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方法文章

利用共分泌的荧光素酶替代物测量相对胰岛素分泌

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DOI：

10.3791/59926

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2019年6月25日

 , 
1Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center

本文内容

摘要

本方案描述了如何使用与胰岛素相关的海肾荧光素酶作为β细胞胰岛素分泌的替代指标，在中等通量条件下快速、低成本地进行荧光素酶检测。该检测可使用大多数化学发光酶标仪和多通道移液器完成。

摘要

基于抗体的分泌胰岛素检测在样品采集后通常需要数小时至一天的检测时间，且根据具体检测方法的不同，成本可能较高。分泌型荧光素酶检测则可显著加快结果获取速度，并大幅降低每份样品的检测成本。本文介绍一种相对较少使用的方法，即通过将高斯荧光素酶（Gaussia luciferase）基因插入C肽序列内，来评估胰腺β细胞的胰岛素分泌活性。在胰岛素原的蛋白水解加工过程中，C肽被切除，从而释放出位于胰岛素分泌囊泡中的荧光素酶，该酶随后与胰岛素共同分泌。由于荧光素酶检测反应迅速，样品采集后数分钟内即可获得结果。该检测方法的一个局限性在于，其对胰岛素分泌的测量为相对定量，而非绝对定量。然而，本实验方案经济、可扩展，并可使用大多数标准的发光酶标仪完成。模拟式和数字式多通道移液器有助于实现检测过程中的多个操作步骤。多种不同的实验条件可同时进行测试。在确定一组重点实验条件后，应使用基于抗体的检测方法并结合标准曲线，直接测定胰岛素浓度，以验证荧光素酶检测的结果。

引言

本文介绍的方法能够在96孔板中快速且经济地检测基因改造的β细胞系的胰岛素分泌。该方案的关键在于一种经过修饰的胰岛素，其中将天然分泌的高斯荧光素酶（Gaussia luciferase, GLuc，约18 kDa）插入胰岛素原的C肽区域（见 图1），从而生成胰岛素-高斯荧光素酶融合蛋白（InsGLuc）1,2。其他较大的蛋白质（如GFP，约25 kDa）也已成功插入胰岛素的C肽区，并表现出预期的翻译后加工过程，即从胰岛素原-GFP前体正确加工为胰岛素和GFP-C肽片段3,4。在本方案所用的检测中，GLuc已针对哺乳动物表达进行了密码子优化，并引入了两个突变以增强其辉光型动力学特性5,6。利用96孔板格式可方便地测试多种处理条件及其重复样本，实验结束后可立即获得分泌结果。

如前所述2，该基于荧光素酶的分泌检测方法具有显著的成本优势（每孔< 0.01美元），明显区别于成本相对较高且技术要求更复杂的酶联免疫吸附测定（ELISA）（每孔> 2美元）以及均相时间分辨荧光（HTRF）或其他基于荧光共振能量转移（FRET）的抗体检测方法（每孔> 1美元）。与这些通过标准曲线测定胰岛素浓度的抗体检测方法相比，InsGLuc检测法通过与板上对照孔进行相对比较，来评估分泌活性。因此，每次实验均需设置适当的对照。这一差异是在快速性和低成本之间做出的权衡。然而，已有研究证明，InsGLuc的分泌水平与ELISA测定的胰岛素分泌量高度相关1,2。该技术已实现高通量筛选的扩展应用1,2,7，并成功鉴定了多种调控胰岛素分泌的新分子，包括一种电压门控钾通道抑制剂7，以及一种抑制β细胞功能的天然产物——chromomycin A28。InsGLuc检测法最适合那些计划持续评估多种不同处理条件对胰岛素分泌影响的研究人员。在后续实验中，有必要在亲本β细胞系中重复关键结果，并最好在小鼠或人胰岛中进一步验证，同时采用基于抗体的方法检测胰岛素分泌水平。

