利用硫代尿嘧啶从酵母Saccharomyces cerevisiae中灵敏且特异性地纯化新转录的RNA。
本文内容
摘要
摘要
核酸类似物4-硫尿嘧啶（4tU）可被细胞快速摄取，并在体内转录过程中掺入RNA中, 通过将生物素基团连接到掺入的硫代基团上，并利用链霉亲和素包被的磁珠进行亲和纯化，从而实现对短时间标记期间所产生的RNA的分离。获得高产量且不含预先存在RNA的纯净新生RNA，使得更短的标记时间成为可能，并提高了动力学研究的时间分辨率。本方案适用于新生RNA的高特异性、高得率纯化。本文所述方案详细介绍了从酵母中提取RNA的方法 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 然而，一旦从细胞中提取出总RNA，该硫醇化RNA的纯化方案应适用于来自任何生物体的RNA。所获得的纯化RNA可用于多种常用技术进行分析，如逆转录-qPCR、RNA-seq和SLAM-seq。该技术具有高度的特异性、灵敏性和灵活性，可为RNA代谢研究提供前所未有的深入见解。
引言
RNA具有动态特性；在转录产生后不久，大部分RNA会迅速被加工和降解。目前，大多数关于RNA代谢的研究分析的是细胞内的总RNA，这类RNA主要是已完全加工且处于稳态水平的分子。该稳态水平取决于转录速率、转录后成熟过程与降解速率之间的平衡。要分析达到稳态平衡的各个过程，则需要采用专门的技术来捕获寿命极短的RNA分子。
利用核苷酸类似物（如4-硫尿嘧啶（4tU）或4-硫尿苷（4sU））对RNA进行代谢标记（参见Duffy等人的优秀综述1），能够分离出硫标记的新生RNA及其加工中间产物。然而，已发表的实验方案通常需要数分钟的标记时间2,3，相对于许多转录本的生成速率而言较慢。转录一个平均长度的酵母基因大约需要一分钟，因此对酵母RNA进行短于一分钟的标记可被视为极短时间标记。极快速且特异性的4-硫尿嘧啶标记法（ers4tU）通过最大化4tU的掺入并最小化未标记的预存RNA的回收，显著提高了信噪比，从而使极短时间的标记成为可能4。
硫代修饰的碱基必须快速且足量地导入细胞，以高效标记新合成的RNA（nsRNA）。为此，需将细胞培养在无尿嘧啶的培养基中，并通过表达适当的通透酶来促进4tU或4sU的摄取（适合的通透酶基因载体列表见表1，相关补充信息见补充图1）。4tU可溶于氢氧化钠，因此无需使用其他核苷类似物所需的有毒有机溶剂。然而，已有研究发现，长时间使用浓度高于50 µM的硫代修饰核苷培养细胞会破坏核糖体结构5。但本实验所采用的浓度（10 µM）以及极短的标记时间可将不利影响降至最低5（图1a），同时仍能获得足量的RNA用于分析。
该技术可与快速且特异的生长素介导的目标蛋白降解方法6,7（图2）相结合，称为“β-est AID 4U"方案，其中β-雌二醇调控的生长素诱导降解标签（AID）系统与4tU标记技术联合使用。采用β-est AID 4U方法，可实现目标蛋白的耗竭，并能密切监测其对RNA代谢的影响（图2）。实验时机至关重要；建议观看配套视频，并仔细参考图2及其动态形式（见补充图2）。
为了获得准确的时间分辨率，必须极快速地停止RNA的加工和降解过程。这可通过低温下的甲醇处理实现，甲醇能够非常迅速地固定细胞内容物并破坏细胞膜，同时保持核酸的完整性8。RNA提取过程应高效且不损伤RNA。在不存在变性剂的情况下，机械裂解是有效的方法（通常变性剂含有巯基，因此应避免使用）。优先选用氯化锂沉淀RNA，因为tRNA在此条件下的沉淀效率较低。tRNA转录迅速且天然含有硫修饰9，因此去除tRNA可减少其对生物素化试剂的竞争。如果研究目标是小分子、高度结构化的RNA，则推荐使用基于醇类的RNA沉淀方法。
为回收硫醇化RNA，可通过4tU掺入RNA的硫醇基团共价连接生物素。使用经修饰的生物素（通过可裂解的二硫键连接，例如HPDP-生物素（N-[6-(生物素酰胺)己基]马来酰亚胺））h乙基]-3´-(2´-p吡啶基dithio)propionamide 或 MTS-生物素（Methane thiosulfonate）是推荐的选择，因其可通过添加还原剂释放RNA。生物素标记的RNA通过与磁珠偶联的链霉亲和素进行亲和纯化。本方案与此前列出的其他方案类似10 但经过深入优化以降低背景信号。
可以进行两种类型的硫醇标记实验：连续标记和非连续标记。每种方法都有其各自的优势。在连续标记实验中，将4tU加入培养物中，并定期取样。此类实验可显示RNA的加工过程以及随时间推移RNA水平的变化情况。例如，突变体与野生型的比较实验以及脉冲-追踪实验均属于此类。如图3b,c所示的实验即为此类。在非连续标记实验中，首先在系统中诱导某种变化，然后监测RNA的变化。一旦诱导发生变化，必须将培养物分成若干个亚培养物，并在特定时间点对每个亚培养物进行短暂的硫醇标记。一个例子是如图27所示的β-est AID 4U实验。此类实验特别适用于监测代谢变化对RNA加工的影响（见图3d）。
硫代标记实验的图示见图4和图5，此外还提供了一个可极大简化实验流程操作的电子表格（见4tU experiment template.xlsx）。同时，补充信息中包含详细的故障排除指南。对于将4tU标记与生长素诱导降解（AID）技术结合的β-est AID 4U实验方案，请参见图2和Supplementary Figure 2。有关详细的AID降解方案，请参见Barrass等人的文献7。
方案
1. 生长与硫代标记
注意：本方案此部分的完成时间因细胞生长速率而异。在硫代标记前预留1小时准备溶液和设备，标记后预留30分钟处理样品。
