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方法文章

小鼠神经干细胞及脑组织中5-羟甲基胞嘧啶的检测

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DOI：

10.3791/59950

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2019年9月19日

 ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用免疫荧光染色和DNA点杂交方法检测细胞和脑组织中5-羟甲基胞嘧啶的实验方案。

摘要

在哺乳动物基因组中已发现多种 DNA修饰。其中，5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶介导的表观遗传机制已被广泛研究。5-羟甲基胞嘧啶在胚胎期及出生后脑发育过程中表现出动态变化特征，参与基因表达的调控，并与多种神经系统疾病相关。本文详细描述了包括免疫荧光染色和 DNA点杂交在内的多种方法，用于检测小鼠培养细胞及脑组织中的5-羟甲基胞嘧啶。

引言

表观遗传修饰，包括DNA修饰、组蛋白修饰和RNA修饰，在多种生物学过程和疾病中发挥着重要的功能1,2,3,4,5,6,7。长期以来，DNA甲基化（即5-甲基胞嘧啶（5-mC））被认为是一种高度稳定的表观遗传标记，在基因组中不能再被进一步修饰。最近研究发现，5-mC可由TET（Ten-eleven translocations）家族蛋白（包括TET1、TET2和TET3）氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）8,9。进一步研究表明，5-hmC可作为一种稳定的表观遗传标记，通过调控基因表达发挥生物学功能4,10,11,12。

目前的证据表明 5-hmC 在哺乳动物的神经元组织/细胞中相较于其他组织类型显著富集，并在神经元发育过程中表现出动态变化特征13,14. 在 在神经系统中，5-hmC介导的表观遗传修饰在调控神经干细胞、神经元活性、学习与记忆过程中发挥重要作用，并参与多种神经系统疾病，包括Rett综合征、自闭症、阿尔茨海默病、亨廷顿病等。2,13,15,16,17,18,19,20.

目前有多种方法可用于检测细胞和组织中的5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）14,21,22,23,24。本文介绍了两种用于检测5-hmC的存在并定量其整体水平的方法：免疫荧光染色和DNA点杂交（dot-blot）。这两种方法操作简便且灵敏度高，已在先前的研究中成功应用25,26,27,28,29,30。这两种方法的关键步骤均为DNA变性。对于5-hmC的免疫荧光染色，样品需用1 M HCl进行预处理；而对于5-hmC点杂交，则使用 NaOH溶液进行DNA变性。结合下一代测序技术，这些方法是研究5-hmC功能的有力工具。

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方案

所有动物实验均已获得浙江大学动物伦理委员会的批准。

1. 成年神经干细胞与神经元的培养

  1. 按照先前所述方法，从成年（8-10周龄）C57/BL6雄性小鼠前脑中分离成年神经干细胞31,32。
  2. 在含20 ng/mL FGF-2、20 ng/mL EGF、2% B27添加剂、1%抗生素-抗真菌剂和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养成年神经干细胞。按照先前所述方法，使用1 µM视黄酸和5 µM佛司可林诱导成年神经干细胞分化48小时31,32。
  3. 从胚胎第17天（E17）小鼠海马组织中分离神经元，并在含0.25% L-谷氨酰胺、0.125% GlutaMax和2% B27添加剂的Neurobasal培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养，方法同前33。

2. 小鼠经心脏灌注

  1. 实验前一天配制10%水合氯醛、4%多聚甲醛（PFA）和磷酸盐缓冲液（PBS），并于4 °C保存。
  2. 使用10%水合氯醛（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉成年雄性或雌性C57 BL/6J小鼠，并通过检查动物的躯体反应确认其已深度麻醉。将小鼠仰卧固定于塑料板上，四肢用胶带固定。
  3. 使用手术剪剪开皮肤，再剪开肌肉组织。用手术剪打开胸腔，暴露心脏，用精细手术剪剪除右心房一小部分。
  4. 使用10 mL一次性无菌注射器，从左心室灌注冰冷的PBS（每只成年小鼠约30 mL）。
  5. 继续灌注4% PFA（每只成年小鼠约在10分钟内灌注30 mL），直至小鼠身体变僵硬。
  6. 使用骨钳打开小鼠颅骨，取出脑组织，放入含有5 mL 4% PFA的15 mL离心管中，于4 °C进行后固定。
    注意：手术结束后清洁手术区域。
  7. 至少24小时后，将脑组织转移至30%蔗糖溶液中，于4 °C完成彻底脱水。

