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转化、基因组编辑及固氮热带大麻科植物Parasponia andersonii的表型分析

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DOI：

10.3791/59971

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2019年8月18日

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1Laboratory of Molecular Biology, Department of Plant Sciences, Wageningen University & Research, 2Center of Technology for Agricultural Production, Agency for the Assessment and Application of Technology (BPPT), 3Department of Ecological Science, Faculty of Earth and Life Sciences, Vrije Universiteit Amsterdam, 4Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing University of Agriculture

本文内容

摘要

Parasponia andersonii 是一种生长迅速的热带树木，属于大麻科（Cannabaceae），可与根瘤菌共生形成能够固氮的根瘤。本文中，我们描述了一种用于反向遗传学分析的详细实验方案 P. andersonii 基于 根癌农杆菌介导的稳定转化和基于CRISPR/Cas9的基因组编辑。

摘要

Parasponia andersonii 是一种生长迅速的热带树木，属于大麻科（Cannabaceae）。它与另外4个物种共同构成了目前已知唯一能够与根瘤菌建立固氮根瘤共生关系的非豆科植物类群。对豆科植物与P. andersonii进行比较研究，有助于深入理解根瘤形成背后的遗传调控网络。为了促进此类比较研究，我们近期完成了P. andersonii的基因组测序，并建立了由Agrobacterium tumefaciens介导的稳定遗传转化体系以及基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术。本文详细描述了针对P. andersonii所开发的遗传转化与基因组编辑操作流程。此外，还介绍了种子萌发及共生表型鉴定的相关方法。利用本实验方案，可在2至3个月内获得稳定的转基因突变株系。通过对T0代转基因植株进行体外无性繁殖，可在A. tumefaciens共培养后4个月即启动表型分析实验。因此，该流程所需时间仅略长于目前可用于P. andersonii的瞬时根转化方法（基于Agrobacterium rhizogenes），但具备多项明显优势。综上所述，本文所述各项技术手段使得P. andersonii有望成为研究共生互作机制，乃至该热带树种其他生物学特性的理想研究模型。

引言

Parasponia andersonii 是一种属于大麻科（Cannabaceae）的热带树木，原产于巴布亚新几内亚及多个太平洋岛屿1,2,3。连同另外4种Parasponia属物种，它是目前已知唯一能够与根瘤菌建立固氮根瘤共生关系的非豆科植物谱系。这种共生关系在豆科（Fabaceae）模式植物Medicago truncatula和Lotus japonicus中已有深入研究，从而获得了关于根瘤形成与功能的分子遗传机制的详细知识4。此外，研究已证实豆科植物的根瘤共生关系建立在更为古老且广泛存在的丛枝菌根共生关系基础之上5。系统发育基因组学比较表明，豆科植物、Parasponia以及与固氮Frankia细菌共生的所谓放线根瘤植物物种的固氮根瘤共生关系具有共同的进化起源6,7,8。为了确定在豆科植物根瘤形成中起作用的基因是否属于保守的遗传基础，对非豆科物种的研究至关重要。为此，我们建议将P. andersonii作为与豆科植物并行的比较研究模型，以鉴定调控根瘤形成与功能的核心遗传网络。

P. andersonii 是一种可在火山丘坡地上发现的先锋植物。其生长速度可达每月45厘米，长度可达到10米9. P. andersonii 树木为风媒传粉，这得益于雌花和雄花的分别形成3,10我们最近测序并注释了二倍体基因组（2n = 20；560 Mb/1C）的 P. andersonii，以及另外2个草图基因组序列的组装 朴树属 物种 P. rigida 和 P. rugosa6。这揭示了约35,000个 P. andersonii 可聚类的基因模型 >20,000个直系同源群及基因 M. truncatula，大豆（大豆), 拟南芥，林地草莓（野草莓), 朴树 黑杨杨树（Populus trichocarpa））和桉树（桉树 grandis)6此外，对转录组进行比较分析 M. truncatula 和 P. andersonii 鉴定了290个推定的直系同源基因，这些基因在两个物种中均表现出根瘤增强型表达模式6这为比较研究提供了极佳的资源。

