本文介绍了基于常压质谱技术的一种独特实时分析方法的样品制备步骤。该方法使我们能够在无需任何特殊预处理的情况下，对生物分子进行实时的活体分析。
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本文内容
摘要
摘要
质谱法（MS）是分析化学中一种强大的工具，因为它能够提供关于分子的非常精确的信息，例如质荷比（m/z），这些信息可用于推断分子量和分子结构。尽管质谱法本质上是一种破坏性分析方法，但近年来环境电离技术的进步使我们能够在组织完整性相对完好的情况下获取数据。探针电喷雾电离（PESI）是一种所谓的直接分析方法，因为它不需要复杂且耗时的样品前处理。一根细针既充当样品采集器，又作为电离发射器。由于探针尖端极为尖锐精细，对样品的破坏极小，从而允许我们原位实时获取来自生物体的分子信息。本文将介绍PESI-MS技术在生物医学研究与开发中的三个应用。第一个应用涉及固体组织分析，这是该技术在医学诊断中的基本应用形式。由于该技术仅需10 mg样品，因此在常规临床环境中可能具有重要应用价值。第二个应用面向体外医学诊断，用于检测人血清样本。液体样品的检测能力在多种生物学实验中也十分宝贵，尤其适用于无法为传统分析技术提供足够样品体积的情况。第三个应用侧重于将探针直接应用于活体动物，从而可实时监测特定器官中代谢物或药物的动态变化。在每一项应用中，我们均可通过质谱检测结果推断所识别的分子，或利用人工智能实现医学诊断。
引言
质谱法（MS）是还原论的一种技术实现；它将分析对象简化为可基于分子种类或级联过程进行解释的基本单位，因此是分析化学的代表性方法。质谱法由四个过程组成：电离、分析、检测和谱图获取。由于分子的电离是质谱分析中的第一步，它通常限制了待测分析物的形式。大多数电离过程需要破坏有机样品的结构、形态以及实时的生物过程。例如，电喷雾电离（ESI）质谱要求样品处于液态才能实现高效电离1。因此，样品必须经过复杂的生化前处理，而这会改变分子的组成。相比之下，基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱虽可重建薄切组织的分子分布图谱2,3，但其电离效率过低，难以检测样品中所有分子，尤其不适用于脂肪酸的分析。鉴于这些局限性，探针式电喷雾电离（PESI）4可在不破坏结构完整性的前提下，原位观察生物系统中的实时变化5，且被观测的生物体在技术上仍处于活体状态。该方法使用一根极细的针，同时作为取样工具和离子发射器。这意味着可以跳过复杂的样品前处理步骤，直接获得反映活体系统原位分子组分的质谱数据。
目前存在其他几种可与PESI-MS相竞争的电离方法。其中之一是快速蒸发电离质谱法（rapid evaporative ionization mass spectro....
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方案
山梨大学动物护理机构委员会批准了本文所述的所有实验方案及实验动物的使用。山梨大学机构伦理委员会批准了人类样本的使用。
1. 实体组织制备
注意：样本从动物或人体取出后必须置于冰上，以保持组织的新鲜度。如果解剖后不能立即进行测量，建议将组织储存在 -80 °C。不建议将组织置于任何类型的缓冲液或生理盐水中，因为这些溶液可能会提取组织中的某些成分。经醛类固定或包埋于石蜡/蜡质或冷冻凝胶中的组织不适合进行质谱（MS）检测。
- 使用手术刀或刀片将组织样本切成约 2 x 2 x 2 mm 的大小。或者，也可使用皮肤检查用的一次性活检穿刺针（钻孔直径 3 mm）打孔取样。若采用此方法，需将柱状样本的长度修剪至 2 mm。
注意：任何组织均可采用本方法进行分析。在本实验中，肝脏15和肾脏19已成功用于获取质谱图。通常，实质器官可获得良好的质谱信号，而含有纤维成分的组织则效果较差。 - 若组织被血液污染，需用冰冻的磷酸盐缓冲盐水短暂清洗。
注意：为尽量减少死后组织损伤，应在室温下尽快完成此步骤。若不能立即进行检测，应将组织在液氮中速冻后于 -80 °C 保存。 - 将切割或穿刺所得的样本（约 10 mg）放入塑料微量离心管中，并加入 100 µL 的 50% 乙....
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结果
如图3所示，PESI-MS技术获得的数据为质谱图，其m/z范围在本系统中为10至1,200。尽管可检测至m/z 2,000的分子，但使用该技术在m/z 1,200以上的质量范围内获得的峰极少。因此，我们分析了m/z 10至1,200范围内的峰。在m/z 800和900附近存在明显的峰群；前者代表细胞膜组分，如磷脂酰胆碱（PC）类物质，后者代表三酰基甘油（TAG）。图4展示了来自正常人肾组织和肾细胞癌（RCC）的质谱图。这些质谱图是通过方案1中所述的直接组织方法获得的。由于透明细胞型RCC在细胞质中积累TAG，因此在m/z 900附近的谱峰非常显著。图4中的结果是通过图1中针对固体样品介绍的提取方法获得的。
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讨论
尽管PESI是质谱分析中电喷雾电离（ESI）的一种衍生技术4，但它在实时代谢组学监测以及无需进行任何复杂或耗时前处理的生化反应分析方面具有显著优势5,14,15,17。PESI是一种简便且即时的质谱技术，可直接应用于生物体的完整状态分析。由于无需复杂的样品前处理流程，因此更有可能全面评估整个样本的分子组成，避免了传统ESI中因使用大量有机溶剂进行多步前处理而导致的样本损失。因此，在所有条件得到适当控制的前提下，PESI能够从样本中获取更为丰富的信息。
在进行PESI-MS分析时，我们首先需要提及一些为获得良好结果所需的技术要点。PESI中最关键的因素是在分析过程中维持稳定的离子化效率。为实现这一点，建议在分析过程中通过参考计算机显示器上的总离子流（TIC），逐步调整并优化针尖与样品.......
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披露
通讯作者由岛津公司资助，该公司是PESI-MS仪器的制造商和供应商。
致谢
我们感谢饭塚步实（Ayumi Iizuka）操作PESI-MS，以及泽登和子（Kazuko Sawa-nobori）提供的秘书协助。我们感谢Edanz Group（www.edanzediting.com/ac）的Bronwen Gardner博士对本手稿初稿进行编辑。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-氟-2'-脱氧尿苷 (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| 一次性双刃活检打孔器（Trepan） | kai Europa GmbH | BP-30F | 孔径 3mm |
| 乙醇 | nacalai tesque | 14710-25 | 特级纯试剂 |
| LabSolutions | Shimadzu | 版本 5.96，数据分析软件 | |
| 微量研磨杵 | United Scientific Supplies | S13091 | |
| 微量离心管 | Treff | 982855 | 0.5 mL 透明管 |
| PESI-MS（探针电喷雾电离质谱） | Shimadzu | DPiMS-2020 | 配备PESI的质谱仪 |
| PPGT溶液 | Shimadzu | ND | 连接至DPiMS-2020 |
参考文献
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultravio....
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重印与许可
