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方法文章

制造用于过继性免疫治疗的嵌合抗原受体（CAR）T细胞

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DOI：

10.3791/59949

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2019年12月17日

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

本文内容

摘要

我们介绍了一种可靠生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并在体外和体内检测其分化与功能。

摘要

过继性免疫治疗在癌症和传染病的治疗中具有广阔前景。我们描述了一种简单的方法，用于将嵌合抗原受体（CAR）转导至原代人T细胞，并在体外扩增其子代细胞。我们提供了检测CAR表达、细胞分化、增殖能力及细胞溶解活性的实验方法。同时，我们还描述了检测CAR T细胞效应细胞因子产生及炎性细胞因子分泌的实验方案。该方法为过继性免疫治疗的临床前模型提供了可靠且全面的CAR T细胞培养技术。

引言

嵌合抗原受体（CAR）为将T细胞重定向以靶向特定肿瘤抗原提供了一种前景广阔的策略。CAR是一种可结合抗原靶标的合成受体。尽管其具体结构存在差异，但CAR通常包含三个不同的功能域。胞外域负责与靶抗原结合，通常由一个单链抗体片段通过胞外铰链区连接至CAR构成。第二个功能域通常来源于T细胞受体（TCR）复合物中的CD3ζ链，在CAR与抗原结合后促进T细胞的活化。第三个共刺激域则用于增强T细胞的功能、植入能力、代谢活性及持久性。CAR-T细胞疗法在多种造血系统恶性肿瘤（包括B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和多发性骨髓瘤）中的成功应用，凸显了该策略的治疗潜力1,2,3,4,5,6。近期美国食品药品监督管理局（FDA）批准了两种靶向CD19的CAR-T细胞疗法——用于儿童及年轻成人ALL的替沙格列克（tisagenlecleucel）和用于弥漫性大B细胞淋巴瘤的阿基仑赛（axicabtagene ciloleucel），进一步证实了CAR-T细胞疗法的转化医学价值。

CAR T 细胞治疗策略包括从外周血中分离 T 细胞，进行激活、遗传修饰，并在体外扩增。分化程度是调控 CAR T 细胞疗效的重要参数。因此，在体外培养过程中限制 T 细胞的分化，可增强输注产物的植入能力、扩增能力及持久性，从而在过继性转移后实现长期的免疫监视2,7,8,9。T 细胞包含若干不同的亚群，包括：初始 T 细胞（Tn）、中央记忆 T 细胞（Tcm）、效应记忆 T 细胞（Tem）、效应分化 T 细胞（Tte）以及干细胞样记忆 T 细胞（Tscm）。效应分化 T 细胞具有强大的细胞溶解能力，但其寿命较短且植入能力较差10,11,12。相比之下，具有较低分化表型的 T 细胞，如初始 T 细胞和 Tcm，在过继性细胞转移后表现出更优的植入和增殖能力13,14,15,16,17,18。制备前采集的 T 细胞在不同患者间的组成可能存在差异，且与 CAR T 细胞的治疗潜力相关。起始单采产品中具有初始样免疫表型的 T 细胞比例，与细胞植入效果和临床应答均高度相关19。

培养时间是影响用于过继性转移的CAR T细胞分化的重要参数。我们近期开发了一种通过缩短培养周期来制备高质量CAR T细胞的方法20。利用该方法，我们证明了在白血病异种移植模型中，较短的培养时间可产生效应功能更强且在过继转移后具有更优持久性的CAR T细胞。本文介绍了稳定制备CART19细胞（即经基因工程改造以表达抗CD19单链可变区片段并连接CD3ζ和4-1BB信号结构域的自体T细胞）的技术方法，并详细描述了在过继转移前用于评估CAR T细胞生物学活性和功效的多种检测手段。