3. 脑切片

  1. 将脑组织样本置于小容器中的最佳切割温度包埋剂（OCT）中，并在 -20 °C 下冷却至少 1 小时。
  2. 使用冷冻切片机将脑组织样本切成 20–40 μm 厚的切片。
  3. 将切片收集至磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在 4 °C 下保存。

4. 免疫荧光染色

  1. 挑取含有目标脑区的切片，放入盛有 PBS 的 24 孔板中。对于盖玻片上的培养细胞，直接进入步骤 4.2。
  2. 在室温下于摇床上用 PBS 洗涤 10 分钟，重复此步骤两次。
  3. 吸除 PBS，加入预热的 1 M HCl，在 37 °C 下处理 30 分钟。
    注意：在通风橱中，将 1 mL 盐酸（36–38%）加入 10 mL 水中配制 1 M HCl。将 1 M HCl 在 37 °C 培养箱中预热。
  4. 用 PBS 洗涤样品 5 分钟，重复此步骤两次。
  5. 在摇床上室温孵育 1 小时，用含 3% 正常山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 PBS 封闭样品。
  6. 在摇床上于 4 °C 下与特异性一抗抗体孵育过夜。
    注意：使用以下一抗抗体：兔多克隆抗体抗 5-羟甲基胞嘧啶（1:5,000）、小鼠单克隆抗体抗 NeuN（1:500）。
  7. 取出样品，在室温下继续孵育 1 小时。
  8. 在摇床上用 PBS 洗涤 10 分钟，重复此步骤两次。
  9. 在摇床上室温下与对应一抗的二抗抗体孵育 1 小时，用铝箔覆盖孔板。
    注意：使用以下二抗抗体：Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG（1:500）、Alexa Fluor 568 标记的山羊抗小鼠 IgG（1:500）。用 4′-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染。
  10. 在摇床上用 PBS 洗涤 10 分钟，重复此步骤两次。
  11. 将脑切片贴附于载玻片上，加入适量抗荧光淬灭封片剂（约 100–150 μL），盖上优质盖玻片，用指甲油封片。
  12. 使用普通荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜拍摄图像。

5. 基因组DNA提取

  1. 通过颈椎脱位法处死一只成年 C57 BL/6J 小鼠（雄性或雌性），并取出脑组织。
  2. 在冰上冷却的培养皿中分离海马、皮层和小脑组织。用组织研磨器在 1 mL DNA 裂解缓冲液中研磨组织，转移至洁净的微量离心管中。每 600 μL 裂解缓冲液加入 250 μg 蛋白酶 K。对于细胞沉淀，直接加入裂解缓冲液和蛋白酶 K，并充分混匀。
    注意：DNA 裂解缓冲液的配制：5 mM EDTA、0.2% SDS、200 mM NaCl 溶于 100 mM Tris-HCl 中，pH 8.5。实验前清洗并高压灭菌组织研磨器。
  3. 第二天，每个样本加入约 50 μg RNase A，在 37 °C 下孵育至少 12 小时。
  4. 加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分混匀。
  5. 在 20,817 x g 条件下离心 15 分钟，将上清液转移至新的微量离心管中。
  6. 向上清液中加入 600 μL 氯仿以沉淀 DNA，并充分混匀。
  7. 在 20,817 x g 条件下离心 15 分钟，将上清液转移至另一新的离心管中。
  8. 向上清液中加入 500 μL 异丙醇，并充分混匀。
  9. 在 20,817 x g 条件下离心 15 分钟，彻底弃去上清液。
  10. 用 1 mL 70% 乙醇洗涤沉淀，在 20,817 x g 条件下离心 1 分钟，彻底弃去上清液。重复一次。
  11. 将 DNA 沉淀完全干燥。
  12. 用 Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5）将 DNA 沉淀溶解至适当浓度。

