本文介绍了基于高分辨率熔解分析（HRM）的靶向诱导基因组局部突变（TILLING）技术方案。该方法利用DNA双链熔解过程中荧光信号的变化，适用于对插入/缺失（Indel）和单碱基替换（SBS）进行高通量筛选。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
靶标诱导基因组局部突变检测技术（TILLING）是一种用于高通量筛选诱导突变的反向遗传学策略。然而，传统的TILLING体系在插入/缺失（Indel）检测方面适用性较低，且需要更为复杂的步骤，例如CEL I核酸酶消化和凝胶电泳。为了提高通量和筛选效率，并实现对插入/缺失突变和单碱基替换（SBSs）的同步检测，已开发出一种基于高分辨率熔解曲线（HRM）的新型TILLING系统。本文详细介绍了一种HRM-TILLING实验方案，并展示了其在突变筛选中的应用。该方法通过检测双链DNA在高温下的变性过程，分析PCR扩增子中的突变情况。HRM分析可在PCR完成后直接进行，无需额外处理步骤。此外，本方法整合了一种简单、安全、快速（SSF）的DNA提取技术，可同时用于识别插入/缺失突变和单碱基替换突变。由于其操作简便、结果稳定且通量高，该技术在水稻及其他作物的突变扫描中具有广泛的应用前景。
引言
突变体是植物功能基因组学研究和新品种育种的重要遗传资源。大约20年前，正向遗传学方法（即从突变体筛选到基因克隆或品种培育）曾是利用人工诱变的主要且唯一手段。McCallum 等人1开发的一种新型反向遗传学方法——TILLING（Targeting Induced Local Lesions In Genomes，基因组中诱导局部突变的靶向技术），开创了一种新范式，并已被广泛应用于大量动物和植物物种中2。TILLING 特别适用于那些在技术上难以或成本较高的性状育种（例如抗病性、矿物质含量）。
TILLING 最初用于筛选化学诱变剂（如 EMS1,3）诱导的点突变，其流程包括以下步骤：构建 TILLING 群体；提取并混合个体植株的 DNA；靶 DNA 片段的 PCR 扩增；通过 PCR 产物的变性与复性形成异源双链，并利用 CEL I 核酸酶进行切割；最后鉴定突变个体及其特异性的分子变异位点3,4。然而，该方法仍相对复杂、耗时较长且通量较低。为了提高效率和通量，已发展出多种改进的 TILLING 方法，例如缺失 TILLING（De-TILLING）（表 1）1,3,5,6,7,8,9,10,11,12。
高分辨率熔解曲线分析（HRM）基于DNA双链解链过程中荧光信号的变化，是一种简单、经济且高通量的突变筛查与基因分型方法13。HRM已广泛应用于植物研究中，包括基于HRM的TILLING技术（HRM-TILLING），用于筛选由EMS诱变诱导的单碱基替换（SBS）突变14。本文提供了利用HRM-TILLING技术在水稻中筛选γ射线诱导的突变（包括插入缺失突变和单碱基替换突变）的详细实验方案。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备工作
- 高分辨率熔解曲线分析技术在突变筛选中的应用 γ-rays诱变群体
- 处理约20,000粒干燥的粳稻种子（含水量约为14%），如DS552品系， 137Cs γ射线以100 Gy（1 Gy/min）照射 γ 辐照设施（例如，γ射线辐照室）。
注意：用于处理的种子应具有高活力（例如，发芽率 >85%）。籼稻的辐照剂量可增加至150 Gy。 - 将辐射处理后的种子在苗床上播种，待发芽后将幼苗单株移栽至稻田，并培育至M代1 群体
注意：M的直接播种1 植株稀疏种植也可用于节省劳动力成本。防止M代植株异花授粉。1 使用物理或生物隔离手段将植株与其他水稻品种隔离开来。 - 批量收获 M2 M 代种子1 植株，每株M代取1-2粒种子1 恐慌，以形成一个 M2 群体
注意：在实际操作中，为简便起见，收获 M 的所有种子1 植物并充分混匀后，取一部分样品形成一个M2 群体 - 浸泡约 5,000 M2 将种子在室温下浸泡于水中24小时（籼稻）至36小时（粳稻），然后在37℃条件下萌发 °在培养皿中的湿润滤纸上于4°C放置2天。
注意：更多 M2 种子可萌发用于分析，以提高突变体的鉴定概率。 - 将已萌发的种子放入带有小孔的育苗板中，并在改良自Yoshida等人的培养液中进行水培，培养3-4周。15 在玻璃温室中，光照周期为12小时［白天（30±2) °C 和夜间（24±2) °C]
- 处理约20,000粒干燥的粳稻种子（含水量约为14%），如DS552品系， 137Cs γ射线以100 Gy（1 Gy/min）照射 γ 辐照设施（例如，γ射线辐照室）。
- 叶片组织取样：剪取一个圆片（Φ 使用打孔器从每株幼苗完全展开的叶片相同位置取样约2 mm。
- DNA提取溶液的配制
- 缓冲液A：加入2 mL 5 M NaOH和10 mL 20% Tween 20，加水定容至50 mL。在DNA提取前新鲜配制缓冲液A。
- 缓冲液B：加入20 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）和80 μ100 mL 的 0.5 M EDTA 溶液。
- PCR引物
- HRM分析引物：使用软件（如Primer Premier5）设计用于扩增目标序列的引物，并由商业公司合成。
注意：由于高分辨率熔解（HRM）技术不适用于长片段的分析，因此扩增子长度应小于400 bp。片段的GC含量过高（>75%）或过低（<GC 含量为 25% 也不适合进行 HRM 分析。 - 用于质量控制的引物：采用彭 et al. 提供的分布在12条水稻染色体上的24个SSR标记16.