- 确保 S. cerevisiae 菌株含有编码通透酶的质粒（表1），以增强4tU进入细胞的效率。
注意：若无导入蛋白，标记时间少于2分钟通常难以成功11（参见补充图1）。若在不含尿嘧啶的培养基中培养，4tU的掺入效率更高，因此菌株必须为 URA3+；表1 中多个质粒携带 URA3 作为筛选标记。若本方案需与β-est AID降解技术7联用，则需额外的菌株改造。 - 通过将6.9 g无氨基酸酵母氮源基础培养基、20 g葡萄糖和1.92 g SCSM单缺−ura（材料表）加入1 L水中，配制无尿嘧啶的YMM培养基。使用前对培养基进行高压灭菌或过滤除菌。
注意：推荐采用过滤除菌，因为高压灭菌过程中产生的肽/糖复合物会在后续样品收集时与甲醇中的细胞共沉淀。 - 将酵母在无尿嘧啶YMM培养基中培养至600 nm处光密度（OD600）为0.6−0.8。确保培养物处于对数生长期，并已至少经历两次倍增。通常推荐在30 °C下培养，但也可使用其他温度，例如适用于温度敏感型菌株的情况。
注意：根据菌株类型、培养条件和RNA得率，大约需要30 mL样品体积。本方案后续均以此量为基础。30 mL培养液与20 mL甲醇共同置于50 mL离心管中为最适优化起始体积。为提高早期时间点的RNA回收率，可考虑增加样品体积，对于生长缓慢的细胞在极短标记时间（<1分钟）下，曾使用高达2000 mL的体积。 - 将约50 mL H2O置于冰上预冷。每个样品取200 µL氧化锆珠加入2 mL螺口管中，并置于冰上冷却。同时将20 mL甲醇（注意）加入50 mL离心管中，并置于干冰上（注意）。甲醇体积应为样品体积的1/3至2/3。
注意：甲醇经吸入、接触或摄入具有毒性。大量操作应在通风橱中进行，并佩戴两层手套，因甲醇可穿透腈类实验手套。甲醇高度易燃，应远离所有点火源。
注意： 干冰接触可导致冻伤，并释放窒息性气体，操作时应佩戴手套，并在通风良好的环境中使用。
注意：在此阶段加入珠子比在加入样品后更方便，因为此时管内干燥；此外，在离心收集细胞沉淀时，珠子也会随沉淀一同被甩离管螺纹，节省后续操作时间。同时，这也有利于珠子在加入样品前充分冷却。 - 若需在培养阶段而非后续步骤中加入 S. pombe 内参 spike，可在冰上解冻一份巯基化 S. pombe 细胞 aliquot，并充分涡旋至少30秒，然后加入培养物中。若按以下说明制备，一份 S. pombe aliquot 可用于400 mL培养液（足够十二个30 mL样品使用，并留有少量余量以应对操作误差）。若培养液体积不同，应相应调整加入的 S. pombe 体积。
- 按照 S. cerevisiae 实验方案所述方法，将1 L S. pombe 培养物培养至OD600恰好为0.8。
- 按步骤1.7进行巯基标记，但标记时间为10分钟。
- 使用干冰上的400 mL甲醇固定全部培养物，基本操作同步骤1.9所述。
- 在3000 x g 条件下离心3分钟，收集细胞沉淀。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于3.3 mL H2O中。
- 分装为每份80 µL的aliquot。于-80 °C保存。
- 每400 mL培养物使用一份aliquot，或每30 mL样品使用10 µL。
注意：若进行RNA测序，应将spike体积减少至1/10。aliquot不可重复使用；未用完的spike应丢弃。该spike有助于在不同时间点和实验间进行结果的标准化与比较。
- 对于非连续标记实验，先诱导所需的代谢扰动（例如改变培养条件、基因诱导或降解如β-est AID7（图2和补充图2）），然后分装培养物。确保所有烧瓶和培养基均处于所需温度，若可能，应在加入培养物前预先通气。
- 向培养物中加入4tU至终浓度10 µmM，并剧烈混匀（加入体积为培养物体积的1/10,000，即100 mM 4tU溶于1 M NaOH的溶液）。进行15秒至5分钟的巯基标记。
注意：30秒是一个良好的起始点。少于20秒的标记由于在时间压力下操作困难，结果变异性较大。然而，超过1分钟的标记会降低该技术的时间分辨率。 - 若进行脉冲追踪（chase）实验，先进行20−30秒的巯基标记，随后通过加入培养物体积1/200的1 M尿苷（非巯基化）进行追踪，终浓度为5 mM。
注意：追踪时优先使用尿苷而非尿嘧啶，因为尿苷水溶性更高，可加入更小体积，从而减少对细胞生长的干扰。 - 在时间进程内定期取样（至少每15秒一次），直至实验结束。短于该间隔的取样难以可靠完成。将样品加入步骤1.4中已准备好的干冰上甲醇中。为方便操作，可将30 mL培养物加入含20 mL甲醇的50 mL离心管中。
注意：低温下二氧化碳会溶解于甲醇中；当加入样品时，气体析出并剧烈起泡，导致样品损失。为避免此问题，应将甲醇在密闭管中冷却至<-70 °C，临近使用时再转移至干冰上。 - 密封管子后充分振荡混匀。将样品置于冰上。检查样品是否冻结；若已冻结，用手轻轻温热并持续倒置。此操作最好用手完成，以便感知样品温度，应始终保持冰凉感。随后放回冰上。此步骤不可暂停；一旦所有样品恢复流动性，应立即进入下一步。
- 在3000 x g 条件下离心2分钟（如可能，温度设为4 °C）以收集细胞沉淀。倾去液体，并通过轻柔吹打将沉淀重悬于至少1 mL预冷的冰水中。
注意：样品沉淀中残留的甲醇有助于重悬。 - 转移至步骤1.4中已准备好的2 mL螺口管中。在>13,000 x g 条件下短暂离心（例如总时间10秒）以重新收集细胞沉淀，放回冰上后弃去液体。
注意：细胞沉淀可在-70至-80 °C下保存数月。
2. 总RNA的制备