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方案

所有动物实验均经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. T细胞激活、转导与扩增

  1. 在6孔细胞培养板中，按每3个磁珠对应1个T细胞的比例，将新鲜或冻存的原代人T细胞与抗CD3/CD28磁珠（例如Dynabeads）混合，以激活T细胞。使用添加了5%正常人AB血清、2 mM L-谷氨酰胺、20 mM HEPES和IL-2（100单位/mL）的X-VIVO 15培养基培养T细胞。扩增期间维持T细胞浓度为106个T细胞/mL。在37 °C、20% O2、95%湿度及5% CO2条件下培养T细胞。
  2. 过夜刺激后，向活化的T细胞中加入慢病毒上清液。计算所需上清液体积，以达到3−5的感染复数（MOI）。
    注意： CD19-BBζ CAR慢病毒质粒包含CD8铰链区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域21。CD19-BBζ慢病毒上清液的制备方法如前所述21。
  3. 第3天，取部分细胞样品用于冻存。冻存前，通过轻柔吹打和磁性分离去除磁珠。配制含0.5%二甲基亚砜（DMSO）的磷酸盐缓冲液（PBS），4 °C保存备用。
    1. 将T细胞以300 × g离心5分钟。弃去上清液，加入5 mL PBS。再次以300 × g离心5分钟，弃去PBS。
    2. 将细胞沉淀重悬于1 mL预冷的冻存液中。将T细胞置于预冷的冻存盒中，于-80 °C保存48小时，随后转移至液氮中长期保存。
  4. 用5 mL PBS洗涤剩余T细胞一次，以去除残留的病毒载体。以300 × g离心5分钟，弃去PBS，将细胞沉淀重悬于T细胞培养基中，调整细胞浓度至0.5 × 106个细胞/mL。
  5. 将T细胞分为两份培养物，分别用于第5天和第9天的实验。使用计数微球（材料表）以及针对人CD4和CD8的单克隆抗体和活细胞染料（材料表），通过流式细胞术对T细胞进行计数。
    1. 为测定T细胞浓度，配制主混合液：500 µL PBS、5 µL计数微球、10 µL 7-氨基放线菌素D（7-AAD）活细胞染色液、4 µL CD4-FITC和4 µL CD8-APC。向主混合液中加入40 µL T细胞，通过流式细胞术根据活T细胞与微球的数量比例测定细胞浓度。每隔一天补充培养基，维持培养物细胞浓度为0.5 × 106个细胞/mL。
  6. 第5天，按照步骤1.3和1.5所述方法，对第5天的培养物进行计数并冻存。
  7. 第7天，用PBS洗涤0.5 × 106个T细胞，并重悬于100 µL荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液中。使用荧光标记的抗CAR19独特型抗体通过流式细胞术检测CAR表面蛋白的表达。
  8. 第9天，对第9天的培养物进行计数，并按照步骤1.3所述方法进行冻存。

2. T细胞分化的表型评估

  1. 配制主混合液，包含预滴定的以下抗体：抗-CD3–BV605（克隆株 OKT3）、抗-CD14–Pacific Blue（PB）（克隆株 HCD14）、抗-CD19–PB（克隆株 HIB19）、抗-CD4–BV510（克隆株 OKT4）、抗-CD8–H7APC（克隆株 SK1）、抗-CCR7–FITC（克隆株 150503）、抗-CD45RO–PE（克隆株 UCHL1）、抗-CD27–PE-Cy7（克隆株 1A4CD27）、抗-CD95–PerCP-Cy5.5（克隆株 DX2）以及抗-CAR19-APC。
  2. 为抗-CD45RO–PE、抗-CCR7–FITC、抗-CD27–PE-Cy7 和抗-CD95–PerCP-Cy5.5 分别制备单独的荧光减一（FMO）对照，以区分阳性染色细胞与背景信号。
  3. 将活/死细胞染色原液（材料表）用 PBS 按 1:10,000 比例稀释，制备死细胞染色溶液。
  4. 解冻先前冻存的第3天、第5天和第9天的T细胞。将每组1 × 106个T细胞在300 × g下离心3分钟。弃去上清液。用PBS洗涤细胞一次，在300 × g下离心3分钟，弃去PBS。
  5. 将T细胞与死细胞染色液在室温（RT）避光条件下孵育15分钟。
  6. 加入1 mL FACS缓冲液以淬灭死细胞染色荧光。在300 × g下离心3分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 µL含步骤2.1和2.2所述抗体混合物的FACS缓冲液中，4 °C孵育1小时。
  7. 加入1 mL FACS缓冲液，在300 × g下离心3分钟，洗去未结合的抗体。重复用FACS缓冲液洗涤三次。
  8. 将细胞重悬于1%多聚甲醛（PFA）中，4 °C保存。
  9. 由于固定后CD45RO表达下降，应在免疫染色后尽快通过流式细胞术分析样本。为评估T细胞分化状态，按以下顺序设门：单细胞（FSC-H vs FSC-A）、活CD3+ T细胞（排除门 [活/死染料、CD14-PB和CD19-PB vs CD3-BV605]，CD4-BV510 vs CD8-APC-H7）。在CD4+和CD8+亚群中，以CD45RO-PE vs CCR7-FITC设门，定义类初始T细胞（CD45RO-CCR7+）、中央记忆T细胞（Tcm，CD45RO+CCR7+）、效应记忆T细胞（Tem，CD45RO+CCR7-）和终末效应T细胞（Tte，CD45RO-CCR7-）。为鉴定干细胞样记忆T细胞（Tscm），在类初始T细胞群体中设门选择CD27+细胞；在此亚群中，Tscm为CD95+，而初始T细胞（Tn）为CD95-。