- HRM分析引物：使用软件（如Primer Premier5）设计用于扩增目标序列的引物，并由商业公司合成。
2. DNA 提取
- 将4个叶片圆片放入96孔PCR板的每个孔中，每孔加入缓冲液A（50 mL/孔）。将板置于-80 °C冰箱中冷冻10分钟。
- 在室温下解冻该板，然后在95 °C孵育10分钟。
- 向每孔加入50 μL缓冲液B，并通过涡旋充分混匀。
- 将板在1,500 x g条件下离心1分钟。上清液即可用于PCR。
3. PCR 扩增
- PCR 优化
- 向每个 PCR 孔中加入以下试剂：1 μL DNA（步骤 2.4 中的上清液），5 μL 2x Master Mix（包含 2x PCR 缓冲液、4 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L 2'-脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）和 50 U/mL Taq DNA 聚合酶），0.2 μL 的 10 μmol/L 引物各两种，并用无核酸酶水补足至终体积 10 μL。
- 使用具备梯度功能的热循环仪，通过以下 PCR 程序确定每个目标片段的最佳退火温度：94 °C 预变性 5 分钟，随后进行 40 个循环（94 °C 变性 30 秒，52–62 °C 退火 30 秒（梯度温度），72 °C 延伸 30 秒），最后在 72 °C 延伸 8 分钟，然后在 16 °C 保存。
- 在 1% 琼脂糖凝胶上检测扩增产物，以确定最佳退火温度。
注意：最佳退火温度应能实现目标片段的特异性扩增，避免非特异性扩增和引物二聚体的形成。
- 用于 HRM 分析的 PCR
注意：使用适用于 HRM 分析的 PCR 板，以及按照步骤 2.4 所述方法提取的 M2 代幼苗 DNA 进行 PCR。- 在终体积为 10 μL 的体系中进行 PCR 反应，包括 1 μL DNA（上清液），5 μL 2x Master Mix，0.2 μL 的 10 μmol/L 引物各一种，以及 1 μL 10x 荧光染料。每块 PCR 板中应包含一个野生型（WT）亲本样本和一个阴性对照（不加 DNA）。
- 向每个孔中加入一滴矿物油，以防止蒸发。
- 用粘性封膜密封反应板，并在 1,000 x g 条件下离心 1 分钟。
- 使用已优化的退火温度运行 PCR。
注意：在少数情况下，荧光染料可能影响 PCR 扩增效果，因此可在 PCR 完成后再加入染料。此类情况下，通过 PCR 后的变性和退火步骤使染料掺入 DNA 链中。
4. HRM 扫描与突变确认
- 从平板上移除封口膜，并将平板插入高分辨率熔解（HRM）仪中。
- 从文件菜单中选择新建运行，或点击屏幕顶部的运行按钮。
- 设定熔解温度范围，从 55 °C 到 95 °C。
注意：首次运行后，可确定特定片段的熔解温度范围，因此在后续对同一片段的分析中可调整熔解温度范围以节省时间。 - 选择用于高分辨率熔解分析的样品，排除与阴性对照相似的样品。
- 对熔解曲线进行归一化处理，使其起始和终止荧光值一致。目视确认下限最小值和下限最大值温度游标位于曲线的合适区域。
- 将∆F（荧光差异值）保持在默认值 0.05。
- 在标准品选择列表中选择共同型 vs. 变异型，并选择正常灵敏度。
- 以野生型（WT）作为对照；若样品与野生型的∆F值 ≥0.05，则认为其含有突变植株。
- 突变植株的鉴定与确认。
- 鉴定构成每个突变池的四株植株。
- 采用经 Allen 等17描述的 CTAB 法（略有修改）提取各植株的 DNA。
注意：使用 Allen 等17所述的 CTAB 法提取 DNA 时，无需使用无 DNase 的 RNase 和 NaAc，因为所得 DNA 质量已足以用于后续 PCR 扩增。使用分光光度计定量后，将 DNA 调整至终浓度约为 25 ng/μL。 - 使用与 HRM 分析相同的 PCR 引物和程序扩增目标片段。
- 通过扩增产物的 Sanger 测序鉴定具体的分子突变位点。
注意：PCR 扩增完成后，将扩增产物送至公司进行 Sanger 测序。通过比较 M2 植株与野生型（WT）的序列，可确定分子突变类型。
5. 利用分子标记对筛选出的突变体进行质量控制
- 使用CTAB法提取基因组DNA，以25 ng基因组DNA、5 µL 2x混合液和0.2 µL的10 μM SSR引物，在终体积10 μL中进行24个SSR标记的PCR扩增。
- 采用以下程序进行PCR扩增：94 °C预变性5分钟，随后进行30个循环（每个循环包括94 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒），最后在72 °C延伸7分钟。
- 在8%聚丙烯酰胺凝胶上分离扩增产物，并通过银染法显示扩增片段的多态性18。
