优化、设计及规避手动多重荧光免疫组织化学中的陷阱

摘要

多重荧光免疫组织化学是一种新兴技术，可在完整的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中实现多种细胞类型的可视化。本文提供了成功进行七色多重染色的指导原则，包括抗体和试剂优化、切片制备、实验设计以及避免常见问题的建议。

摘要

对完整组织的微环境进行评估，以分析细胞浸润和空间结构，在理解疾病过程的复杂性方面至关重要。过去使用的主要技术包括免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF），这些技术可利用1至4种标记物对细胞在特定时间点的状态进行可视化观察。这两种技术均存在局限性，例如难以对抗原性较弱的靶标进行染色，以及存在种间交叉反应性等问题。IHC具有可靠且可重复的优点，但由于其化学反应特性以及依赖可见光光谱，仅能使用少数几种标记物，且难以实现共定位分析。IF技术可扩展潜在标记物的数量，但通常依赖于冷冻组织，因为经甲醛固定后组织会产生较强的自发荧光。流式细胞术能够同时标记多个表位，克服了IF和IHC的许多缺陷，但需要将细胞制备为单细胞悬液，从而丢失了细胞的空间背景，破坏了重要的生物学关系。多重荧光免疫组织化学（mfIHC）整合了上述技术的优势，可在保留完整未破坏组织整体微环境结构和细胞空间关系的前提下，对甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织中的细胞进行多表位表型分析。通过高强度荧光染料与组织表位形成共价键，可实现多种一抗的重复应用，同时避免二抗引起的种属特异性交叉反应。尽管该技术已被证实可生成可靠且准确的疾病研究图像，但建立有效的mfIHC染色策略往往耗时较长且要求精确，需进行大量优化与设计。为获得能够真实反映原位细胞相互作用的高质量图像，并缩短手动分析所需的优化周期，本文介绍了载玻片制备、抗体优化、多重染色设计以及染色过程中常见错误的应对方法。

引言

完整肿瘤微环境（TME）的可视化对于评估实体恶性肿瘤中的细胞浸润以及细胞间的相互作用至关重要。多重荧光免疫组织化学（mfIHC）已成为研究癌症及相关疾病中细胞多抗原表型分析的有效工具^{1,2,3,4,5,6,7}。结合专为分析大规模数据集而设计的新型软件和程序，可实现对细胞间复杂相互作用的观察^1,2,4。数据分析前染色组织的质量往往是数据获取的限速因素。

以往用于对肿瘤微环境（TME）中细胞进行表型分析的技术包括免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）和流式细胞术，这些方法均存在显著局限性。IHC 使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织切片，经脱蜡和再水化后，通常使用一种抗体进行染色。通过使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗并引发....

方案

所有工作均已获得密歇根大学内部审查委员会的批准。

1. 优化一抗和切片制备

1. 使用常规免疫组化法确定多重检测中抗体的最佳浓度。
   1. 通过手动常规免疫组化（IHC）¹³对拟用于多重检测的抗体进行测试。
   2. 使用含有丰富目标细胞类型的特定组织进行每种抗体的检测，例如使用扁桃体组织进行CD3抗体检测。
   3. 采用公司推荐的IHC参考浓度，并在推荐浓度基础上，同时使用高于和低于推荐浓度的抗体浓度完成IHC实验。
2. 将福尔马林固定石蜡包埋组织切片至载玻片上。
   1. 使用切片机将FFPE组织块切成4至6 µm厚度，并贴附于带电荷的载玻片上。
      注：使用蒸馏水可确保组织在多重检测过程中正确贴附和牢固粘附。
   2. 将载玻片平放，组织面向上，在37 °C下过夜干燥。
   3. 将载玻片存放在玻片盒中，避免极端温度，直至准备进行多重检测。

2. 通用染色方法

1. 洗涤液和抗原修复溶液的制备
   1. 通过将9 L去离子水、1 L三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）和10 mL吐温-20混合，配制0.1% TBST洗涤液。
   2. 将两种抗原修复溶液（pH 6和pH 9；材....