3. 体外功能分析

  1. CAR T细胞增殖与细胞因子分泌
    1. 通过流式细胞术，按照步骤1.5和1.7所述方法验证CAR表达水平及细胞活力。
    2. 用PBS洗涤每组5 × 106个T细胞（第3天、第5天和第9天），然后重悬于含1 µM羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）的PBS溶液中，室温孵育3.5分钟。
    3. 立即加入含10%胎牛血清（FBS）的PBS 10 mL以终止反应。
    4. 以300 × g离心3分钟，弃上清液，并重复洗涤步骤三次。使用库尔特计数器（材料表）在CFSE染色结束后对细胞进行计数。
    5. 收集CFSE染色的细胞（未刺激组），重悬于1%多聚甲醛（PFA）中，4 °C保存，用于后续流式细胞术分析。
    6. 将适量CFSE染色的CAR T细胞与经辐照的K562-CD19（靶细胞）以及K562野生型（对照）细胞按1:1比例混合，在无细胞因子培养基及步骤1.1所述培养条件下共培养120小时。
    7. 培养24小时后，以300 × g离心5分钟，收集120 µL细胞上清液。根据制造商推荐方法，通过Luminex分析检测活化依赖性产生的IL2、IFNγ、TNFα、GM-CSF及其他炎症性细胞因子（IL1β、IL4、IL5、IL6、IL8和IL10）。
    8. 用等体积（120 µL）的新鲜培养基替换步骤3.1.7中收集的上清液体积。
    9. 第3天（即96小时后），使用基于微球的流式细胞术（如步骤1.5所述）对细胞进行计数，并以0.5 × 106个细胞/mL的浓度重新补液。
    10. 第5天，计数活CD3+细胞，并计算相对于第0天活T细胞数量的扩增倍数。
    11. 使用FlowJo软件对分裂中的CAR T细胞CFSE稀释情况进行全面分析，以显示连续的细胞分裂轮次。
      注：增殖实验在FlowJo操作手册中有详细描述。
  2. 细胞毒性实验
    注：采用51Cr释放实验评估CART19细胞杀伤表达CD19靶细胞的能力。
    1. 将5 × 105个K562-CD19细胞、K562野生型对照细胞或NALM6白血病细胞与50 µL Na251CrO4及0.5 mL含10% FBS的RPMI培养基混合，在37 °C培养箱中孵育90分钟，以标记靶细胞。
    2. 以300 × g离心2.5分钟，将放射性上清液弃入专用废液容器中，并用5 mL PBS洗涤靶细胞，重复洗涤两次。
    3. 将靶细胞重悬于含5% FBS的酚红无培养基中。后续所有步骤均使用该培养基以降低背景信号。
    4. 通过流式细胞术评估CAR表达和细胞活力（如第5.1节所述）后，将CAR T细胞与标记的靶细胞按效应细胞:靶细胞（E:T）比例10:1、3:1和1:1设置三复孔，混合后转移至96孔U型底板。
    5. 同时设置仅含靶细胞的组以及靶细胞加1%十二烷基硫酸钠（SDS）的组，分别用于测定自发性（S）和最大（M）51Cr释放量。
    6. 以300 × g离心5分钟后，在37 °C、5% CO2培养箱中孵育4小时或20小时。
    7. 在指定时间点，以300 × g离心5分钟，收集35 µL细胞上清液转移至检测板中，避免产生气泡。让检测板过夜干燥。
    8. 使用标准封板膜密封检测板，用液体闪烁计数器进行计数。上清液中的铬含量可反映靶细胞杀伤程度。特异性裂解百分比计算公式如下：100 ×（实验组每分钟计数[cpm] – 自发释放组cpm）/（最大释放组cpm – 自发释放组cpm）。

4. 体内功能分析

  1. 获取6−10周龄的NOD-SCID γc–/–（NSG）小鼠，该品系缺乏适应性免疫系统，并将其随机分配至治疗组或对照组。
  2. 通过尾静脉将1 × 106个NALM6细胞溶于0.1 mL无菌PBS中，静脉注射至小鼠体内。
  3. 注射后5−7天，通过生物发光成像（BLI）确认肿瘤移植情况。向经异氟烷麻醉（体积根据体重调整）的小鼠注射150 mg/kg的D-荧光素酶底物。
  4. 使用成像系统测量生物发光值。通过在每只小鼠周围绘制相同面积的矩形（从头部至尾部长度的50%），使用相应软件定量总荧光通量。对每张图像单独扣除背景信号。
  5. 在白血病模型建立后，通过尾静脉注射3 × 106个第9天收获的CART19细胞、0.5 × 106个第3天收获的CAR T细胞，或相应数量的非转导（NTD）人源T细胞，总体积为100 µL无菌PBS/Ca2+。
    注意：由于在培养过程中不同时间点收获的细胞生物活性存在差异，第3天细胞的使用浓度低于第9天细胞。
  6. 为评估疾病进展，按照步骤4.3所述方法，每周两次测量生物发光值。
  7. 为评估CAR T细胞的移植情况，通过眼后静脉采血，收集75 µL血液至EDTA包被的采血管中。将50 µL血液转移至绝对计数管中。
  8. 使用抗CD45、CD4、CD8和CAR抗体在室温下避光孵育30分钟进行染色。向管中加入400 µL 1× FACS裂解液，充分涡旋混匀。染色完成后，通过流式细胞术分析血液中表面标志物的表达。
    注意：可使用其他表面标志物评估血液中T细胞的分化状态和耗竭状态。
  9. 为检测血液中细胞因子水平，将血液在4 °C条件下以1,200 × g离心30分钟，分离血清层。
  10. 收集血清，并根据制造商说明书使用指定的读板试剂盒检测细胞因子水平。

