工作液，室温在湿化室中孵育1小时。
    3. 将载玻片浸入TBST中洗涤2分钟，重复三次13。
      注：每次洗涤后更换新鲜TBST有助于获得更清晰的图像。
  7. 载玻片染色（二抗孵育）
    1. 轻轻吸除每张载玻片上残留的TBST，滴加约3至4滴二抗（兔源和鼠源HRP标记二抗的混合液），在湿化室中室温孵育10分钟13。
      注：若使用非鼠或兔来源的一抗，或选择其他类型的二抗，请使用相应的HRP标记二抗孵育，室温孵育45分钟。替代二抗的孵育时间可能需要优化14。
    2. 孵育结束后，将载玻片浸入TBST中洗涤2分钟，重复三次13。
  8. 载玻片染色（荧光染料孵育）
    1. 滴加约100 µL荧光染料工作液，在湿化室中室温孵育10分钟13。
    2. 将载玻片浸入TBST中洗涤2分钟，重复三次13。
  9. 抗体去除
    1. 将载玻片放入耐热盒中，按步骤2.3.2所述进行微波处理（100%功率45秒，随后20%功率15分钟），以去除抗体13,14。
      注：至此完成一轮多重染色。此为本实验流程中唯一可暂停的步骤。如需暂停，可将载玻片保留在抗原修复缓冲液中，于室温下浸泡过夜。
  10. 继续进行后续轮次的染色。对剩余的抗体-荧光染料组合重复步骤2.5.1−2.9.1。当所有抗体和荧光染料均使用完毕后，进入第2.11节操作。
  11. DAPI染色与封片
    1. 多重染色最后一轮结束后，用pH 6抗原修复液去除最后一次施加的抗体13。依次用去离子水和TBST各洗涤2分钟13。
    2. 向每张载玻片滴加约150 µL DAPI工作液，在湿化室中室温孵育10分钟1。
    3. 用TBST洗涤约30秒，使用抗荧光淬灭封片剂封片。待封片剂干燥后，可在盖玻片四角涂抹透明指甲油以固定盖玻片（可选）。

3. 文库、单重反应与多重反应的详细信息

  1. 选择用于构建荧光染料库的切片。
    1. 对于7色多重检测，收集7张富含免疫细胞的组织切片（例如扁桃体、脾脏等）以构建荧光染料库。
      注意：应选择对照切片用于构建荧光染料库，每张切片代表将在多重检测中使用的一种独特荧光染料。对照切片应含有丰富的目标表位，且每种荧光染料可使用相同类型的组织。
  2. 对荧光染料库切片进行染色和成像，用于单重和多重检测。
    1. 使用选定的对照切片和对照组织切片，按照步骤2.1−2.9.1操作。在每张切片上使用不同荧光染料，浓度为1:100；其中一张切片仅使用DAPI。
    2. 继续进行第2.11节操作，但省略DAPI染色步骤，改用TBST处理并按描述进行封片。
    3. 切片在室温下过夜干燥后，使用所有通道（DAPI、CY3、CY5、CY7、Texas Red、半导体量子点和异硫氰酸荧光素（FITC））进行成像，曝光时间设置为250 ms，并启用饱和保护功能1。
      注意：曝光时间可设置为50−250 ms13。
    4. 将荧光染料库图像上传至软件，并用于单重和多重检测的分析。
  3. 选择用于单重检测的切片。
    1. 根据已优化的抗体（第1节）选择含有丰富目标表位的对照切片。针对多重检测中每一轮染色，选择相应数量的对照切片以构建单重检测体系。
      注意：单重检测的目的是确定每种抗体在多重检测中的最佳位置（顺序）。
  4. 对单重检测切片进行染色。
    1. 按照第2.1−2.11节操作，对每张切片使用不同顺序（位置）的一抗。每张切片仅应用一种一抗，且其染色顺序（位置）应与其他切片不同。
      注意：对于每张切片中不需要一抗或荧光染料的染色轮次，应分别使用一抗稀释液和荧光染料稀释液13。
  5. 对切片进行成像并分析单重检测结果。
    1. 使用显微镜，将所有通道的曝光时间设置为250 ms，利用DAPI对焦，采集每张图像。
      注意：曝光时间可设置为50−250 ms14。
    2. 使用分析软件，通过观察染色标志物的荧光强度来评估每张单重检测切片。
    3. 将该强度与背景进行比较。如果其强度至少比背景高5−10倍，则该切片的位置即为最终多重检测中的最佳位置。
  6. 选择用于多重检测的切片。
    1. 选择感兴趣的切片，并额外增加一张切片作为空白切片，用于染色和成像后扣除自发荧光。
  7. 对多重检测切片进行染色。
    1. 根据单重检测结果，依据步骤3.5.3确定每种抗体的合适顺序（位置），并将每种荧光染料分配给相应的抗体。
      注意：此过程可能需要进一步优化；建议为低丰度标志物选择高亮度抗体1，共定位抗体应匹配光谱距离较远的荧光染料13，而光谱位于540和570的荧光染料不应共定位，以避免光谱重叠问题1。
    2. 继续执行第2.1−2.11节操作，确保空白切片不添加一抗、荧光染料或DAPI，而分别使用抗体稀释液、荧光染料稀释液和TBST替代。
  8. 对多重检测切片进行成像并分析染色完整性。
    1. 使用显微镜，将所有通道的曝光时间设置为250 ms，利用DAPI对焦，采集每张图像。
    2. 使用分析软件（材料表），通过荧光伪彩模式评估每个多重检测结果。
      注意：清晰的图像应能明确显示每个标志物。如果某个标志物呈现弥散、颗粒状或不可见，则该标志物可能未成功检测，需重新优化。
    3. 使用分析软件，通过病理学视图评估每个多重检测结果。病理学视图将确认每个标志物的特异性，并与先前已优化的IHC结果（第1节）进行比较。

