利用病毒进入检测与分子对接分析鉴定柯萨奇病毒A16型抗病毒候选药物

摘要

本实验方案的目的是展示与病毒进入相关的不同检测方法，这些方法可用于鉴定候选的病毒进入抑制剂。

摘要

从机制上研究病毒进入过程的抗病毒检测方法，有助于明确所评估药物在哪个步骤最为有效，并可用于鉴定潜在的病毒进入抑制剂候选物。本文介绍了通过靶向病毒颗粒或早期病毒进入过程中的特定步骤，来筛选能够阻断非包膜柯萨奇病毒A16型（CVA16）感染的小分子化合物的实验方法。这些检测方法包括药物添加时间分析、基于流式细胞术的病毒结合检测以及病毒灭活检测。我们还介绍了一种利用病毒衣壳蛋白进行分子对接的实验方案，用于预测抗病毒化合物可能作用的靶向残基。这些检测方法将有助于鉴定作用于病毒进入阶段的抗病毒候选药物。未来的研究方向可进一步探索这些潜在抑制剂，以推动药物开发。

引言

手足口病（HFMD）是一种主要由柯萨奇病毒A16型（CVA16）和肠道病毒71型（EV71）在幼儿中引起的疾病。近年来，在亚太地区，由CVA16引起的手足口病病例显著增加。尽管症状可能较轻，但也可出现影响脑部和心脏的严重并发症，甚至可能导致死亡^1,2。目前尚无针对CVA16的获批抗病毒疗法或疫苗，因此迫切需要开发抗病毒策略，以控制未来的暴发及其相关并发症。

CVA16 是一种无包膜病毒，其衣壳呈二十面体结构，由五聚体组装而成，每个五聚体包含4种结构蛋白，即 VP1、VP2、VP3 和 VP4。在五聚体中围绕每个五重对称轴的区域称为“峡谷”（canyon），表现为凹陷结构，已知其在受体结合中发挥重要作用³。该峡谷底部位于 VP1 区域内存在一个疏水性口袋，其中含有一种天然脂肪配体——神经鞘氨醇（sphingosine, SPH）。已有研究提示，细胞受体如人P选择素糖蛋白配体1（PSGL-1）和清道夫受体B类成员2（SCARB2）可通过置换该配体参与病毒结合，从而引起衣壳的构象变化，并导致病毒基因组随后被释放进入宿主细胞^4,5,6。发现能够阻断病毒入侵过程中后续事件的潜在抑制剂，可能为抗CVA16感染提供有效的治疗策略。

通过实验方法解析病毒生命周期中的各个步骤，可作为靶点以帮助鉴定具有特异性作用模式的抗病毒药物。药物添加时间分析法通过在病毒感染的不同阶段（包括病毒进入前（在病毒感染前添加药物）、进入时（与病毒感染同时添加药物）以及进入后（在病毒感染后添加药物））施加药物处理，来考察其作用效果⁷。可通过标准蚀斑实验，定量测定各处理条件下形成的病毒蚀斑数量，从而评估药物的影响。基于流式细胞术的病毒结合实验可用于判断药物是否能够阻止病毒与宿主细胞的附着。该方法通过将温度从人类大多数病毒感染发生的37 °C降低至4 °C，使病毒颗粒能够结合到宿主细胞表面但无法进入细胞⁷。随后，通过针对病毒抗原的免疫染色，并利用流式细胞术对结合于细胞膜表面的病毒颗粒进行定量分析。另一方面，病毒灭活实验有助于评估药物与游离病毒颗粒之间可能发生的物理相互作用，例如屏蔽或中和病毒粒子，或诱导其发生聚集或构象改变，从而使其在后续感染过程中无法与宿主细胞表面发生有效相互作用^8,9。在该实验中，先将病毒接种物与药物共同孵育，随后进行稀释以去除药物影响，再接种至宿主细胞单层，并进行标准蚀斑实验⁸。最后，分子对接是一种强大的计算工具，可通过计算算法预测药物在病毒粒子表面的潜在结合位点，包括包膜病毒的病毒糖蛋白和非包膜病毒的病毒衣壳蛋白。该方法有助于从机制上精确定位药物作用靶点，并提供可用于后续实验进一步验证的重要信息。