注意：完成时间为 90 分钟。
- 使用经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的溶液以防止 RNA 降解。使用滤芯吸头分装溶液，并始终佩戴手套。
- 向溶液中加入 1/1000 体积的 DEPC，并通过剧烈振荡混合。
- 室温（RT）放置 24 小时，然后进行高压灭菌。
- 含有氨基基团的溶液（如 Tris）不能用 DEPC 处理。应将粉末分装并专门保存用于 RNA 实验，使用预先经 DEPC 处理的 H2O 配制溶液。
注意：由于 RNA 上的巯基具有光活化特性，从此时起应尽量减少暴露于紫外光。储存时应避光，孵育最好在带有盖子的 PCR 仪中进行。
- 如果要将 S. pombe 内标加入细胞沉淀而非培养物中（不要同时进行），请在此时加入。将一份巯基化 S. pombe 细胞在冰上解冻，并充分涡旋至少 30 秒，然后加入沉淀中。
注意：若按照步骤 1.5.1−1.5.7 制备，每 30 mL 培养液所得的一个沉淀需加入 10 µL 的 S. pombe 分装液。 - 在盖上管盖前，短暂离心 1−2 秒，确保无氧化锆珠夹在管盖与管壁之间，以免导致样品和苯酚泄漏。
- 通过剧烈涡旋，用 400 µL 醋酸盐 EDTA（AE）缓冲液（50 mM 醋酸钠，pH 5.3，10 mM EDTA，pH 8.0）重悬细胞。加入 40 µL 10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）。不要涡旋，以免 SDS 起泡。
- 若将采用 β-est AID 4U 方案，请取 40 µL 细胞悬液用于蛋白质分析7。再加入 40 µL AE 缓冲液，使总体积恢复至 400 µL。
- 加入 800 µL 低 pH 苯酚（注意安全），涡旋 10 秒。
注意：苯酚具有毒性且通过吸入和接触具有腐蚀性。所有涉及苯酚的操作必须在通风橱中进行，并佩戴两副手套。 - 在均质器（例如 材料表 中所列）中以最低功率设置进行三次、每次 2 分钟的破碎处理。每次均质后将样品置于冰上 2 分钟。
注意：若使用其他均质器，请优化条件。振荡不足会导致得率低；而过度振荡会导致在 260 nm 处吸光度（A260）测定下表观得率升高，但 RNA 可能已降解。推荐使用均质器，但也可采用热苯酚 RNA 纯化法12。 - 将裂解后的样品置于干冰上 5 分钟，直至完全凝固，这有助于减少基因组 DNA 残留进入 RNA。不要冷冻过久，以免样品无法解冻。在微量离心机中于 >13,000 x g 条件下室温离心 5 分钟；切勿在 4 °C 下操作，因为低温会导致样品/苯酚混合物在整个离心过程中保持固态。
注意：若离心结束时样品仍冻结，应再次离心 5 分钟，直至样品完全解冻。 - 先用等体积（约 600 µL）苯酚:氯仿 5:1 溶液进行苯酚/氯仿抽提，再用氯仿（注意安全）抽提。将上层水相转移至另一含有苯酚:氯仿 5:1 或氯仿的试管中。涡旋混匀后，在微量离心机中室温离心 5 分钟。然后将上层水相转移至新的 1.5 mL 管中。
注意：氯仿具有毒性，通过吸入和接触有害。所有涉及氯仿的操作必须在通风橱中进行，并佩戴两副手套。 - 加入三分之一至一半体积（约 300 µL）的 10 M LiCl，混匀以沉淀 RNA。样品应立即变浑浊，继续在冰上或 4 °C 放置至少 10 分钟（不要低于 -20 °C 储存，以免冻结），直至沉淀形成絮状物。
- 在微量离心机中以 >13,000 x g 离心 5 分钟。弃去液体，短暂再离心一次并去除残渣。用 300−500 µL 70% 乙醇洗涤沉淀，短暂离心后去除残留乙醇。
注意：在这些洗涤步骤中，始终保持沉淀位于管壁的同一侧（与第一次离心时相同），以防止沉淀移动或破碎；若破碎，可能导致部分 RNA 意外丢失。
注意： 不要干燥沉淀；只要大部分液体已被去除，就不会干扰后续步骤。此阶段 RNA 可在 -20 °C 保存数月，或在 -70 至 -80 °C 长期保存。 - 将 RNA 沉淀溶于 90 µL TE 缓冲液（pH 7.0，含 10 mM Tris HCl pH 7.0，1 mM EDTA pH 8.0），通过 65 °C 加热并振荡促进溶解，因为 RNA 沉淀可能难以重溶。加热时间必须不超过 5 分钟，因高温会导致 RNA 降解。检查 RNA 是否完全溶解后，转移至 0.2 mL 管中。上下吹打样品，应无"团块"，液体在吸头中应顺畅上升和下降。由于溶液黏稠，最终吹打动作应缓慢。
注意：此阶段 RNA 可避光保存于 -20 °C；这也有助于提高 RNA 的溶解性。
3. 生物素标记
注意：完成时间为 60 分钟。以下步骤可方便地在带有整体管盖的排管中进行，因为与带独立管盖的排管相比，整体管盖在涡旋振荡时更不易松开。
- 通过加入10 µL进行生物素标记（1/10 最终体积）的5 mM HPDP-biotin溶液（MTS-biotin可与HPDP-biotin完全相同的方式使用），加入RNA中并充分混匀。在加入生物素之前，将RNA在65 °C预热不超过数秒钟。于65 °C孵育15分钟至 最大值 在黑暗中孵育30分钟。
注意：由于某些 HPDP 批次在室温下会在 RNA 样本中析出沉淀，因此需要进行此加热步骤。使用带有加热盖的 PCR 仪最为理想。 - 准备小体积凝胶过滤层析柱材料表) 以去除未结合的生物素。移除层析柱底部标签并松开盖子，将其放入 2 mL 离心管中。在 1500 x g 静置1分钟以冲洗缓冲液。将0.3 mL TE缓冲液轻柔加至柱子顶部，再次离心。重复洗涤和离心步骤两次，共完成3次洗涤。最后将洗涤后的柱子转移至新的1.5 mL离心管中。