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方案

1. 试剂、培养基和缓冲液的准备（表1）

  1. 在500 mL高糖（4.5 g/L）杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中配制MIN6完全培养基，添加以下成分：15%胎牛血清（FBS）、100 单位/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、292 μg/mL L-谷氨酰胺和50 μM β-巯基乙醇。
    注：本实验中使用的稳定细胞系需在含250 µg/mL G418抗生素的培养基中维持。
  2. 配制克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液（KRBH），其成分为：5 mM KCl、120 mM NaCl、15 mM HEPES（pH 7.4）、24 mM NaHCO3、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2和1 mg/mL放免级牛血清白蛋白（BSA）。根据需要从2 M储备液中加入葡萄糖。
    注：KRBH用于在有或无刺激条件下孵育细胞，以检测胰岛素和/或高斯荧光素酶的分泌情况。
  3. 按以下步骤配制腔肠素（CTZ）储备液：将106 µL浓盐酸加入10 mL甲醇中制备酸化甲醇；然后将冻干的CTZ溶解于酸化甲醇中，浓度为1 mg/mL，并分装于螺旋盖管中，于-80 °C保存。
    注：该储备液在正确保存一年后，仍能在常规荧光素酶检测中保持足够的活性。
  4. 根据文献9及专利信息10配制高斯荧光素酶（GLuc）检测缓冲液，以延长96孔板格式下高斯荧光素酶检测的半衰期。配方如下：25 mM Tris（pH 8）、1 mM EDTA、5%甘油、1 mg/mL Na2PO4、300 mM抗坏血酸钠、200 mM Na2SO3，溶于水中。将配好的缓冲液分装后于-20 °C冷冻保存。解冻后置于4 °C保存使用。
  5. 配制高斯荧光素酶工作液时，向GLuc检测缓冲液中加入4.2 µL/mL的1 mg/mL（2.36 mM）CTZ储备液，得到含10 µM CTZ的2倍工作液，该工作液在检测中的终浓度为5 µM。

2. InsGLuc MIN6 细胞的培养及用于分泌检测的接种

  1. 培养 MIN6 细胞时，每周使用标准细胞培养技术进行一次胰酶消化并传代细胞。每两到三天更换一次细胞培养基。在培养基中加入适当的筛选抗生素，例如 250 µg/mL 的 G418。
    1. 为了每周为实验提供足够数量的细胞，需在 T75 培养瓶中维持细胞培养。每瓶 T75 培养瓶中加入 10 mL 培养基并接种 6 × 106 个细胞，通常在培养 7 天后可获得总计 30 × 106 至 40 × 106 个细胞。
  2. 为将细胞接种至 96 孔板做准备，用 PBS 洗涤一个汇合的 InsGLuc MIN6 细胞 T75 培养瓶两次，然后加入 2 mL 胰酶。在 37 °C 下孵育约 5 分钟，或直至细胞从培养瓶表面脱落。测定每毫升的细胞浓度。
    1. 将细胞用完全培养基稀释至 1 × 106 个细胞/mL，以便在 96 孔板中每孔加入 100 µL 含 1 × 105 个细胞。细胞在接种后 3–4 天应达到实验所需的汇合度。
      注意：如需延长培养时间，可将接种细胞浓度减半。在实验检测当天之前无需更换培养基，除非细胞需接受特定实验处理。

