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使用冻存组织进行彗星实验以评估DNA损伤

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DOI：

10.3791/59955

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2020年3月24日

 ,  ,  , 
1Toxicology Program, ILS, Inc., 2Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了在动物尸检时制备高质量冷冻组织样本的几种方法，用于彗星试验以评估DNA损伤：1）剪碎的组织，2）胃肠道刮取的上皮细胞，以及3）需使用组织剪切装置均质化的立方体组织样本。

摘要

彗星试验正日益流行，被用于评估培养细胞和组织中的DNA损伤，特别是在暴露于化学物质或其他环境应激因素之后。2014年，经济合作与发展组织（Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD）发布了测试指南，推动了彗星试验在啮齿类动物遗传毒性监管测试中的应用。通常，彗星试验载玻片是在动物解剖时使用新鲜组织制备的；然而，冷冻组织样本可避免因每只动物需同时制备多个器官、以及每项研究涉及大量动物所带来的操作上的困难。冷冻还便于将样本从暴露实验场所运送至其他实验室进行分析，并且冷冻保存使得可以延迟决定是否针对特定器官生成DNA损伤数据。碱性彗星试验可用于检测与暴露相关的DNA双链和单链断裂、碱不稳定位点，以及不完全DNA切除修复相关的链断裂。然而，机械剪切或不当的样品处理过程也可能导致DNA损伤，从而干扰试验结果。由于参与解剖的实验室人员经验水平参差不齐，且人员流动性较大，因此在解剖过程中对组织样本采集和处理的一致性较难控制。通过再培训或派遣由经验丰富的实验人员组成的移动单元来提高一致性，成本较高，且并非总是可行。为了优化高质量样本的稳定制备，本研究评估了一种使用定制组织切碎装置对快速冷冻组织块进行均质化处理的方法。采用该方法制备的彗星试验样本，在质量上与解剖时通过手工切碎制备的新鲜或冷冻组织样本相当。此外，经过长期储存后，从冷冻组织块中获得的细胞测得的基础DNA损伤水平较低。

引言

彗星试验正越来越多地被用于评估暴露于化学物质或其他环境应激因素下的培养细胞和组织中的DNA损伤1。该试验可检测DNA双链和单链断裂、碱性不稳定位点以及与不完全DNA修复相关的单链断裂。人用药品技术要求国际协调委员会（ICH）的药品测试指南建议，将彗星试验等DNA链断裂检测方法作为第二项试验，以补充啮齿类动物红细胞微核试验，用于评估体内遗传毒性，并作为后续试验用于评估肿瘤诱导靶器官的作用机制2。欧洲食品安全局（EFSA）建议将体内彗星试验作为合适的后续试验，以探究体外遗传毒性试验中阳性结果的生物学相关性3。2014年，经济合作与发展组织（OECD）批准了啮齿类动物彗星试验的测试指南，从而提高了该试验在遗传毒性潜在风险监管测试中的可接受性。该试验基于电泳分离从裂解细胞的核样体中迁移出的松弛DNA环和片段。基本原理是将单个细胞包埋于涂覆在显微镜载玻片上的琼脂糖中。随后将载玻片浸入裂解缓冲液，再置于碱性（pH > 13）溶液中，使紧密缠绕的核DNA松弛并解旋。然后将载玻片置于电场中，促使带负电荷的DNA向阳极迁移，形成类似彗星的图像；彗星尾部DNA含量相对于头部的比例与DNA损伤程度成正比；通常使用数字成像软件对尾部的DNA含量进行定量分析。

由于彗星试验可检测断裂的DNA，因此由处理引起的细胞毒性或应激所导致的坏死或凋亡相关的染色质断裂，可能会干扰对暴露所致DNA损伤的准确定量。此外，机械剪切或样品处理不当也可能导致DNA损伤4。先前研究已证实，在制片前保持收获组织处于冷藏状态，对于将DNA损伤的基础水平降至最低具有重要意义5,6。许多实验室使用新鲜组织制备彗星试验载玻片；然而，当在涉及大量动物的研究中需从每只动物获取多种组织类型时，这种方法在操作上可能具有挑战性。此外，若载玻片的制备与分析需在异地实验室进行，则必须运输样品，这也会带来问题。例如，美国国家毒理学计划（National Toxicology Program）已将彗星试验纳入其遗传毒理学测试项目（https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html），并有时将其用于28 天或90天重复剂量毒性研究中；这要求由动物实验阶段的实验室采集组织，再将样品转移至另一实验室进行分析7。为实现这一流程，通常将组织块切碎，和/或刮取胃肠道上皮细胞，制成细胞悬液后迅速冷冻，并储存在冰箱中，待接收实验室后续运输和保存，直至分析。使用冷冻组织获得高质量数据的关键在于样品的正确处理；然而，在由不同人员轮流执行的解剖过程中，对组织样品进行可重复的一致性操作难以控制，尤其是在那些不常规为彗星试验采集组织的动物实验实验室。对解剖人员进行再培训，或派遣由经验丰富的实验人员组成的移动单元去采集新鲜或冷冻组织样品，往往成本过高、不可行，或未受到足够重视。