- 样本孵育（步骤 3.1）完成后，将样本加至柱子顶部。以 1500 x g 用于 2 分钟 生物素标记的RNA样本现位于管底。
注意：1 分钟离心不足以完全洗脱整个样品。 - 加入三分之一至一半体积（约 40 µL）的 10 M LiCl，混匀，使 RNA 重新沉淀，操作同步骤 2.10。样品应立即变浑浊，但需在冰上或 4 °C 放置至少 5 分钟，直至沉淀形成絮状物；切勿在 -20 °C 以下保存，以免冻结。将样品在离心机中以 5 分钟离心 >13,000 × g 在微量离心管中。
- 用80%乙醇洗涤，旋转时间≤1小时。按照步骤2.11的程序尽可能去除液体。
注意：由于 HPDP-生物素在80%乙醇中溶解度很高，因此这是一个额外的纯化步骤。 - 重复使用80%乙醇洗涤，以尽可能去除未掺入的生物素。
注意：RNA 也可在此阶段于 -20 °C 避光保存。
4. 新合成 RNA 的纯化
注意：完成时间为 2 h。
- 将 RNA 重新溶解于 200 µL 经 DEPC 处理的 H2O 中（可使用 65 °C 孵育，类似于步骤 2.12 中的操作）。
- 使用分光光度计在 A260 处测定 RNA 浓度；样品可能需要稀释 1/10，以使其处于分光光度计的线性检测范围内。涡旋震荡该稀释液至少 10 秒，以确保黏稠的 RNA 均匀溶解。
注意：如有需要，可通过点杂交（dot blot）13 评估生物素化效率。 - 向新离心管中加入等量的 RNA，并用经 DEPC 处理的 H2O 补足至 200 µL。使用 RNA 浓度最低的样品的全部体积，并根据其他样品的浓度调整取样体积，使各样品中的 RNA 量相近。
注意：电子表格 4tU experiment template.xlsx 中提供了用于辅助此计算的表格。 - 当样品达到室温后，加入 25 µL 10 x NaTM 缓冲液（0.1 M Tris HCl pH 7.0，2 M NaCl，250 mM MgCl2）、25 µL 1 M NaPi pH 6.8（0.5 M NaH2PO4 和 0.5 M Na2HPO4）以及 2.5 µL 10% SDS。充分混匀后轻轻离心（<30 秒；约 100 x g）。
注意：为避免 SDS 和盐类沉淀，样品在后续操作中直至步骤 4.13 均须保持在室温。 - 配制含 1x NaTM 缓冲液、0.1 M NaPi 和 0.1% SDS 的磁珠缓冲液，每份样品 2 mL。先加入所需量的 H2O，最后加入 SDS。该缓冲液必须每次新鲜配制，因为放置 24 小时后会形成沉淀。
注意：为避免沉淀生成，磁珠缓冲液在后续操作中必须始终保持在室温。切勿进行 DEPC 处理或高压灭菌。 - 向低吸附性 1.5 mL 离心管中加入 50 µL 链霉亲和素磁珠。将离心管置于磁力架上，待磁珠完全沉降后，移除上清液。
- 洗涤链霉亲和素磁珠。
- 加入 200 µL 磁珠缓冲液，涡旋震荡至磁珠沉淀完全重悬。通常仅需 3−5 秒。在加入 RNA 样品前的洗涤步骤中，可通过翻转离心管使磁珠在管壁间来回移动一次即可完成混匀。
- 以低速（约 100 x g）离心最多 5 秒，使液体沉至管底，但磁珠不沉淀。
- 将离心管置于磁力架上，使磁珠被磁铁吸附固定。
- 对于少量样品，可通过抽吸法移除上清液；对于大量样品，可直接倾倒弃去液体。
注意：当样品数量较多时，若仅通过抽吸移除所有液体，可能导致先处理的样品磁珠干燥，而后续样品尚未完成，从而增加背景信号。可在磁力架上同时倾倒所有样品的液体以加快洗涤速度。倾倒前应让磁珠在磁力架上多停留片刻，残留的少量液体仍需抽吸除去。总体而言，此方法可显著缩短磁珠暴露于无液体状态的时间。采用此法可快速完成 24 个或更多样品的处理。
- 用 200 µL 磁珠缓冲液、10 µL 20 mg/mL 甘油、2.5 µL 5 mg/mL tRNA 在室温下封闭磁珠，以中等速度旋转混匀 20 分钟。旋转的目的是保持磁珠悬浮状态。封闭完成后，按步骤 4.7.2−4.7.4 移除液体，并参照第 4.7 节步骤再次洗涤磁珠。
- 将磁珠重悬于样品中，在室温下旋转孵育 30 分钟。
- 在孵育期间，为每份样品准备一个新的 1.5 mL 离心管。加入 1/10 体积（约 10 µL）的 3 M 乙酸钠 pH 5.3 和 20 µg 甘油，以约 100 x g 离心 3 秒。置于样品架中备用。
- 按步骤 4.7.2−4.7.4 移除未结合的 RNA。未结合的 RNA 可保存于新离心管中，但由于含有盐类和 SDS，后续纯化极为困难。随后按第 4.7 节方法用涡旋震荡洗涤磁珠，至少 3 次，最多 5 次。
- 最后一次洗涤后，需特别注意彻底抽吸所有液体；返回每根离心管再次抽吸残留缓冲液。
- 为洗脱 RNA，向磁珠中加入 50 µL 新鲜配制的 0.7 M β-巯基乙醇（βME）（即商品化储存液的 1/20 稀释）。涡旋震荡并短暂离心，操作同步骤 4.7.1 和 4.7.2。将混合物置于磁力架上，用移液器将含 RNA 的溶液转移至步骤 4.10 中准备好的 1.5 mL 离心管中。
- 重复步骤 4.13 再次洗脱，以回收磁珠中残留的 RNA，并将洗脱液加入此前来自同一磁珠的第一次洗脱液管中。
- 通过将样品重新置于磁力架上，并将上清液转移至新的低吸附性 0.5 mL 离心管中，以去除洗脱 RNA 中残留的磁珠。
- 混匀样品后，加入 2.5 倍体积（280 µL）的乙醇再次混匀。于 -20 °C 放置 1 小时至过夜。在预冷离心机（4 °C）中以最大速度（至少 13,000 x g）离心 20 分钟。