结果

获得七色多重检测的整体过程遵循一个重复的模式。图1以示意图形式描述了该流程。一旦切片完成并干燥，或从实验室接收后，在杂交炉中60 °C烘烤1小时，随后进行脱蜡和复水，再次用甲醛固定切片，接着进行抗原修复。每一轮多重染色均从抗原修复开始，到抗体去除结束（图1）。

优化该流程中的每一步对于获得清晰且可用的图像至关重要。应首先通过免疫组化（IHC）对每种抗体进行测试，分别使用 pH 6 和 pH 9 的抗原修复缓冲液，以确定哪种抗原修复缓冲液最适于该特定抗体。通常，核内靶标对抗原修复缓冲液 pH 9 的反应较好。例如，FOXP3 在使用 pH 9 的抗原修复缓冲液时效果最佳，而 CD3 则在使用 pH 6 的抗原修复缓冲液时效果最佳。应利用免疫组化（IHC）过程中获得的图像来验证多重分析的特异性。

单plex实验是确定多重染色中每种抗体顺序的必要步骤。当使用4色或7色试剂盒时，每种抗体在阵列中都有其推荐的染色顺序。.......

讨论

来自实体瘤活检和手术切除的完整组织标本，仍然是疾病分析及患者预后判断的重要诊断和预测工具。多重荧光免疫组织化学（mfIHC）是一种新兴技术，结合了免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）和流式细胞术的优势。以往用于原位检测细胞的方法虽可评估组织环境中细胞间的空间排列⁸，但因可检测的表位数量有限，难以进行复杂分析。流式细胞术虽适用于分析样本中多种细胞类型，但因其需将样本制备为单细胞悬液，导致失去了细胞的空间定位信息^9,10。mfIHC 技术则弥补了这些不足，既保留了细胞微环境的空间背景，又增加了可标记的表位数量，同时增强了每个标记表位的信号强度¹¹。已有研究应用 mfIHC 对癌症及非癌组织标本中的细胞浸润进行表型分析^1,2,3,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100% 乙醇	Fisher	HC8001GAL
70% 乙醇	Fisher	HC10001GL
95% 乙醇	Fisher	HC11001GL
分析软件	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm 版本 2.3.0
抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36961	ProLong Diamond
封闭液	载体	SP-6000	Bloxall
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma生命科学	A9647-100G
盖玻片	Fisher	12-548-5E
精细操作擦拭	Kimberly-Clark	34120
荧光稀释剂	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal TSA 稀释液
荧光染料 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
荧光染料 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
荧光染料 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
荧光染料620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
荧光染料650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
荧光染料 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
荧光染料 DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	TBST 或 PBS 中 3 滴
耐热箱	Tissue-Tek	25608-904	塑料载玻片盒-绿色
加湿孵育盒	Ibi Scientific	AT-12
杂交炉	FisherBiotech
疏水屏障笔	载体	H-4000	ImmEdge
显微镜	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra定量病理工作站
微波	Panasonic	NN-A661S	采用逆变器技术
中性缓冲甲醛	Fisher Scientific	SF100-4	10% 中性缓冲福尔马林
pH 6 抗原修复缓冲液	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 抗原修复缓冲液	Akoya Biosciences	AR900	AR9
磷酸盐缓冲液	Fisher	BP3994	PBS
塑料载玻片盒	Tissue-Tek	25608-906
塑料薄膜	Fisher	NC9070936
聚山梨酯20	Fisher	BP337-800	Tween 20
一抗 CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
一抗 CD3	Dako	A0452	1:400
一抗 CD8	春季生物	M5390	1:400
一抗 FOXP3	Dako	M3515	1:400
一抗广谱角蛋白	细胞信号传导	12653	1:500
一抗 PD-L1	细胞信号传导	13684	1:200
二抗	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Opal 聚合物
染色片套装	电子显微镜科学公司	6254001
Tris缓冲盐水	康宁	46-012-CM	TBS
垂直载玻片架	电子显微镜科学公司	50-294-72
二甲苯	Fisher	X3P1GAL