制造用于过继性免疫治疗的嵌合抗原受体（CAR）T细胞

摘要

我们介绍了一种可靠生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并在体外和体内检测其分化与功能。

摘要

过继性免疫治疗在癌症和传染病的治疗中具有广阔前景。我们描述了一种简单的方法，用于将嵌合抗原受体（CAR）转导至原代人T细胞，并在体外扩增其子代细胞。我们提供了检测CAR表达、细胞分化、增殖能力及细胞溶解活性的实验方法。同时，我们还描述了检测CAR T细胞效应细胞因子产生及炎性细胞因子分泌的实验方案。该方法为过继性免疫治疗的临床前模型提供了可靠且全面的CAR T细胞培养技术。

引言

嵌合抗原受体（CAR）为将T细胞重定向以靶向特定肿瘤抗原提供了一种前景广阔的策略。CAR是一种可结合抗原靶标的合成受体。尽管其具体结构存在差异，但CAR通常包含三个不同的功能域。胞外域负责与靶抗原结合，通常由一个单链抗体片段通过胞外铰链区连接至CAR构成。第二个功能域通常来源于T细胞受体（TCR）复合物中的CD3ζ链，在CAR与抗原结合后促进T细胞的活化。第三个共刺激域则用于增强T细胞的功能、植入能力、代谢活性及持久性。CAR-T细胞疗法在多种造血系统恶性肿瘤（包括B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和多发性骨髓瘤）中的成功应用，凸显了该策略的治疗潜力^1,2,3,4,5,6。近期美国食品药品监督管理局（FDA）批准了两种靶向CD19的CAR-T细胞疗法——用于儿童及年轻成人ALL的替沙格列克（tisagenlecleucel）和用于弥漫性大B细胞淋巴瘤的阿基仑赛（axicabtagene ciloleucel），进一步证实了CAR-T细胞疗法的转化医学价值。

方案

所有动物实验均经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. T细胞激活、转导与扩增

1. 在6孔细胞培养板中，按每3个磁珠对应1个T细胞的比例，将新鲜或冻存的原代人T细胞与抗CD3/CD28磁珠（例如Dynabeads）混合，以激活T细胞。使用添加了5%正常人AB血清、2 mM L-谷氨酰胺、20 mM HEPES和IL-2（100单位/mL）的X-VIVO 15培养基培养T细胞。扩增期间维持T细胞浓度为10⁶个T细胞/mL。在37 °C、20% O₂、95%湿度及5% CO₂条件下培养T细胞。
2. 过夜刺激后，向活化的T细胞中加入慢病毒上清液。计算所需上清液体积，以达到3−5的感染复数（MOI）。
   注意： CD19-BBζ CAR慢病毒质粒包含CD8铰链区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域²¹。CD19-BBζ慢病毒上清液的制备方法如前所述²¹。
3. 第3天，取部分细胞样品用于冻存。冻存前，通过轻柔吹打和磁性分离去除磁珠。配制含0.5%二甲基亚砜（DMSO）的磷酸盐缓冲液（PBS），4 °C保存备用。
   1. 将T细胞以300 × g离心5分钟。弃去上清液，加入5....

结果

采用上述方法，我们对T细胞进行了刺激与扩增，培养时间为3天或9天（图1A,B）。我们还通过检测细胞表面表达的不同糖蛋白，分析了其分化特征，具体分群策略如图1C所示。结果显示，在体外培养过程中，T细胞随时间推移逐渐向效应细胞表型转变（图1D）。我们评估了CAR T细胞在抗原刺激下的效应功能和增殖能力，发现培养时间较短（较早收获）的细胞在功能上优于长期培养的细胞。与培养9天的细胞相比，第3天收获的CART19细胞在再次受到相应配体刺激时，表现出更强的增殖能力和细胞杀伤活性（图2A,B）。

在一种人源异种移植小鼠急性淋巴细胞白血病（ALL）模型中，我们比较了第3天与第9天收获的CAR T细胞的效力（

讨论

本文介绍了在体外培养的不同时间点收获CAR T细胞后，评估其功能和效力的方法。我们的方法全面阐述了用于体外评估CAR T细胞增殖能力及效应功能的实验方案。我们描述了通过CAR刺激后检测CAR T细胞活性的方法，并详细说明了使用对数扩增期第3天与第9天收获的CAR T细胞建立的白血病异种移植模型。

在比较体外扩增不同时间点收获的CAR T细胞疗效时，存在固有的挑战。由于3天培养周期内产生的T细胞数量较少，可能不足以全面评估其功能。这一问题在患者来源的T细胞中尤为突出，因为这些细胞的增殖能力常因内外因素而减弱²⁰。

考虑到第3天的CAR T细胞相比处于对数增殖期末期的第9天细胞具有更强的代谢和增殖能力，应输注多少CAR T细胞？我们估算了第3天的CAR T细胞在体外再培养6天后可达到3 × 10⁶的数量，并据此确定应输注的第3天CAR T细胞数量（0.5 × 10⁶），以实现与第9天细胞的等效比较。因此，我们采用“压力测试”策略来比较输注后.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CD3/CD28 Dynabeads	赛默飞世尔科技	40203D
APC 小鼠抗人 CD8	BD 生物科学	555369	RRID:AB_398595
APC-H7 小鼠抗人 CD8 抗体	BD Biosciences	560179	RRID:AB_1645481
BD FACS溶血溶液 10倍浓缩液	BD 生物科学	349202
BD Trucount 绝对计数管	BD 生物科学	340334
Brilliant Violet 510 抗人 CD4 抗体	BioLegend	317444	RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 抗人 CD3 抗体	BioLegend	317322	RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒	Life Technologies	C34554
CountBright 绝对计数微球，	Invitrogen	C36950
FITC 标记抗人 CD197（CCR7）抗体	BD Pharmingen	561271	RRID:AB_10561679
FITC 标记小鼠抗人 CD4	BD 生物科学	555346	RRID:AB_395751
HEPES	Gibco	15630-080
人AB型血清	Valley Biomedical	HP1022
人IL-2免疫印迹，优质级	Miltenyi	130-097-744
L-谷氨酰胺	Gibco	28030-081
液体闪烁计数器，MicroBeta Trilux	Perkin Elmer
LIVE/DEAD 可固定紫染料	分子探针	L34964
Multisizer 库尔特计数器	贝克曼库尔特
Na251CrO4	Perkin Elmer	NEZ030S001MC
太平洋蓝染料标记的抗人CD14抗体	BioLegend	325616	RRID:AB_830689
太平洋蓝染料标记的抗人CD19抗体	BioLegend	302223
PE 抗人 CD45RO 抗体	BD 生物科学	555493	RRID:AB_395884
PE/Cy5 抗人 CD95（Fas）抗体	BioLegend	305610	RRID:AB_493652
PE/Cy7 抗人 CD27 抗体	贝克曼库尔特	A54823
无酚红培养基	Gibco	10373-017
10% UltraPure SDS 溶液	Invitrogen	15553027
微电极探针	BD 生物科学	555815
X-VIVO 15	Gibco	04-418Q
XenoLight D-荧光素钾盐	Perkin Elmer	122799