- 用 200 µL -20 °C 的 70% 乙醇充分洗涤。由于残留的 βME 会抑制下游实验，每一步均需离心以尽可能去除残留液体；最终样品不应有 βME 气味。
- 用 10−20 µL 经 DEPC 处理的 1x TE 缓冲液重悬 RNA，其中加入相当于 0.005 µL RNase 抑制剂的量。
注意：所有后续操作均应在冰上进行。 - 测定 RNA 浓度和纯度。
- 使用微量样品分光光度计测定 A260 和 A225。
注意：在波长 λ = 225 nm 附近出现的吸收峰是由磁珠带来的不可避免的污染物所致。在无 RNA 的情况下，该污染物在 λ = 260 nm 处的信号衰减至 35%。因此，RNA 实际含量可通过以下公式估算：(A260 - (A225 × 0.35)) × 40 ng/µL。 - 或者，可使用微流控电泳系统（如生物分析仪）对样品进行分析。
注意：此方法优于分光光度法，因其可评估 RNA 完整性，污染物不影响定量结果，且所需样品量更少。
- 使用微量样品分光光度计测定 A260 和 A225。
- 分析新生 RNA（nsRNA）。
注意：例如，可采用标准的逆转录定量 PCR（qPCR）技术对特定 RNA 进行定量。由此制备的 RNA 适用于 RNA-seq 文库构建。对于标记时间少于 5 分钟的实验，无需去除 rRNA。该 RNA 也可用于进行 recoding SLAMseq14 分析。
结果
使用本ers4tU方案回收nsRNA的典型产量如图1b所示，该图由生物分析仪生成，图中曲线显示了RNA产量与其大小（核苷酸[nt]）的关系。请注意，在生物分析仪曲线及插图中的小图中，0时间点回收的RNA量远小于较长时间点回收的RNA量——从约109个细胞中仅回收到约0.3 µg RNA，而相同数量的细胞在标记30秒后即可回收超过两倍的RNA（0.8 µg nsRNA）。15秒时间点的RNA回收量变异性较大，因为取样操作中的微小差异会对RNA回收量产生相对更大的影响。在生物分析仪曲线中，rRNA前体表现为接近1000 nt处的一个峰以及1700−1800 nt处的双峰。随着硫醇化反应的进行，这些中间产物的丰度逐渐增加。
采用硫醇标记法对 ACT1 转录本的剪接进行定量分析（图3）。在开始硫醇标记后，每隔15秒取样，检测 ACT1 RNA 的加工过程（图3a、b）。如图所示，即使仅标记15秒，仍可观察到前体mRNA（通过转录生成）以及套索结构（由前体mRNA剪接的第一步反应生成）。大约在45秒至1分钟时，套索结构和前体mRNA的含量达到平衡状态，其由转录生成的量与通过剪接被加工清除的量相当。
为获得 图3c 所示数据，对该菌株用4tU脉冲标记25秒，随后用尿苷进行追踪。前体mRNA和套索RNA的生成在1分钟时达到峰值。这与 图3b 的结果吻合良好；达到平衡所需时间约为45秒，加上标记的25秒。在达到峰值后，随着硫代标记的RNA经过剪接过程被追踪，其水平逐渐下降。
图3d展示了利用β-雌二醇诱导降解（β-est AID 4U）系统对一种剪接因子蛋白进行耗竭及其对RNA代谢的影响6,7。在此系统中，Prp16p的水平在耗竭25分钟后从接近生理水平下降至原有水平的5%。Prp16p是剪接第二步所必需的剪接因子15。套索RNA（lariats）通常在剪接的第二步被去除（图3a），但当Prp16p变得不足时，套索RNA的积累量超过了前体mRNA的水平。在更长的耗竭时间后，由于次级效应，其他因子也相继变得不足，导致套索RNA水平下降，而前体mRNA水平上升。剪接后的成熟mRNA水平则下降。
图 1：4tU 中的生长情况及 RNA 回收。 (a) 4-硫代尿嘧啶影响细胞生长。在不含尿嘧啶的 YMM 缺陷型培养基中增加 4tU 浓度，会导致携带 p4FuiΔPEST 质粒的 S. cerevisiae (BY4741) 增加倍增时间。在 Tecan Infinite Pro 200 仪器中于 30 °C 下监测四组重复培养物的生长情况。所有培养物在整个实验过程中均处于对数生长期，OD600 介于 0.1 至 0.6 之间。Mock 组为对照组，加入等量 NaOH，其本身不改变生长速率。该图表明，硫醇标记需在快速标记与细胞损伤之间进行权衡。误差线表示四次重复实验的标准误。(b) 新合成 RNA（nsRNA）的产量自约 15 秒标记时间起呈线性增加。主图显示了在加入 4tU 后，每隔 15 秒至 2 分钟内纯化的 nsRNA 的生物分析仪图谱（从 0 秒即未硫醇化样本开始）。注意 15 秒样本未显示，因其与未标记样本无法区分。两个主要峰对应核糖体 RNA（rRNA）。rRNA 前体和中间产物表现为分子量高于成熟 rRNA 的多个小峰，其回收量随时间增加而上升。图中展示的是一个代表性实验的结果。插图显示随着 4tU 孵育时间延长，nsRNA 回收量的变化。随着 4tU 培养时间增加，nsRNA 产量也随之提高。在整个实验时间范围内，回收量呈现显著线性关系（R2 = 0.934），即使在 15 秒标记时，nsRNA 回收量已略高于背景水平，尽管在生物分析仪图谱上肉眼无法与未标记样本区分。误差线表示三次生物学重复实验的标准误。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：β-est AID 4U β-est AID 4U 图文实验方案。 本图展示了β-est AID 4U实验方案的图解概要。