我们最近采用上述方法鉴定出能有效阻断非包膜病毒CVA16感染的抗病毒化合物⁹。本文中，将详细描述并讨论所使用的方法步骤。

方案

注意：所有细胞培养和病毒感染操作必须在经过认证的生物安全柜中进行，且生物安全柜的防护等级需与所操作样本的生物安全等级相匹配。单宁类小分子化合物——诃子酸（chebulagic acid, CHLA）和石榴素（punicalagin, PUG）——已被证实可有效阻断CVA16感染⁹，本文以其为例说明候选抑制剂的使用。有关病毒学技术的基本原理、病毒扩增、病毒滴度测定，以及空斑形成单位（plaque forming units, PFU）或感染复数（multiplicity of infection, MOI）等概念，读者可参考文献¹⁰。

1. 细胞培养、病毒制备、化合物制备及化合物细胞毒性

1. 人横纹肌肉瘤（RD）细胞是允许CVA16感染的宿主细胞¹¹。在T-75培养瓶中，使用含10%胎牛血清（FBS）、200 U/mL青霉素G、200 µg/mL链霉素和0.5 µg/mL两性霉素B的10 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于37 °C、5% CO₂培养箱中培养RD细胞。
2. 通过在RD细胞中扩增病毒并测定PFU/mL的病毒滴度来制备CVA16。优化的实验方案请参见参考文献¹¹。
3. 使用各自相应的溶剂配制待测化合物及对照品：例如，将CHLA和PUG溶解于二甲基亚砜（DMSO）中。所有感染步骤所用基础培养基均为含2% FBS及抗生素的DMEM。
   注意：实验中待测化合物处理组的DMSO终浓度等于或低于0.25%；在检测中将0.25% DMSO作为阴性对照处理组用于比较。
4. 使用XTT（(2,3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-苯胺基羰基]-2H-四氮唑内盐）等细胞活力检测试剂，在RD细胞上进行待测化合物的细胞毒性实验。详细实验方案请参见参考文献¹²。根据制造商说明书，使用GraphPad Prism等分析软件确定待测化合物的细胞毒性浓度。选择对细胞活力无显著影响（≥95%活细胞）的药物浓度用于后续研究。

2. 药物添加时间测定法

1. 在病毒感染前评估药物对宿主细胞的影响（预处理）
   1. 将种子RD细胞以2 x 10⁵的接种密度接种于12孔板中⁵ 细胞/孔。在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。₂ 孵育器中培养以获得单层细胞。
   2. 在1 mL基础培养基中，用非细胞毒性的浓度（由步骤1.4确定）的待测化合物处理RD细胞，处理时间为1小时或4小时。
   3. 用1–2 mL PBS洗涤细胞，然后在基础培养基中加入病毒，每孔50 PFU（接种物体积终为300 μL），孵育1小时。每15分钟轻轻摇动培养板一次。
   4. 感染后，用 PBS 再次洗涤单层细胞，然后覆盖含有 0.8% 甲基纤维素的 1 mL 基础培养基，在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续孵育₂ 培养箱
   5. 孵育72小时后，移除覆盖的培养基，并用2 mL PBS洗涤各孔。
   6. 使用 0.5 mL 37% 甲醛固定细胞，孵育 15 分钟。
   7. 移除上清液，并使用PBS再次洗涤。
   8. 使用0.5 mL 0.5%结晶紫溶液对孔板进行染色，2分钟内移除染色液，用轻柔的水流冲洗孔板，随后空气干燥。
   9. 将培养板置于白光灯箱上计数病毒蚀斑。按以下公式计算CVA16感染率（%）：（平均蚀斑数 _{病毒+药物} 平均斑块数量 _{病毒+DMSO 对照}) × 100%.
2. 评估同时添加药物和病毒（共添加）的效果
   1. 将种子RD细胞以2 x 10的接种密度接种于12孔板中⁵ 细胞/孔。在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。₂ 孵育器中培养至形成单层细胞。
   2. 将测试化合物以适当浓度与每孔50 PFU的CVA16（接种物体积终量为300 μL）同时加入RD细胞中，共同孵育1小时，每15分钟轻摇培养板一次。
   3. 用 1 mL PBS 洗涤细胞，然后加入含 0.8% 甲基纤维素的 1–2 mL 基础培养基，于 37 °C、5% CO₂ 条件下继续培养₂ 培养箱
   4. 感染后72小时，用结晶紫染色病毒蚀斑，并按上述方法测定CVA16感染率%。
3. 评估病毒感染进入细胞后的药物治疗效果（感染后）
   1. 将种子RD细胞以2 x 10的接种密度接种于12孔板中⁵ 细胞/孔。在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。₂ 孵育器中培养至形成单层细胞。
   2. 将CVA16以每孔50 PFU（接种液体积终量为300 μL）接种至RD细胞，孵育1小时，每15分钟轻轻摇动培养板一次。
   3. 用 1-2 mL PBS 清洗孔板，然后用含有 0.8% 甲基纤维素和适当浓度测试化合物的基础培养基覆盖细胞。
   4. 用结晶紫染色病毒蚀斑，感染后72小时计数，并确定上述CVA16感染孵育的百分比。
      注意： 轻柔地进行所有 PBS 洗涤步骤，以避免细胞脱落。