为了更好地确保生成高质量的组织样本并将其转运至远程地点进行彗星电泳分析，本研究探索了一种已发表的组织保存方法6，该方法利用速冻的组织小块进行处理。在此方法中，将冷冻的组织小块装入不锈钢组织剪切装置（图1），然后将装置置于含有冷缓冲液的微量离心管中。随后将组织小块从装置末端的细孔径筛网中推出。通过在两个方向上多次反复推动组织悬液穿过筛网，可获得相对均一的单细胞悬液。采用该方法制备的样本在质量上与通过剪切法处理的新鲜及冷冻组织样本相当。此外，与剪切后的样本不同，组织小块可在冷冻条件下长期保存，仍能在彗星电泳分析中获得高质量结果。

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方案

组织样本是在美国实验动物照护与使用认证协会（AAALAC）认证的机构中，由国家毒理学计划（NTP）合同实验室根据优良实验室操作规范（21 CFR 第58部分）以及各实验室机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的动物使用方案进行研究期间采集的。

1. 组织收获与处理

注意：建议制备重复的样品管（例如肝脏），或将大约一半的样品转移至另一个储存管（例如十二指肠、胃），以便在需要时进行重新分析。为尽量减少肠道组织样品间的潜在差异，建议在每只动物相对于胃的相同解剖区域取样，并将样品分割以制备重复样本。转移脑等黏性组织时，建议使用塑料镊子。作为可选步骤，可将切碎、刮取或匀浆处理的组织通过连接在锥形管上的40 µm细胞筛过滤，以获得均一的单细胞悬液。