β-雌二醇（β-est）可促进生长素诱导型降解决定子（AID）系统的表达，从而导致带有AID*标签的目标蛋白被降解，详细方案请参见Barrass等人的研究7。在此方案中，降解决定子系统的表达在蛋白降解开始前25分钟启动，每个时间点的硫醇化处理持续1分钟。样品在诱导前以及降解过程中每2分钟采集一次。动画版本见补充图2。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：ACT1 RNA 剪接的前体与中间产物。通过定量反转录 PCR 监测 ACT1 前体 mRNA 转录本的剪接过程16。图中显示了 ACT1 前体（pre-mRNA）、中间体套索-外显子2（Lariat）和剪接产物（mRNA）的水平，均以 ACT1 外显子2的水平以及这些RNA的稳态水平进行归一化。(a) qPCR 产物在 ACT1 转录本上的位置。ACT1 转录本剪接反应中用于检测前体、中间体和产物水平的 qPCR 产物位置示意图16。外显子用方框表示，内含子用线条表示，qPCR 产物用两端带菱形的线表示，其颜色与图中使用的颜色一致。pre-mRNA PCR 特异性识别 pre-mRNA，不识别任何剪接中间体，因为该产物跨越了剪接第一步后即被破坏的分支点。Lariat PCR 可检测剪接第一步的产物以及第二步后被切除的套索结构。mRNA PCR 特异性识别剪接产物 mRNA。外显子 PCR 的结果（存在于所有前体、中间体和产物中，但被切除的套索除外）未在图中显示，因其用于数据归一化，故其值恒为1。(b) 连续硫代标记。随着4tU在转录过程中被掺入，pre-mRNA 的量随时间增加，经过短暂延迟后，剪接将其转化为套索-外显子2中间体和剪接产物。在仅15秒的4tU培养后，这些 pre-mRNA 和套索物种的水平即可高于背景值，并在约45秒的连续4tU标记后达到峰值，此时其生成速率与向剪接mRNA的转化或降解速率达到平衡。数值已归一化至其稳态水平（图中最左侧点），并与外显子2水平进行比较，以显示其出现和加工过程相对于外显子2转录的情况。由于 ACT1 的RNA剪接主要是共转录进行的4,17，剪接后的mRNA迅速成为最丰富的物种，其水平与外显子2相近。误差棒为三次生物学重复实验的标准误差，每次实验均设三个技术重复。(c) 脉冲/追踪实验。进行25秒硫代标记脉冲后，用尿苷进行追踪。与这些RNA的稳态水平（最左侧点）相比，它们在新合成的RNA池中初始含量非常高。随着被加工为mRNA（或降解），其水平逐渐下降，在5分钟时接近稳态水平。误差棒为三次生物学重复实验的标准误差，每次实验均设三个技术重复。(d) nsRNA 和蛋白质耗竭实验。采用与图 (a) 相同的方法，通过定量反转录PCR监测在使用生长素降解系统耗竭Prp16蛋白后 ACT1 前体mRNA转录本的剪接情况，如 图 2 所述。Prp16蛋白水平也在图中以右侧Y轴绘制，表示相对于生长素处理前水平的百分比。Prp16是剪接体的重要组分，尤其在剪接第二步（见图 a）中起关键作用，此步骤之后套索结构被降解。当该步骤受限时，套索结构最初会积累；在后期时间点，剪接完全失败，不再产生套索结构，pre-mRNA 水平上升。误差棒为三次生物学重复实验的标准误差，每次实验均设三个技术重复。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：方案第 1 至第 3 部分的图示总结。 细胞用 4tU 进行硫代修饰，并继续培养以将修饰后的核苷酸掺入 RNA 中。可加入硫代标记的 S. pombe 内参 spike，用于不同时间点和实验之间的归一化处理。可通过加入未硫代的尿苷对 4tU 的脉冲标记进行追踪。标记可从添加 4tU 开始持续进行，也可在改变培养条件后开始：将培养物分装，并在培养条件改变后的不同时间点向各培养物中依次加入 4tU，但每次标记时间均较短。收集细胞后，从细胞中提取 RNA，建议使用匀浆器和基于苯酚的方法。随后对 RNA 进行生物素标记，并通过尺寸排阻柱去除未掺入的游离生物素，从而纯化生物素化的 RNA。此时，新生 RNA（nsRNA）已准备好用于链霉亲和素磁珠纯化（第 4 部分，图 5）。红色数字对应于方案中的步骤编号。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：第4节实验方案的图示总结。 在完成第1至第3节（图4）后，先对链霉亲和素磁珠进行封闭，然后将生物素标记的RNA样品加入已准备好的磁珠中。生物素化的RNA会结合到链霉亲和素磁珠上，未生物素化的RNA则被去除并通过洗涤清除。随后使用β-巯基乙醇（βME）将生物素化RNA从磁珠上洗脱，并进行沉淀，以备后续研究使用。图中红色数字对应实验方案中的步骤编号。请点击此处查看该图的高清版本。
补充图1：在硫标记1分钟和3分钟时，含有或不含额外导入蛋白拷贝的酵母细胞中nsRNA回收效率的改善。请注意，Fui1 是由2 µm质粒表达的酵母自身启动子。这两个菌株均含有该基因的基因组拷贝。请点击此处下载该文件。
补充图2：β-est AID 4U β-est AID 4U 图文实验方案的动画版本。 请点击此处下载该文件。
补充文件 1：4tU_experiment_template.xltx。 请点击此处下载该文件。
| 质粒名称 | 转运蛋白/通透酶 | 标记基因 | 备注 | |
| p4Fui | S. cerevisiae Fui1 | URA3 | Fui1 可转运尿嘧啶和尿苷，因此非常适合用于脉冲-追踪实验。 | |
| pAT2 | S. cerevisiae Fui1 | LEU2 | ||