3. 葡萄糖刺激的高斯荧光素酶分泌检测

  1. 在实验当天，配制足量的KRBH缓冲液用于实验（步骤1.2）。每块96孔板至少需要50 mL KRBH缓冲液，因此建议至少配制75 mL以确保实验所需缓冲液充足。若不同药物处理条件的组合需要使用KRBH进行稀释，则应额外多配制缓冲液。
  2. 准备一个盛有无葡萄糖KRBH缓冲液的储液槽。将96孔板中的培养基快速倒置于实验室水槽上方以去除液体，然后将孔板在叠放的纸巾上用力轻拍，去除残留的多余培养基。
  3. 使用电子或多通道手动移液器，从储液槽中向96孔板每孔加入100 µL KRBH缓冲液。重复此操作，共进行两次洗涤。
  4. （急性药物处理的可选步骤）若不进行药物处理，则无需修改，直接进行步骤3.5和3.6。若需检测小分子化合物对胰岛素分泌的影响，可在预孵育期、刺激期或两个阶段同时向细胞中添加化合物。
    1. 一种方法是将化合物批量加入1.5 mL离心管中的KRBH缓冲液，然后使用可调间距的8通道数字移液器将含药KRBH缓冲液从离心管转移至96孔板中的细胞。
      注：若无可调间距移液器，可预先在另一块96孔板中配制含药KRBH缓冲液，再使用标准8通道移液器进行转移。此外，也可根据先前描述的方法1,8，在实验前于培养基中对细胞进行长达24小时的药物预处理，以进一步调整处理方案。
  5. 向每孔加入100 µL含有目标浓度葡萄糖或化合物的KRBH缓冲液，并将培养板置于37 °C培养箱中孵育1小时。
    注：根据实验设计，使用可调节通道间距的电子多通道移液器将十分便利，该移液器可实现从八列1.5 mL离心管到96孔板八行之间的无缝转移。
  6. 预孵育1小时后，将缓冲液倾倒至水槽中，并在纸巾上用力轻拍去除残留液体。每孔加入100 µL无葡萄糖KRBH缓冲液，以洗去累积的Gaussia荧光素酶背景信号。再次倾倒缓冲液，随后向各孔加入对照和刺激性处理条件的溶液，每孔100 µL。将培养板置于37°C培养箱中继续孵育1小时。
  7. 使用多通道移液器小心吸取50 µL上清液，必要时在不同处理条件下更换吸头，将上清液转移至洁净的不透明白色96孔检测板中。
    注：必要时也可使用白色侧壁透明底板，但会损失大量荧光素酶信号。
  8. 收集50 µL KRBH上清液后，可立即进行检测。如需暂存，可密封后于4 °C保存数天（GLuc活性半衰期约为6天），或于-20 °C保存长达一个月11,12。

4. 分泌型高斯荧光素酶检测

  1. 配制GLuc检测试剂工作液时，将所需体积的CTZ储备液（4.2 µL/mL）用移液器加入GLuc检测试剂缓冲液中。为防止CTZ温度升高，请在-80 °C冰箱中快速移液，或将离心管置于干冰上操作。
  2. 使用电子多通道移液器，迅速向含有收集的KRBH上清液的96孔板各孔中加入50 µL GLuc检测试剂工作液。若孔壁上有液滴残留，可将酶标板在台式摆动离心机中短暂离心。
  3. 在几分钟内使用合适的酶标仪读取发光信号，每孔积分时间为0.1 s。

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结果

为了在对照条件下评估该检测方法的性能，可完成简单的葡萄糖剂量-反应曲线实验，或采用二氮嗪（diazoxide）范式进行刺激。对于前者，将细胞在无葡萄糖条件下预孵育1小时，随后用浓度递增的葡萄糖处理1小时，结果应在5 mM及以下浓度时几乎不产生分泌活性，而在8 mM以上葡萄糖浓度时观察到分泌增加（图2）。使用35 mM KCl进行刺激也可作为刺激性分泌的阳性对照。在刺激期间加入调节分泌的药物应能预期地抑制或增强分泌的GLuc活性（图3）。例如，二氮嗪结合KATP通道，阻止其在[ATP/ADP]比值升高时关闭，从而阻断膜去极化并抑制分泌13。像对甲氧基苯丙胺（PMA）这类佛波酯可激活蛋白激酶C（PKC），是已知的胰岛素分泌增强剂14。最后，使用1 µM肾上腺素刺激可激活α2A-肾上腺素能受体，进而激活异源三聚体G蛋白复合...