为了研究 P. andersonii 根和根瘤中的基因功能，已建立了一种由Agrobacterium rhizogenes介导的根转化方案11。利用该方案，可在相对较短的时间内获得带有转基因根的嵌合植株。该方法也广泛应用于豆科植物共生关系的研究12,13,14。然而，该方法的缺点在于仅根部发生转化，且每条转基因根代表一次独立的转化事件，导致实验结果存在较大变异。此外，该转化属于瞬时转化，无法维持转基因株系。这使得基于A. rhizogenes的根转化方法不太适用于CRISPR/Cas9介导的基因组编辑。另外，A. rhizogenes会将其根诱导位点（rol）基因转移至植物基因组，这些基因一旦表达，会干扰植物激素的稳态15。这使得在A. rhizogenes转化的根中研究植物激素的作用变得困难。为克服这些局限性，我们近期开发了一种基于Agrobacterium tumefaciens的P. andersonii转化及CRISPR/Cas9介导的突变方案10。

本文详细描述了针对P. andersonii建立的基于A. tumefaciens的转化方法及反向遗传学研究流程。此外，我们还提供了转基因植株后续处理的操作方案，包括用于研究共生互作的实验方法。采用本方案可在2至3个月内获得多个转基因株系。结合CRISPR/Cas9介导的诱变技术，可高效构建基因敲除突变体株系。这些突变体株系可通过体外进行无性繁殖10,16,17，从而在启动转化程序后4个月即可获得足够材料用于表型鉴定10。综上所述，这一系列方法可使任何实验室将P. andersonii作为研究模型，用于探究根瘤菌和菌根真菌的共生关系，以及该热带树木生物学的其他潜在方面。

方案

1. 在温室中种植 P. andersonii  树木

  1. 萌发 P. andersonii WU1 种子18。
    1. 使用新鲜的 Parasponia 浆果，或将干燥的浆果在水中浸泡 2 小时以恢复水分。将浆果压碎在一张滤纸上，或在茶筛内壁揉擦以分离出种子。
    2. 用市售漂白剂（约 4% 次氯酸盐）对种子进行消毒 15–20 分钟，随后用无菌水清洗种子 6 次。
    3. 将种子转移至无菌的 200 μL PCR 管中。向管中加入无菌水，使种子完全浸没。将 PCR 管置于热循环仪中，运行以下程序孵育 10 天：30 个循环（7 °C 保持 4 小时，28 °C 保持 4 小时）。请勿使用加热盖，以免高温杀死种子。
    4. 制备 SH-0 培养基平板（见表 1）。将种子转移至 SH-0 平板上，在 28 °C、16 小时光照:8 小时黑暗的条件下培养。用两层弹性密封膜封住平板，以防止在 28 °C 培养期间水分蒸发。
  2. 当幼苗长出第一组真叶后（约在 28 °C 培养 3–4 周后），将幼苗移栽至装有市售育苗土的花盆中，并用透明塑料杯覆盖幼苗以防止失水。将花盆置于 28 °C 的人工气候室或温室中，相对湿度约 85%，光照周期为 16 小时光照:8 小时黑暗。
  3. 一周后，移除透明塑料杯。定期浇水，当植株长大后补充肥料以维持生长。

2. 用于P. andersonii的CRISPR/Cas9介导突变的载体构建

注意：可用于P. andersonii稳定转化的标准双元载体。此处以模块化克隆（例如Golden Gate）19为例，介绍构建CRISPR/Cas9介导突变的载体的实验流程。