  1. 去除目标器官上附着的结缔组织、其他器官及碎片。取出后立即在盛有约 7 mL 冷的 freshly prepared 切碎液（无 Mg++、Ca++ 和酚红的 Hank’s 平衡盐溶液，10% v/v DMSO，20 mM EDTA，pH 7.5）的中等大小称量皿中剧烈晃动，以去除残留血液和碎片。
  2. 将每个器官转移至另一盛有足量（约 7 mL）冷切碎液的洁净称量皿中，置于冰上保持组织浸没，直至进一步处理。
  3. 取各目标器官的一部分组织放入包埋盒中。按照实验室常规程序用 10% 中性缓冲福尔马林固定、修块并进行石蜡包埋，以备将来可能的组织病理学评估。
  4. 对于肝脏，取左叶一段长约 5 mm 的纵向切片，在约 7 mL 冷切碎液中轻轻晃动。将组织条放入盛有约 7 mL 冷切碎液的洁净中等大小称量皿中，置于冰上保存，待后续处理（步骤 1.8 或 1.11）。
  5. 对于十二指肠，取靠近胃部的一段长约 10 mm 的十二指肠。使用 21–25 G 针头冲洗以去除碎片和细菌。 
    1. 将针头插入十二指肠一端，用 1 mL 冷切碎液冲洗。
    2. 翻转十二指肠，从另一端重复冲洗，再使用 1 mL 切碎液冲洗一次。弃去针头。
    3. 纵向剖开十二指肠，并在约 7 mL 切碎液中冲洗，然后放入盛有约 7 mL 洁净切碎液的中等大小称量皿中；置于冰上保存，待后续处理（步骤 1.8 或 1.11）。
  6. 对于脑组织，可先将脑分为两个半球；其中一个半球可用于可能的组织病理学分析（见步骤 1.2）。
    1. 分离出目标脑区，在约 7 mL 冷切碎液中轻轻晃动。
    2. 将组织转移至盛有约 7 mL 冷切碎液的洁净中等大小称量皿中，置于冰上保存，待后续处理（步骤 1.8 或 1.11；注意小脑、海马等较小区域可能无需进一步修剪）。
  7. 对于胃组织
    1. 去除并弃去前胃。切开腺胃，在中等大小称量皿中用约 7 mL 冷切碎缓冲液清洗，去除食物残渣。
    2. 取靠近十二指肠处一段长约 5 mm 的腺胃组织，用于固定，以备可能的组织病理学评估（见步骤 1.2）。
    3. 将剩余胃组织放入盛有约 7 mL 冷切碎缓冲液的中等大小称量皿中，于冰上孵育 15–30 分钟。
      注意：此孵育步骤可能非必需；该步骤包含在 JaCVAM 验证方案中，但在 OECD 测试指南8,9 中未提及。
    4. 将胃转移至一块洁净的石蜡纸（或培养皿或称量皿）上，使用手术刀片背面或聚四氟乙烯（PTFE）刮刀轻轻刮擦表面上皮 2 次或以上，以去除碎片。用镊子夹起胃黏膜，用移液器加入 1 mL 冷切碎缓冲液冲洗。将胃组织转移至洁净表面或培养皿中。
    5. 在切碎液（通常每只小鼠 250 µL 或每只大鼠 500–1,000 µL）中，使用手术刀片背面或 PTFE 刮刀小心刮擦胃上皮 4–5 次（必要时可更多），以释放细胞。可选：用大致等体积的切碎液冲洗组织，以回收更多细胞。用移液器收集含有释放细胞的切碎液，转移至置于冰上的微量离心管中。
  8. 切碎组织样品时，取一段 3–4 mm 的肝或脑组织，或约 5 mm 的十二指肠组织，转移至含有 1 mL 冷切碎液的已标记 1.5 或 2.0 mL 微量离心管中。使用组织剪快速剪碎（≤30 秒），直至组织充分分散，同时保持样品低温。样品应略显浑浊；但通常会残留少量组织碎片，沉于管底。
  9. 若需使用新鲜组织，将含有剪碎组织或刮取的上皮细胞的离心管置于冰上保存；在取材后约 1 小时内用于制备彗星电泳载玻片（见第 2 部分）。
  10. 若需冷冻保存组织样品，在剪碎或刮取上皮细胞后立即进行以下操作
    1. 拧紧管盖，将离心管直接投入盛有液氮的杜瓦瓶中；在解剖期间（≤3 小时）可将管子保存在液氮中。
    2. 用勺子取出管子，置于干冰上进行分拣。将管子转移至置于干冰上的冻存盒中，并将冻存盒存于 -80 °C 冰箱中。
  11. 若需制备组织冻块，切取数个小块组织（直径 ≤4 mm，长度约 6 mm；图 1）。
    1. 将组织块逐一直接投入盛有液氮的中等大小称量皿或其他合适容器中。
    2. 等待数秒，待组织块完全冻结后，将单个冻存组织块转移至置于干冰上的已标记微量离心管或冻存管中；冷冻过程中避免组织块聚集粘连。
    3. 将管子转移至置于干冰上的冻存盒中，并将冻存盒存于 -80 °C 冰箱中。

2. 载玻片制备

  1. 对于绞碎/刮取的组织
    1. 将含有新鲜组织的离心管置于湿冰上保存。
    2. 将装有冷冻组织的离心管放入室温水浴中，直至样品完全解冻，同时确保组织保持低温状态。解冻后立即转移至冰上。
    3. 在吸取细胞转移至琼脂糖之前（步骤 2.3），轻轻混匀每份细胞悬液；对于未过滤的样品，让较大的组织块沉降至管底。所有离心管在完成全部样品的载玻片制备前均需保持在冰上。
  2. 对于组织块
    1. 从 -80 °C 冰箱中取出含有组织块的离心管，并在干冰上保存，直至进行载玻片制备。
    2. 为每个样品在已标记的 1.7 mL 微量离心管中加入 1 mL Merchant 培养基（0.14 M NaCl, 1.47 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7.4）或绞碎液，并置于冰上保存。
    3. 操作需迅速，避免组织解冻，将一块组织放入室温组织绞碎装置的开口端（图 1）。可使用多个组织片段；如有必要，可用预冷的研钵和研杵将冷冻组织切割或敲碎成更小的片段，以便适配装置。
    4. 迅速将尺寸匹配的注射器推杆插入装置，推动组织至滤网端，并将该端浸入含有冷绞碎液的微量离心管中；注意避免液体溢出管外。将装置的滤网端浸入冷绞碎液中约 5–10 秒，使组织完全解冻。
    5. 完全下压推杆，直至观察到细胞从滤网孔中挤出。然后将推杆上拉约 2.5 cm，再完全下压；重复此过程数次，直至绞碎液变得浑浊。
    6. 如有必要，可通过在 4 °C 下以 1100 rpm 离心 5 分钟并去除部分上清液，对样品进行浓缩以提高细胞密度。
    7. 每个样品均使用洁净的组织绞碎装置重复上述操作。
  3. 取 50 µL 细胞悬液转移至另一离心管中，该管内含 450 µL 37 °C 的 0.5% 低熔点琼脂糖。
    注意：体积可适当调整，但琼脂糖终浓度应 ≤1%。
  4. 按照先前所述方法制备并标记载玻片10,11。