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结果

获得七色多重检测的整体过程遵循一个重复的模式。图1以示意图形式描述了该流程。一旦切片完成并干燥，或从实验室接收后，在杂交炉中60 °C烘烤1小时，随后进行脱蜡和复水，再次用甲醛固定切片，接着进行抗原修复。每一轮多重染色均从抗原修复开始，到抗体去除结束（图1）。

优化该流程中的每一步对于获得清晰且可用的图像至关重要。应首先通过免疫组化（IHC）对每种抗体进行测试，分别使用 pH 6 和 pH 9 的抗原修复缓冲液，以确定哪种抗原修复缓冲液最适于该特定抗体。通常，核内靶标对抗原修复缓冲液 pH 9 的反应较好。例如，FOXP3 在使用 pH 9 的抗原修复缓冲液时效果最佳，而 CD3 则在使用 pH 6 的抗原修复缓冲液时效果最佳。应利用免疫组化（IHC）过程中获得的图像来验证多重分析的特异性。

单plex实验是确定多重染色中每种抗体顺序的必要步骤。当使用4色或7色试剂盒时，每种抗体在阵列中都有其推荐的染色顺序。...

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讨论

来自实体瘤活检和手术切除的完整组织标本，仍然是疾病分析及患者预后判断的重要诊断和预测工具。多重荧光免疫组织化学（mfIHC）是一种新兴技术，结合了免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）和流式细胞术的优势。以往用于原位检测细胞的方法虽可评估组织环境中细胞间的空间排列8，但因可检测的表位数量有限，难以进行复杂分析。流式细胞术虽适用于分析样本中多种细胞类型，但因其需将样本制备为单细胞悬液，导致失去了细胞的空间定位信息9,10。mfIHC 技术则弥补了这些不足，既保留了细胞微环境的空间背景，又增加了可标记的表位数量，同时增强了每个标记表位的信号强度11。已有研究应用 mfIHC 对癌症及非癌组织标本中的细胞浸润进行表型分析1,2,3,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢此前来自Perkin Elmer的Ed Stack在原始多重染色实验的建立与优化过程中提供的帮助。作者还感谢Akoya Biosciences的Kristen Schmidt在使用分析软件方面提供的建议。本研究的资助来自美国国立卫生研究院国家癌症研究所，资助编号为P30CA046592、K08CA201581（tlf）、K08CA234222（js）、R01CA15158807（mpm）、RSG1417301CSM（mpm）、R01CA19807403（mpm）、U01CA22414501（mpm, hc）和CA170568（hc）。本研究内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。此外，本研究还得到了Jeffery A. Colby结肠癌研究基金和Tom Liu纪念 研究基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100% 乙醇FisherHC8001GAL
70% 乙醇FisherHC10001GL
95% 乙醇FisherHC11001GL
分析软件Akoya BiosciencesCLS135783inForm 版本 2.3.0
抗荧光淬灭封片剂ThermoFisherP36961ProLong Diamond
封闭液载体SP-6000Bloxall
牛血清白蛋白（BSA）Sigma生命科学A9647-100G
盖玻片Fisher12-548-5E
精细操作擦拭Kimberly-Clark34120
荧光稀释剂Akoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA 稀释液
荧光染料 520Akoya BiosciencesFP1487001KT1:100
荧光染料 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
荧光染料 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
荧光染料620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
荧光染料650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
荧光染料 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
荧光染料 DAPIAkoya BiosciencesFP1490TBST 或 PBS 中 3 滴
耐热箱Tissue-Tek25608-904塑料载玻片盒-绿色
加湿孵育盒Ibi ScientificAT-12
杂交炉FisherBiotech
疏水屏障笔载体H-4000ImmEdge
显微镜Perkin ElmerCLS140089Mantra定量病理工作站
微波PanasonicNN-A661S采用逆变器技术
中性缓冲甲醛Fisher ScientificSF100-410% 中性缓冲福尔马林
pH 6 抗原修复缓冲液Akoya BiosciencesAR600AR6
pH 9 抗原修复缓冲液Akoya BiosciencesAR900AR9
磷酸盐缓冲液FisherBP3994PBS
塑料载玻片盒Tissue-Tek25608-906
塑料薄膜FisherNC9070936
聚山梨酯20FisherBP337-800Tween 20
一抗 CD163LeciaNCL-LCD1631:400
一抗 CD3DakoA04521:400
一抗 CD8春季生物M53901:400
一抗 FOXP3DakoM35151:400
一抗广谱角蛋白细胞信号传导126531:500
一抗 PD-L1细胞信号传导136841:200
二抗Akoya BiosciencesARH1001EAOpal 聚合物
染色片套装电子显微镜科学公司6254001
Tris缓冲盐水康宁46-012-CMTBS
垂直载玻片架电子显微镜科学公司50-294-72
二甲苯FisherX3P1GAL

参考文献

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