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结果

采用上述方法，我们对T细胞进行了刺激与扩增，培养时间为3天或9天（图1A,B）。我们还通过检测细胞表面表达的不同糖蛋白，分析了其分化特征，具体分群策略如图1C所示。结果显示，在体外培养过程中，T细胞随时间推移逐渐向效应细胞表型转变（图1D）。我们评估了CAR T细胞在抗原刺激下的效应功能和增殖能力，发现培养时间较短（较早收获）的细胞在功能上优于长期培养的细胞。与培养9天的细胞相比，第3天收获的CART19细胞在再次受到相应配体刺激时，表现出更强的增殖能力和细胞杀伤活性（图2A,B）。

在一种人源异种移植小鼠急性淋巴细胞白血病（ALL）模型中，我们比较了第3天与第9天收获的CAR T细胞的效力（

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讨论

本文介绍了在体外培养的不同时间点收获CAR T细胞后，评估其功能和效力的方法。我们的方法全面阐述了用于体外评估CAR T细胞增殖能力及效应功能的实验方案。我们描述了通过CAR刺激后检测CAR T细胞活性的方法，并详细说明了使用对数扩增期第3天与第9天收获的CAR T细胞建立的白血病异种移植模型。

在比较体外扩增不同时间点收获的CAR T细胞疗效时，存在固有的挑战。由于3天培养周期内产生的T细胞数量较少，可能不足以全面评估其功能。这一问题在患者来源的T细胞中尤为突出，因为这些细胞的增殖能力常因内外因素而减弱20。

考虑到第3天的CAR T细胞相比处于对数增殖期末期的第9天细胞具有更强的代谢和增殖能力，应输注多少CAR T细胞？我们估算了第3天的CAR T细胞在体外再培养6天后可达到3 × 106的数量，并据此确定应输注的第3天CAR T细胞数量（0.5 × 106），以实现与第9天细胞的等效比较。因此，我们采用“压力测试”策略来比较输注后...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了诺华制药通过与宾夕法尼亚大学的研究合作（Michael C. Milone）提供的资助，以及圣巴尔德里克基金会学者奖（Saba Ghassemi）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗CD3/CD28 Dynabeads赛默飞世尔科技40203D
APC 小鼠抗人 CD8BD 生物科学555369RRID:AB_398595
APC-H7 小鼠抗人 CD8 抗体BD Biosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS溶血溶液 10倍浓缩液BD 生物科学349202
BD Trucount 绝对计数管BD 生物科学340334
Brilliant Violet 510 抗人 CD4 抗体BioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 抗人 CD3 抗体BioLegend317322RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒Life TechnologiesC34554
CountBright 绝对计数微球，InvitrogenC36950
FITC 标记抗人 CD197（CCR7）抗体BD Pharmingen561271RRID:AB_10561679
FITC 标记小鼠抗人 CD4BD 生物科学555346RRID:AB_395751
HEPESGibco15630-080
人AB型血清Valley BiomedicalHP1022
人IL-2免疫印迹，优质级Miltenyi130-097-744
L-谷氨酰胺Gibco28030-081
液体闪烁计数器，MicroBeta TriluxPerkin Elmer
LIVE/DEAD 可固定紫染料分子探针L34964
Multisizer 库尔特计数器贝克曼库尔特
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
太平洋蓝染料标记的抗人CD14抗体BioLegend325616RRID:AB_830689
太平洋蓝染料标记的抗人CD19抗体BioLegend302223
PE 抗人 CD45RO 抗体BD 生物科学555493RRID:AB_395884
PE/Cy5 抗人 CD95（Fas）抗体BioLegend305610RRID:AB_493652
PE/Cy7 抗人 CD27 抗体贝克曼库尔特A54823
无酚红培养基Gibco10373-017
10% UltraPure SDS 溶液Invitrogen15553027
微电极探针BD 生物科学555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-荧光素钾盐Perkin Elmer122799

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