本方案描述了如何使用与胰岛素相关的海肾荧光素酶作为β细胞胰岛素分泌的替代指标，在中等通量条件下快速、低成本地进行荧光素酶检测。该检测可使用大多数化学发光酶标仪和多通道移液器完成。
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本文内容
摘要
摘要
基于抗体的分泌胰岛素检测在样品采集后通常需要数小时至一天的检测时间，且根据具体检测方法的不同，成本可能较高。分泌型荧光素酶检测则可显著加快结果获取速度，并大幅降低每份样品的检测成本。本文介绍一种相对较少使用的方法，即通过将高斯荧光素酶（Gaussia luciferase）基因插入C肽序列内，来评估胰腺β细胞的胰岛素分泌活性。在胰岛素原的蛋白水解加工过程中，C肽被切除，从而释放出位于胰岛素分泌囊泡中的荧光素酶，该酶随后与胰岛素共同分泌。由于荧光素酶检测反应迅速，样品采集后数分钟内即可获得结果。该检测方法的一个局限性在于，其对胰岛素分泌的测量为相对定量，而非绝对定量。然而，本实验方案经济、可扩展，并可使用大多数标准的发光酶标仪完成。模拟式和数字式多通道移液器有助于实现检测过程中的多个操作步骤。多种不同的实验条件可同时进行测试。在确定一组重点实验条件后，应使用基于抗体的检测方法并结合标准曲线，直接测定胰岛素浓度，以验证荧光素酶检测的结果。
引言
本文介绍的方法能够在96孔板中快速且经济地检测基因改造的β细胞系的胰岛素分泌。该方案的关键在于一种经过修饰的胰岛素，其中将天然分泌的高斯荧光素酶（Gaussia luciferase, GLuc，约18 kDa）插入胰岛素原的C肽区域（见 图1），从而生成胰岛素-高斯荧光素酶融合蛋白（InsGLuc）1,2。其他较大的蛋白质（如GFP，约25 kDa）也已成功插入胰岛素的C肽区，并表现出预期的翻译后加工过程，即从胰岛素原-GFP前体正确加工为胰岛素和GFP-C肽片段3,4。在本方案所用的检测中，GLuc已针对哺乳动物表达进行了密码子优化，并引入了两个突变以增强其辉光型动力学特性5,6。利用96孔板格式可方便地测试多种处理条件及其重复样本，实验结束后可立即获得分泌结果。
如前所述2，该基于荧光素酶的分泌检测方法具有显著的成本优势（每孔< 0.01美元），明显区别于成本相对较高且技术要....
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方案
1. 试剂、培养基和缓冲液的准备（表1）
- 在500 mL高糖（4.5 g/L）杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中配制MIN6完全培养基，添加以下成分：15%胎牛血清（FBS）、100 单位/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、292 μg/mL L-谷氨酰胺和50 μM β-巯基乙醇。
注：本实验中使用的稳定细胞系需在含250 µg/mL G418抗生素的培养基中维持。 - 配制克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液（KRBH），其成分为：5 mM KCl、120 mM NaCl、15 mM HEPES（pH 7.4）、24 mM NaHCO3、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2和1 mg/mL放免级牛血清白蛋白（BSA）。根据需要从2 M储备液中加入葡萄糖。
注：KRBH用于在有或无刺激条件下孵育细胞，以检测胰岛素和/或高斯荧光素酶的分泌情况。 - 按以下步骤配制腔肠素（CTZ）储备液：将106 µL浓盐酸加入10 mL甲醇中制备酸化甲醇；然后将冻干的CTZ溶解于酸化甲醇中，浓度为1 mg/mL，并分装于螺旋盖管中，于-80 °C保存。
注：该储备液在正确保存一年后，仍能在常规荧光素酶检测中保持足够的活性。 - 根据文献9及专利信息10配制高斯荧光素酶（GL....
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结果
为了在对照条件下评估该检测方法的性能，可完成简单的葡萄糖剂量-反应曲线实验，或采用二氮嗪（diazoxide）范式进行刺激。对于前者，将细胞在无葡萄糖条件下预孵育1小时，随后用浓度递增的葡萄糖处理1小时，结果应在5 mM及以下浓度时几乎不产生分泌活性，而在8 mM以上葡萄糖浓度时观察到分泌增加（图2）。使用35 mM KCl进行刺激也可作为刺激性分泌的阳性对照。在刺激期间加入调节分泌的药物应能预期地抑制或增强分泌的GLuc活性（图3）。例如，二氮嗪结合KATP通道，阻止其在[ATP/ADP]比值升高时关闭，从而阻断膜去极化并抑制分泌13。像对甲氧基苯丙胺（PMA）这类佛波酯可激活蛋白激酶C（PKC），是已知的胰岛素分泌增强剂14。最后，使用1 µM肾上腺素刺激可激活α2A-肾上腺素能受体，进而激活异源三聚体G蛋白复合.......