| p4Fui-ΔPEST | S. cerevisiae Fui1 | URA3 | Fui1 的 PEST 结构域已被失活，因此当细胞内尿嘧啶充足时，该通透酶不会被降解。在标记实验中表现良好，并可提高脉冲-追踪实验的性能。 | |
| p4Fur | S. cerevisiae Fur4 | URA3 | 尿嘧啶通透酶 | |
| YEpEBI311 | H. Sapiens ENT1 | LEU2 | Miller 等人11。该质粒还含有 HSV 胸苷激酶基因。 | |
| （平衡型核苷转运蛋白） | ||||
| 所有质粒均为基于 2 µm 的载体。所有 p4 质粒和 pAT 质粒均基于 pRS16 系列质粒。FUI1 和 FUR4 均由其自身的内源启动子驱动表达。 | ||||
表1：本实验方案所使用的质粒。
讨论
本文介绍了一种极为快速且特异的4tU标记方案，可在标记仅15秒后从S. cerevisiae中有效回收新生的、新合成的RNA，并且未标记RNA的污染极低。
用户应始终注意通过使用低温环境和经DEPC处理的试剂来保持RNA的完整性。链霉亲和素磁珠纯化通常较为可靠；然而，磁珠缓冲液难以操作，必须新鲜配制，并按正确顺序加入各组分，且不能冷藏或高压灭菌。常见的问题包括RNA在沉淀步骤后未能完全溶解，从而导致在后续处理步骤中无法进行生物素标记或发生RNA丢失。补充材料中提供了详尽的故障排除指导。
在 ers4tU 中需注意一些局限性。其中一个已提及的局限性是 4tU 会减缓酵母的生长（图 1a）。除了内源性硫醇化 RNA9 外，仅能在标记期间转录的 RNA 可通过此方法纯化。在整个硫醇化期间停留在基因上的暂停聚合酶不会产生可被纯化的硫醇化转录本，但若聚合酶在硫醇化期间进入或退出暂停状态而产生部分标记的转录本，则仍可被回收。由于突变或培养条件导致转录效率较低的菌株产生的 nsRNA 较少，尽管如此，本文所用技术相较于其他方法仍可提高 nsRNA 的回收率。在这些菌株和条件下，可能需要更长的标记时间和更大的培养体积。请注意，尿嘧啶是良好的氮源，因此在开展涉及氮饥饿的研究前，应先对该方法进行预实验验证。
ers4tU 实验方案特别适用于短寿命 RNA 的分析，其中许多 RNA 降解速度极快，若不抑制其降解机制则无法被鉴定。这类 RNA 包括隐蔽不稳定转录本（cryptic unstable transcripts, CUTs）4、由提前终止或启动子近端暂停产生的短转录本18，以及在启动子上游区域反义转录产生的 PROMPTs（promoter upstream transcripts）19。在稳定 RNA 物种加工过程中产生的中间产物也具有瞬时性，但可通过 ers4tU 标记实现富集4。因此，ers4tU 实验方案的独特之处在于，能够在接近生理条件下对高度瞬时的 RNA 物种进行分析和捕获，这是相较于其他方法的一大优势。该技术已被用于研究 RNA 聚合酶突变体中的转录过程及下游 RNA 加工动力学，这些突变体的延伸速度较正常情况更快或更慢20。
硫醇化修饰也适用于RNA-seq和SLAM-seq21，能够对极短时间内产生的所有RNA进行极为精细的表征。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了惠康基金会（Wellcome）对JB的资助[104648]。惠康细胞生物学中心的工作由惠康核心资助支持[092076]。作者感谢实验室成员Bella Maudlin、Emanuela Sani、Susanna De Lucas-Arias和Shiney George提供的帮助。作者还要感谢Patrick Cramer提供质粒YEpEBI31111。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| β-巯基乙醇（βME | Sigma-Aldrich | M3148 | 警告：有毒。储备液浓度约为 14 M，配制时需注意 1/20 稀释后使用 |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 25668 | 警告：有毒 |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma-Aldrich | D5758 | 添加 1/1000 加液体至溶液中，室温放置24小时，然后高压灭菌 |
| DMF（N,N-二甲基甲酰胺） | Sigma-Aldrich | 227056 | 警告：有毒 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | 用氢氧化钠调节至0.5 M并调pH至8.0 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 29221 | |
| EZ-link HPDP 生物素 | 赛默飞世尔科技 | 21341 | 避光保存。将所有瓶内物质溶于22.7 mL DMF中（配制成4 mM储备液）。避免接触水分，置于暗处保存。 &和 -20 °C. 使用前检查溶液，因为部分批次的 HPDP 在储存过程中可能产生沉淀；可在 42℃ 加热溶解 °C 下重悬。 |
| 葡萄糖 | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
| 糖原 [20 mg/mL] | Sigma-Aldrich | 10901393001 | -20℃保存 °C |