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结果

研究 1
从两组雄性 Sprague Dawley 大鼠中采集肝脏，这些大鼠均连续 4 天经口给予玉米油，两组实验间隔一周。切片由新鲜切碎的组织、冷冻切碎的组织以及在 Merchant 培养基或切碎液中使用组织切碎装置处理的冷冻立方体组织制备而成。第一组动物的冷冻组织在冰箱中储存约 3.5 个月后进行评估；第二组动物的冷冻组织则在储存约 6 个月后进行评估。具有典型“刺猬状”形态的彗星图像（表明细胞损伤严重，其成因尚不明确，可能包括细胞毒性或机械应力）未被纳入 % 尾部 DNA 的评分统计；根据 OECD TG 4899 的要求，仅通过形态学目视识别出的刺猬状细胞比例被单独记录统计。两组动物（每只动物评分 100 个细胞）的平均 % 尾部 DNA 结果汇总于图 2A。所有使用冷冻组织的方法所得数值均高于新鲜组织，尽管差异并非在所有情况下均具有统计学意义。考虑到新鲜大鼠肝脏中 % 尾部 DNA 的推荐上限为 6%9

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讨论

如先前研究所示7,12,13，经过适当处理的速冻研磨组织在彗星试验中可获得良好的结果。事实上，本实验室制备的冷冻研磨大鼠和小鼠肝脏样本，其基础尾DNA百分比（% tail DNA）通常≤6%，符合OECD测试指南9对新鲜研磨大鼠肝脏样本的推荐标准。多个实验室已使用多种经研磨并冷冻保存的组织类型获得了良好结果；同样，从胃肠道器官刮取的速冻上皮细胞也已成功用于彗星试验7,12,13,14。冷冻研磨或刮取的组织在至少数月内保持相对稳定。采用Jackson等人最初描述的组织研磨装置对速冻肝组织小块进行匀浆的方法6...

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披露

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家环境卫生科学研究所（NIEHS）院内研究计划资助，合同编号为HHSN273201300009C；然而，其中包含的陈述、观点或结论不一定代表NIEHS、NIH或美国政府的陈述、观点或结论。

致谢

作者感谢Lincoln Martin和Kelley Owens在制备和分析彗星图谱实验载玻片过程中提供的专业技术支持，感谢Carol Swartz博士进行统计学分析。作者还感谢ILS公司遗传毒理学、研究毒理学和尸检项目团队成员所给予的支持性贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
冻存管Corning Costar430488
牙科蜡片Electron Microscopy Sciences72670
解剖（剪切）微型剪刀Fisher Scientific08-953-1B
DMSOSigma-AldrichD8418
汉克平衡盐溶液Gibco14175-079
KClTeknovaP0315-10
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
低熔点琼脂糖Lonza50081
微量离心管（1.7 mL）Corning3207
Na2EDTASigma-AldrichE5134
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS6191
中性缓冲福尔马林Leica600
手术刀片Miltex4-110
注射器推杆（1 mL）Fisher Scientific 或 Vitality Medical14-826-88; 8881901014Becton Dickinson 或 Monoject 结核菌素注射器
组织剪切装置NorGenoTech（挪威奥斯陆）无观察到直径存在轻微差异，可能影响推杆的贴合度。
塑料镊子Trade Winds DirectDF8088N增强型尼龙，非无菌，钝头，可高压灭菌；tradewindsdirect.com
称量舟Krackler Scientific/Heathrow Scientific6290-14251B

参考文献

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