3. 基于流式细胞术的结合实验

1. 以每孔 2 × 10⁵ 个细胞的接种密度将 RD 细胞接种于 12 孔板中。在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育过夜，以形成单层细胞。
2. 将细胞单层于 4 °C 预冷 1 小时。
3. 在有或无待测化合物存在的情况下，于 4 °C 条件下用 CVA16（MOI = 100）感染 RD 细胞，持续 3 小时。
   注意：病毒接种应在冰上进行，随后在 4 °C 冰箱中孵育，以维持 4 °C 的温度，此条件允许病毒结合但不进入细胞。
4. 移除病毒接种液，并用 1–2 mL 冰冷的 PBS 洗涤一次。
5. 向冰上的孔中加入 1 mL 冰冷的解离缓冲液，作用 3 分钟以消化细胞，随后收集细胞并重悬于冰冷的流式细胞术缓冲液（1× PBS 加 2% FBS）中。
6. 用冰冷的流式细胞术缓冲液洗涤细胞两次，然后在冰上用 0.5 mL 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。
7. 用 PBS 洗涤细胞以去除未结合或弱结合的病毒，随后在冰上用 1 mL 抗 VP1 抗体（1:2,000，溶于含 3% BSA 的 PBS）孵育 1 小时，接着在冰上用 Alexa 488 标记的抗小鼠 IgG 二抗（1:250，溶于含 3% BSA 的 PBS）孵育 1 小时。每次抗体处理后均需用 PBS 洗涤三次。
8. 将细胞重悬于 0.5 mL 冰冷的流式细胞术缓冲液中，按照标准操作流程在流式细胞仪上进行分析。使用配套软件以直方图形式展示数据，并进行定量以用于柱状图表示。

4. 病毒灭活实验

1. 按照先前所述方法¹²进行病毒灭活实验，条件如下：
   - 起始浓度为 10⁶ PFU/mL 的 CVA16。
   - 在 12 孔板中接种密度为 2 × 10⁵ 细胞/孔的 RD 细胞单层。
   - 药物化合物进行 50 倍稀释，以进行滴定，最终病毒浓度为 50 PFU/孔。
   - 使用 1–2 mL PBS 进行洗涤步骤。
   - 含 0.8% 甲基纤维素的覆盖培养基。
2. 采用上述结晶紫染色法对病毒蚀斑进行染色，完成病毒感染的最终读数。