- 比较所选变异株与野生型（WT）的SSR单倍型。
注意：若多个SSR标记在变异株与野生型之间存在差异，则该变异株极有可能为遗传污染（例如混合样本或异交植株），而非诱导突变体；通常情况下，诱导突变体的SSR单倍型与其野生型相同18。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
HRM 扫描与分析
总共制备了来自4,560株M2幼苗的1,140个混合DNA样本，并进行了PCR扩增。分别针对OsLCT1和SPDT扩增出大小为195 bp和259 bp的两个片段（表2）。大多数样本的熔解曲线与野生型（WT）无显著差异（ΔF < 0.05）。与野生型熔解曲线显著不同的样本（ΔF > 0.05）由软件自动归类为与野生型不同颜色的组别（图1）。
突变确认与频率
采用单株幼苗的DNA样品进行扩增，并对相应片段进行测序。通过测序色谱图可确认突变类型及其在基因上的位置（图2）。在4,560株M2代幼苗中鉴定出三个突变，包括两个插入/缺失突变（Indel）...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
TILLING 已被证明是一种强大的反向遗传学工具，可用于鉴定诱导突变，以进行基因功能分析和作物育种。对于某些不易观察或难以确定的性状，采用基于高通量 PCR 的突变检测 TILLING 方法，可有效获得不同基因的突变体。HRM-TILLING 方法已应用于番茄12、小麦11和葡萄20的 EMS 诱变群体中进行突变筛选。本文展示了一种更简便且更高效的 HRM-TILLING 方法，适用于 Indel 和 SBS 突变的筛选。
为了提高效率，采用SSF方法而非耗时耗力且需要使用有毒化学试剂的传统CTAB方法进行DNA提取。Si等人21比较了SSF法与CTAB法所提取DNA的质量。尽管发现SSF法提取的DNA纯度低于CTAB法，但其仍能满足水稻PCR及高分辨率熔解曲线（HRM）分析的要求。然而需要注意的是，SSF法提取的DNA不能长期保存，因此不适合用于构建永久性突变体文库。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家重点研发计划（编号：2016YFD0102103）和国家自然科学基金（编号：31701394）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, 中国 | KT201 | 用于PCR扩增的PCR缓冲液、dNTP和聚合酶 |
| 96孔板 | Bio-rad, 美国 | MSP-9651 | HRM分析中PCR专用板 |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, 德国 | 6333000073 | 用于PCR扩增 |
| LightScanner | Idaho Technology, 美国 | LCSN-ASY-0011 | 用于荧光信号的采集与处理 |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, 美国 | 用于分析荧光变化 | |
| EvaGreen | Biotium, 美国 | 31000-T | HRM用荧光染料 |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, 美国 | ND2000 | 用于DNA定量 |
参考文献
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40(2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077(2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43(2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14(2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143(2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43(2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , Manila, the Philippines. (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905(2016).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
