利用病毒进入检测与分子对接分析鉴定柯萨奇病毒A16型抗病毒候选药物

摘要

本实验方案的目的是展示与病毒进入相关的不同检测方法，这些方法可用于鉴定候选的病毒进入抑制剂。

摘要

从机制上研究病毒进入过程的抗病毒检测方法，有助于明确所评估药物在哪个步骤最为有效，并可用于鉴定潜在的病毒进入抑制剂候选物。本文介绍了通过靶向病毒颗粒或早期病毒进入过程中的特定步骤，来筛选能够阻断非包膜柯萨奇病毒A16型（CVA16）感染的小分子化合物的实验方法。这些检测方法包括药物添加时间分析、基于流式细胞术的病毒结合检测以及病毒灭活检测。我们还介绍了一种利用病毒衣壳蛋白进行分子对接的实验方案，用于预测抗病毒化合物可能作用的靶向残基。这些检测方法将有助于鉴定作用于病毒进入阶段的抗病毒候选药物。未来的研究方向可进一步探索这些潜在抑制剂，以推动药物开发。

引言

手足口病（HFMD）是一种主要由柯萨奇病毒A16型（CVA16）和肠道病毒71型（EV71）在幼儿中引起的疾病。近年来，在亚太地区，由CVA16引起的手足口病病例显著增加。尽管症状可能较轻，但也可出现影响脑部和心脏的严重并发症，甚至可能导致死亡^1,2。目前尚无针对CVA16的获批抗病毒疗法或疫苗，因此迫切需要开发抗病毒策略，以控制未来的暴发及其相关并发症。

CVA16 是一种无包膜病毒，其衣壳呈二十面体结构，由五聚体组装而成，每个五聚体包含4种结构蛋白，即 VP1、VP2、VP3 和 VP4。在五聚体中围绕每个五重对称轴的区域称为“峡谷”（canyon），表现为凹陷结构，已知其在受体结合中发挥重要作用³。该峡谷底部位于 VP1 区域内存在一个疏水性口袋，其中含有一种天然脂肪配体——神经鞘氨醇（sphingosine, SPH）。已有研究提示，细胞受体如人P选择素糖蛋白配体1（PSGL-1）和清道夫受体B类成员2（SCARB2）可通过置换该配体参与病毒结合，从而引起衣壳的构象变化，并导致病毒基因组随后被释放进入宿主细胞^4,5,6。....

方案

注意：所有细胞培养和病毒感染操作必须在经过认证的生物安全柜中进行，且生物安全柜的防护等级需与所操作样本的生物安全等级相匹配。单宁类小分子化合物——诃子酸（chebulagic acid, CHLA）和石榴素（punicalagin, PUG）——已被证实可有效阻断CVA16感染⁹，本文以其为例说明候选抑制剂的使用。有关病毒学技术的基本原理、病毒扩增、病毒滴度测定，以及空斑形成单位（plaque forming units, PFU）或感染复数（multiplicity of infection, MOI）等概念，读者可参考文献¹⁰。

1. 细胞培养、病毒制备、化合物制备及化合物细胞毒性

1. 人横纹肌肉瘤（RD）细胞是允许CVA16感染的宿主细胞¹¹。在T-75培养瓶中，使用含10%胎牛血清（FBS）、200 U/mL青霉素G、200 µg/mL链霉素和0.5 µg/mL两性霉素B的10 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），于37 °C、5% CO₂培养箱中培养RD细胞。
2. 通过在RD细胞中扩增病毒并测定PFU/mL的病毒滴度来制备CVA16。优化的实验方案请参见参考文献¹¹。

结果

加药时间实验适用于 图1 并展示了小分子CHLA和PUG在病毒进入前（预处理）、病毒进入期间（共添加）或病毒进入后（感染后）处理对CVA16感染的影响。这两种小分子在病毒感染前对宿主细胞进行预处理时，对CVA16感染性仅产生轻微影响图1A) 或感染后治疗中（图1C。相比之下，CHLA 和 PUG 能有效阻断 CVA16 感染 >80% 在共添加处理中（图1B因此，这些观察结果表明，当这两种化合物与病毒颗粒同时存在于宿主细胞表面时，在感染过程中效果最佳。

在图2中，基于流式细胞术的结合分析（在图2A

讨论

在本报告中，我们描述了可用于鉴定靶向病毒进入过程（特别是针对无包膜的CVA16）的抗病毒候选化合物的实验方案。这些检测方法旨在解析病毒进入早期阶段的事件，有助于阐明受试药物抗病毒作用的作用机制及潜在靶点。“药物添加时间实验”可用于广泛判断受试化合物的潜在作用靶点，例如未感染的宿主细胞（预处理分析）、病毒颗粒或其与宿主细胞表面的相互作用（共添加分析），或病毒感染后处于复制阶段的宿主细胞（感染后分析）。该实验本身即可确定化合物的作用方式（例如共添加），从而指导后续实验（如病毒灭活实验和结合分析）的开展。洗涤步骤至关重要，以确保所考察的处理方法仅针对所分析的特定条件。采用“基于流式细胞术的结合实验”有助于评估化合物对病毒与宿主细胞结合过程的特异性影响。将实验温度维持在4 °C对于最终检测病毒颗粒在细胞表面的结合至关重要，因为该温度允许病毒结合但阻止其进入细胞。“病毒灭活实验”有助于判断药物化合物是否可能与无细胞病毒颗粒发生直接的物理相互作用。关键步骤是在病毒接种物与药物孵育后对药物进行稀释，以滴定去除残留药物，这是必要的，可防止药物在后续感染步骤中与宿主细胞表面发生有意义的相互作用¹²。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 甲醛	Sigma	AL-158127-500G
Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	A11029
两性霉素B	GIBCO	15290-018
抗VP1抗体	默克-密理博	MAB979	抗肠道病毒71抗体，与柯萨奇病毒A16交叉反应，克隆号422-8D-4C-4D
贝克曼库尔特流式细胞仪	贝克曼库尔特	FC500
科里娜	Molecular Networks GmbH
结晶紫	Sigma	C3886-100G
DMEM	GIBCO	11995-040
DMSO	Sigma	D5879
FBS	GIBCO	26140-079
甲醛	Sigma	F8775
Graphpad Prism	GraphPad
肝素钠盐	Sigma	H3393
基于XTT的体外毒理学检测试剂盒	Sigma	TOX2
甲基纤维素	Sigma	M0512-100G
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
青霉素-链霉素	GIBCO	15070-063
PyMol	施ödinger
UCSF Chimera	加利福尼亚大学旧金山分校