6. DNA 点印迹

  1. 配制溶液：2 M NaOH、Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5）、6× 柠檬酸钠盐水（SSC）。
  2. 按照表1配制样品混合液。
  3. 将DNA样品在100 °C下变性10分钟，然后置于冰上冷却。
  4. 裁剪适当大小的尼龙膜（例如 Hybond-N+），并用6× SSC冲洗。
  5. 将膜置于点印迹装置上，并连接真空泵。每点点样6 μL混合液。
  6. 在80 °C下杂交30分钟，然后用含脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（TBS）在室温封闭膜1小时。
  7. 加入一抗，4 °C孵育过夜。
    注意：使用以下一抗：兔多克隆抗5-羟甲基胞嘧啶抗体（1:5,000）。
  8. 第二天，将样品膜在室温孵育1小时，用TBS洗涤10分钟，重复洗涤两次。
  9. 加入抗兔二抗（1:5,000），室温孵育30分钟。
  10. 用TBS洗涤10分钟，重复洗涤两次。
  11. 显影化学发光信号，并对信号强度进行定量分析。

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结果

为了揭示5-hmC在成年小鼠海马体中的分布情况，我们使用了针对神经元细胞（NeuN）和5-hmC的抗体进行免疫荧光染色。在海马体中，5-hmC与神经元细胞标志物NeuN共定位良好（图1A-H），提示5-hmC在神经元中富集。

为了确定5-hmC在神经元发育过程中的动态变化，首先对从增殖期和分化期成体神经干细胞（NSCs）中分离的DNA样本进行了点印迹分析。点印迹结果显示，NSC在分化过程中5-hmC的整体水平显著升高（图2A-B）。此外，点印迹结果还显示，神经元中的5-hmC水平显著高于NSCs（图2C-D），提示在神经元发育过程中存在动态的5-hmC修饰。

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讨论

表观遗传修饰在大脑的发育、成熟和功能中发挥着至关重要的作用。作为DNA修饰的一种稳定标记，动态的5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）可响应行为适应和神经元活动，并与基因表达呈正相关；因此，它参与了大脑的正常功能以及神经系统的疾病过程4。为了探究其在细胞和组织中的功能，有必要检测5-hmC的存在，并比较处理前后的水平变化。本文中，我们展示了两种在细胞和组织中检测5-hmC的便捷方法，这些方法可在实验室常见的设备条件下完成。

使用免疫荧光染色和DNA点杂交检测5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的关键试剂是5-hmC抗体。本方法所用的5-hmC抗体已被证实具有高灵敏度和高度特异性。进行5-hmC染色时，需要使用盐酸（HCl）进行DNA变性。组织和细胞经HCl处理的条件是否恰当，对实现完全的DNA变性至关重要，并直接影响实验结果。DNA点杂交是一种灵敏的定量5-hmC含量的方法，且比质谱法更为便捷。要成功完成点杂交，必须将DNA样本精确地点样到膜上。此外，亚甲蓝染色有助于判断DNA样本是否等量上样。需要注意的是，本文所述方法检测的是多种细胞和组织中5-...

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披露

不存在竞争性财务利益。

致谢

XL 部分受国家关键研发计划资助&中国国家重点研发计划（2017YFE0196600）和国家自然科学基金（项目编号：31771395，31571518）。Q.S. 受中国国家重点研发计划（2017YFC1001703）和浙江省重点研发计划（2017C03009）资助。W.X. 受浙江省自然科学基金（LY18H020002）和浙江省科学技术厅（2017C37057）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Sigma-AldrichD8417
Adobe Photoshop 软件Adobe Inc./
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgGThermo FisherA11008
Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgGThermo FisherA11001
抗5-羟甲基胞嘧啶抗体Active Motif39769
抗NeuN抗体MilliporeMAB377
B27 添加剂Gibco12587-010
B27 添加剂Gibco12580-010
B27 添加剂Gibco17504-044
冷冻切片机LeicaCM1950
DMEM/F-12 培养基OmegaScientificDM25
表皮生长因子PeproTech100-15
成纤维细胞生长因子-基础型PeproTech100-18B
佛司可林Sigma-AldrichF6886
GlutaMaxThermo35050061
L-谷氨酰胺Gibco25030-149
Neurobasal 培养基Gibco21103-049
正常山羊血清Vector LaboratoriesZ0325
尼龙膜（Hybond™-N+）Amersham BiosciencesRPN303B
OCT 包埋剂Leica14020108926
青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）Gibco15140-122
苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）Sigma-Aldrich516726
聚-D-赖氨酸SigmaP0899-10
蛋白酶KVVR39450-01-6
视黄酸Sigma-AldrichR2625
Triton X-100SolarbioT8210

参考文献

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