5. 分子对接分析

1. 从 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载测试化合物的三维分子结构。如果分子未上传三维结构，可下载其二维结构，或使用 SMILES 字符串序列，并通过分子建模软件（例如 CORINA）将其转换为三维分子。
2. 从 RCSB 蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/）下载病毒的生物组装单元，并使用生物计算软件（例如 UCSF Chimera）准备病毒结构模型。例如，对于 CVA16 成熟病毒颗粒的晶体结构（PDB: 5C4W）³，需从 PDB 文件中删除溶剂分子，利用 Dunbrack 2010 Rotamer 库数据补全不完整的侧链，然后如先前报道所述¹³，为结构添加氢原子和电荷。对接靶标可以是具有生物组装信息（蛋白质数据库）的任何相关病毒蛋白。
3. 使用例如 UCSF Chimera 将测试化合物对接至准备好的病毒单元，并使用可视化软件（例如 Autodock Vina、PyMol）分析输出文件：
   1. 将测试化合物文件作为“配体”导入 UCSF Chimera，通过选择整个已准备好的病毒蛋白作为“受体”进行盲对接。使用计算机鼠标或触控板调整搜索体积至覆盖整个“受体”。在“高级选项”中，将结合模式数量设为最大值。对接构象将根据结合能自动从高到低排序。
   2. （可选）在盲对接基础上，利用鼠标或触控板将对接位点限制在盲对接结果中识别出的兴趣区域，以缩小搜索体积（例如 100 Å × 100 Å × 100 Å）。此步骤有助于验证盲对接结果并提高特异性。
   3. 使用分子图形系统（例如 PyMol）导入对接文件，分析各结合模式的位置。选择“配体”并使用“至任意原子”选项查找化合物与病毒蛋白之间的极性接触，然后检查结果。

结果

药物添加时间实验如图1所示，展示了小分子CHLA和PUG在病毒感染前（预处理）、病毒感染期间（共添加）或病毒感染后（感染后处理）对CVA16感染的影响。无论是在病毒感染前对宿主细胞进行预处理（图1A），还是在感染后进行处理（图1C），这两种小分子对CVA16感染性的抑制作用均十分有限。相比之下，在共添加处理中，CHLA和PUG可有效抑制CVA16感染，抑制率超过>80%（图1B）。因此，这些结果表明，当这两种化合物与病毒颗粒同时存在于宿主细胞表面并参与感染过程时，其抗病毒效果最为显著。

在图2中，基于流式细胞术的结合分析（在

讨论

在本报告中，我们描述了可用于鉴定靶向病毒进入过程（特别是针对无包膜的CVA16）的抗病毒候选化合物的实验方案。这些检测方法旨在解析病毒进入早期阶段的事件，有助于阐明受试药物抗病毒作用的作用机制及潜在靶点。“药物添加时间实验”可用于广泛判断受试化合物的潜在作用靶点，例如未感染的宿主细胞（预处理分析）、病毒颗粒或其与宿主细胞表面的相互作用（共添加分析），或病毒感染后处于复制阶段的宿主细胞（感染后分析）。该实验本身即可确定化合物的作用方式（例如共添加），从而指导后续实验（如病毒灭活实验和结合分析）的开展。洗涤步骤至关重要，以确保所考察的处理方法仅针对所分析的特定条件。采用“基于流式细胞术的结合实验”有助于评估化合物对病毒与宿主细胞结合过程的特异性影响。将实验温度维持在4 °C对于最终检测病毒颗粒在细胞表面的结合至关重要，因为该温度允许病毒结合但阻止其进入细胞。“病毒灭活实验”有助于判断药物化合物是否可能与无细胞病毒颗粒发生直接的物理相互作用。关键步骤是在病毒接种物与药物孵育后对药物进行稀释，以滴定去除残留药物，这是必要的，可防止药物在后续感染步骤中与宿主细胞表面发生有意义的相互作用¹²。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 甲醛	Sigma	AL-158127-500G
Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	A11029
两性霉素B	GIBCO	15290-018
抗VP1抗体	默克-密理博	MAB979	抗肠道病毒71抗体，与柯萨奇病毒A16交叉反应，克隆号422-8D-4C-4D
贝克曼库尔特流式细胞仪	贝克曼库尔特	FC500
科里娜	Molecular Networks GmbH
结晶紫	Sigma	C3886-100G
DMEM	GIBCO	11995-040
DMSO	Sigma	D5879
FBS	GIBCO	26140-079
甲醛	Sigma	F8775
Graphpad Prism	GraphPad
肝素钠盐	Sigma	H3393
基于XTT的体外毒理学检测试剂盒	Sigma	TOX2
甲基纤维素	Sigma	M0512-100G
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
青霉素-链霉素	GIBCO	15070-063
PyMol	施ödinger
UCSF Chimera	加利福尼亚大学旧金山分校