| 固定化TCEP二硫键还原凝胶 | 赛默飞世尔科技 | 77712 | 可选 |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 793620 | 10 M 溶液。注意：溶解过程中会剧烈放热，温度可能超过 100 ℃ 甚至沸腾 oC，将LiCl晶体缓慢加入水中。 |
| 氯化镁（MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63033 | 1 M 溶液。注意：溶解过程中会剧烈放热，温度可能超过 100 ℃并发生沸腾 oC，加入 MgCl2 缓慢地将晶体加入水中。 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | 警告：有毒且易燃 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | 分别配制1 M的溶液，然后等量混合，以获得适当pH的溶液 |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-M | 5 M 溶液 |
| 苯酚，低pH。 | Sigma-Aldrich | P4682 | 避光保存于 4 °C. 注意：有毒 |
| 酚-氯仿 5:1（125:24:1），低pH | Sigma-Aldrich | P1944 | 4℃避光保存 °C. 注意：有毒 |
| Pierce 离心柱 | 赛默飞世尔科技 | 69702 | 可选 |
| SCSM 单细胞单基因缺失 –ura | Formedium | DSCS101 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | 32318-M | 配制3 M溶液，并用乙酸调节pH至5.3 |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 795429 | 警告：腐蚀性 |
| SDS（十二烷基硫酸钠） | Sigma-Aldrich | 436143 | 警告：有刺激性，切勿吸入 |
| 链霉亲和素磁珠 | NEB | 1420S | 4°C 下保存°C |
| SUPERase-In，RNase抑制剂 | Life technologies | AM2696 | -20℃保存°C |
| 巯基化 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 用于 spike | 参见方案第1.7节 | ||
| 4-硫代尿嘧啶（4tU） | ACROS ORGANICS | 359930010 | 避光保存。用1 M NaOH配制100 mM储存液，溶液于-20 ℃保存。°C. |
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | 93362 | 不同 pH 条件下的 1 M 溶液 |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | 5 mg/ml，于 -20 ℃ 保存°C |
| 尿苷 | Sigma-Aldrich | U3750 | 在 H 中配制 1 M 溶液2O. 分装为2 mL等份，于-20 °C保存。 |
| 无氨基酸酵母氮源基础培养基 硫酸铵 | Formedium | CYN0410 | |
| Zeba脱盐柱 0.5 ml | 赛默飞世尔科技 | 89882 | 4°C 下保存 °C |
| 氧化锆珠 | Thistle Scientific | 110791052 | |
| <强>仪器与耗材 | |||
| 珠磨机 | 生物样本 | 112011EUR | 可使用其他均质器；必须为每种均质器和菌株确定合适的条件。 |
| 使用Agilent Bioanalyzer或类似仪器评估RNA质量。若无需评估质量，可使用分光光度计对RNA进行定量。 | |||
| 离心机：能够以 4,000 × g 离心培养物 °4°C 且至少 3000 × g。如可能，预先冷却。 | |||
| 离心机：可旋转容量达 2 mL 的离心管，转速范围为 1000 g 至 13,000 g | |||
| 用于将磁珠与样本分离的磁力架。文中所用为3D打印磁力架，可从Thingiverse获取（thing:3562952）。亦存在 commercially available racks | |||
| 带有加热盖的PCR仪，可在避光条件下进行孵育。 | |||
| 旋转轮以使1.5 mL离心管翻滚旋转 | |||
| 建议使用振荡加热块（如 Eppendorf Thermomixer） | |||
| 离心管，低吸附，RNase-free 0.5 mL | Eppendorf | H179467N | |
| 离心管，低吸附，无RN酶，1.5 mL | Ambion | AM12350 | |
| 50 mL离心管 | Sarstedt | 62.547.004 | 其他离心管不具备防气体渗透性能，允许CO2 用甲醇溶解后，加入温热的培养物会剧烈析出沉淀，导致样品损失 |
| 15 mL离心管 | Sarstedt | 62.554.001 | |
| 2 mL 螺口管 | Greiner | 723361 | |
| 0.2 mL 八联管（带一体式管盖） | 品牌 | 781332 |
参考文献
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