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讨论
本文介绍了一种快速评估MIN6 β细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌反应的方法。为获得最佳检测效果，以适当密度接种MIN6细胞并使其生长至85–95%融合度至关重要。这有助于增强细胞间接触和同步性，从而提高β细胞对葡萄糖的反应能力。 在原代胰岛中均发生17,18,19,20,21 以及 MIN6 细胞16,18为防止葡萄糖刺激下的分泌反应减弱，应尽可能使用低代次的细胞，并在从液氮中取出新冻存管之前仅将细胞培养6至8周。可根据现有设备情况，对第2部分方案中的铺板策略进行适当调整。将InsGLuc MIN6细胞铺入96孔板进行分泌检测，可在常规实验室条件下兼顾实验操作的灵活性（包括设置重复）与铺板的准.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Cobb实验室所有现任和前任成员所做出的宝贵工作和讨论，以及Dionne Ware提供的行政协助。Michael Kalwat的研究由青少年糖尿病研究基金会（Juvenile Diabetes Research Foundation）SRA-2019-702-Q-R项目资助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R37 DK34128项目和Welch基金会I1243项目资助，项目负责人均为Melanie Cobb。本研究早期部分还得到了美国国立卫生研究院F32 DK100113项目对Michael Kalwat的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养材料 | |||
| rIns-GLuc 稳定转染的 MIN6 细胞 | 亲本 MIN6 细胞系，稳定表达 pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc，培养于含 250 µg/mL G418 的培养基中 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 含 4.5 g/L 葡萄糖的培养基 |
| 胎牛血清，热灭活 | Sigma | F4135 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| β-巯基乙醇 | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| 谷氨酰胺 | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | 储存液：250 mg/mL 溶于水。分装后于 -20°C 冻存。 |
| T75 组织培养瓶 | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 孔组织培养板 | Celltreat | 229196 | |
| 试剂储液槽（50 mL） | Corning | 4870 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 分泌检测试剂 | |||
| 牛血清白蛋白（RIA 级） | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes，pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 刺激实验可选药物 | |||
| 二氮嗪 | Sigma | D9035 | 储存液：50 mM 溶于 0.1N NaOH。向添加二氮嗪的任何缓冲液中加入等量的 0.1N HCl。 |
| 肾上腺素（酒石酸盐） | Sigma | E4375 | 储存液：5 mM 溶于水 |
| PMA（佛波醇 12-十四烷酸酯） | Sigma | P1585 | 储存液：100 µM 溶于 DMSO |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 高塞亚检测材料 | |||
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4） | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| 甘油 | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| 溴化钠 | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | 储存液：0.5 M，pH 8 |
| Tris 碱 | RPI | T60040-1000.0 | 储存液：1 M，pH 8 |
| 抗坏血酸 | Fisher Scientific | AAA1775922 | 美国专利 US7718389 指出抗坏血酸可提高腔肠素的稳定性。 |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | 美国专利 US8367357 指出亚硫酸盐可能降低因 BSA 引起的背景信号。 |
| 腔肠素（天然型） | Nanolight / Prolume | 3035MG | 储存液：1 mg/mL 溶于酸化甲醇（2.36 mM） |
| OptiPlate-96 白色不透明 96 孔微孔板 | Perkin Elmer | 6005290 | 任何不透明的白色 96 孔板均可使用。透明底板也可用，但会损失部分信号。 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 设备 | |||
| Synergy H1 混合型酶标仪或同等设备 | BioTek | 8041000 | 需要具备化学发光检测功能和 96 孔板检测能力的酶标仪。 |
| 8 通道 VOYAGER 移液器（50–1250 µL） | Integra | 4724 | 自动化多通道移液器对于快速添加荧光素酶试剂和在 96 孔板中接种细胞极为有用 |
| 8 通道 200 µL 移液器 | Transferpette S 20–200 µL | 2703710 |
参考文献
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al.
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重印与许可