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讨论

本文介绍了一种快速评估MIN6 β细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌反应的方法。为获得最佳检测效果，以适当密度接种MIN6细胞并使其生长至85–95%融合度至关重要。这有助于增强细胞间接触和同步性，从而提高β细胞对葡萄糖的反应能力。  在原代胰岛中均发生17,18,19,20,21 以及 MIN6 细胞16,18为防止葡萄糖刺激下的分泌反应减弱，应尽可能使用低代次的细胞，并在从液氮中取出新冻存管之前仅将细胞培养6至8周。可根据现有设备情况，对第2部分方案中的铺板策略进行适当调整。将InsGLuc MIN6细胞铺入96孔板进行分泌检测，可在常规实验室条件下兼顾实验操作的灵活性（包括设置重复）与铺板的准...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Cobb实验室所有现任和前任成员所做出的宝贵工作和讨论，以及Dionne Ware提供的行政协助。Michael Kalwat的研究由青少年糖尿病研究基金会（Juvenile Diabetes Research Foundation）SRA-2019-702-Q-R项目资助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R37 DK34128项目和Welch基金会I1243项目资助，项目负责人均为Melanie Cobb。本研究早期部分还得到了美国国立卫生研究院F32 DK100113项目对Michael Kalwat的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养材料
rIns-GLuc 稳定转染的 MIN6 细胞亲本 MIN6 细胞系，稳定表达 pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc，培养于含 250 µg/mL G418 的培养基中
DMEMSigmaD6429含 4.5 g/L 葡萄糖的培养基
胎牛血清，热灭活SigmaF4135
青霉素/链霉素Thermo-Fisher ScientificSV30010
β-巯基乙醇Thermo-Fisher ScientificBP 176-100
谷氨酰胺Thermo-Fisher ScientificBP379-100
胰蛋白酶-EDTASigmaT3924-500
G418Gold BiotechnologyG418-10储存液：250 mg/mL 溶于水。分装后于 -20°C 冻存。
T75 组织培养瓶Fisher Scientific07-202-000
96 孔组织培养板Celltreat229196
试剂储液槽（50 mL）Corning4870
名称公司货号备注
分泌检测试剂
牛血清白蛋白（RIA 级）Thermo-Fisher Scientific50-146-952
D-(+)-葡萄糖SigmaG8270-1KG
KClThermo-Fisher ScientificP217-500
NaClThermo-Fisher ScientificS271-3
Hepes，pH 7.4Thermo-Fisher Scientific50-213-365
NaHCO3Thermo-Fisher Scientific15568414
MgCl2Thermo-Fisher ScientificM9272-500G
CaCl2SigmaC-7902
名称公司货号备注
刺激实验可选药物
二氮嗪SigmaD9035储存液：50 mM 溶于 0.1N NaOH。向添加二氮嗪的任何缓冲液中加入等量的 0.1N HCl。
肾上腺素（酒石酸盐）SigmaE4375储存液：5 mM 溶于水
PMA（佛波醇 12-十四烷酸酯）SigmaP1585储存液：100 µM 溶于 DMSO
名称公司货号备注
高塞亚检测材料
磷酸氢二钠（Na2HPO4）Thermo-Fisher ScientificS374-500
甘油Thermo-Fisher ScientificG334
溴化钠Thermo-Fisher ScientificAC44680-1000
EDTAThermo-Fisher ScientificAC44608-5000储存液：0.5 M，pH 8
Tris 碱RPIT60040-1000.0储存液：1 M，pH 8
抗坏血酸Fisher ScientificAAA1775922美国专利 US7718389 指出抗坏血酸可提高腔肠素的稳定性。
Na2SO3SigmaS0505-250G美国专利 US8367357 指出亚硫酸盐可能降低因 BSA 引起的背景信号。
腔肠素（天然型）Nanolight / Prolume3035MG储存液：1 mg/mL 溶于酸化甲醇（2.36 mM）
OptiPlate-96 白色不透明 96 孔微孔板Perkin Elmer6005290任何不透明的白色 96 孔板均可使用。透明底板也可用，但会损失部分信号。
名称公司货号备注
设备
Synergy H1 混合型酶标仪或同等设备BioTek8041000需要具备化学发光检测功能和 96 孔板检测能力的酶标仪。
8 通道 VOYAGER 移液器（50–1250 µL）Integra4724自动化多通道移液器对于快速添加荧光素酶试剂和在 96 孔板中接种细胞极为有用
8 通道 200 µL 移液器Transferpette S 20–200 µL2703710

参考文献

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