  1. 使用内置CRISPR设计工具的生物信息学软件，确定目标基因的向导RNA靶序列。为提高获得完全敲除突变体的可能性，选择位于目标基因编码序列5’端的向导RNA序列。务必通过比对P. andersonii基因组来检查脱靶效应6。
    注意：每个目标基因使用2个sgRNA，最好相距200-300 bp。这可能产生可通过PCR及后续琼脂糖凝胶电泳检测到的缺失片段。
  2. 构建包含sgRNA序列的一级Golden Gate载体。
    1. 设计引物以扩增各个sgRNA，将20 bp的向导序列插入以下引物序列中的N(20)位置：5’-TGTGGTCTCAATTGN(20) GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’。
      注意：如果向导序列为GN(19)，则在插入引物序列前需去除向导序列5’端的G。
    2. 以pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS20为模板，使用步骤2.2.1中设计的正向引物和通用反向引物5’-TGTGGTCTCAAGCGTAATGCCAACTTTGTAC-3’进行PCR扩增sgRNA。使用高保真耐热DNA聚合酶，并采用以下PCR条件：98 °C预变性30 s；30个循环（98 °C变性10 s，53 °C退火20 s，72 °C延伸10 s）；72 °C最终延伸7 min。成功的PCR反应应产生165 bp的扩增产物。
    3. 使用商业化的PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行柱纯化。随后建立Golden Gate反应，将sgRNA克隆至Arabidopsis thaliana AtU6p小RNA启动子下游：加入10 ng sgRNA PCR扩增产物、150 ng pICSL01009::AtU6p20、60 ng相应的一级受体载体、2 µL T4连接酶缓冲液、2 µL 0.1%牛血清白蛋白（BSA）、0.5 µL BsaI、0.5 µL T4连接酶，用超纯水补足至20 µL。确保所有sgRNA以相同方向插入，以防止发夹结构形成。
    4. 将反应置于PCR仪中按以下程序孵育：37 °C 20 s；26个循环（37 °C 3 min，16 °C 4 min）；50 °C 5 min；80 °C 5 min。将Golden Gate反应产物转化至Escherichia coli，并在含氨苄青霉素（50 mg/L）、X-Gal（200 mg/L）和IPTG（1 mM）的LB培养基21上涂布培养。
      注意：分别用超纯水和二甲基甲酰胺配制IPTG和X-Gal的储存液。对氨苄青霉素和IPTG储存液进行滤膜除菌，并将所有储存液保存于-20 °C。操作二甲基甲酰胺时需佩戴手套。
    5. 挑选白色菌落，使用商业质粒提取试剂盒提取质粒DNA。在进行二级Golden Gate组装前，需对提取的质粒进行测序验证。
  3. 构建用于稳定转化的二级Golden Gate载体。
    1. 使用一级AtU6p::sgRNA载体（在2.2节中构建）、pICH47802::NPTII、pICH47742::35Spro::ΩNLS-aCas9::35Ster、二级受体载体pICSL4723以及相应的末端连接子（参见Engler等22）进行Golden Gate反应。反应体系如下：每种供体载体约100 fmol，受体载体约20 fmol，加入2 µL T4连接酶缓冲液、2 µL 0.1% BSA、0.5 µL BpiI、0.5 µL T4连接酶，用超纯水补足至20 µL。
      注意：一级质粒pICH47802::NPTII和pICH47742::35Spro::ΩNLS-aCas9::35Ster需先进行克隆（见补充文件1），其方法与2.2节中sgRNA的克隆方法相同20,22,23。
    2. 按照步骤2.2.4的条件孵育反应体系，并转化至E. coli。在含卡那霉素的LB培养基上涂布培养。次日挑选白色菌落并提取质粒。通过限制性酶切分析确定质粒构建是否正确。
  4. 将二级构建体转化至农杆菌Agrobacterium tumefaciens菌株AGL124。

3. P. andersonii 的稳定转化

  1. 接种含有适当抗生素的2块LB平板 A. tumefaciens 携带目标载体的 AGL1 菌株。28 ℃ 培养平板 °2天，4℃
  2. 从温室种植的植株上采集嫩枝。每次转化使用约5根长度为5–8 cm的枝条。确保仅选用健康且无感染的枝条。将叶片剪除，保留约1 cm的叶柄2 每片叶柄末端保留一片叶组织，其余叶片弃去。
  3. 使用1:1稀释的商用漂白剂（稀释后约含2%次氯酸盐）并加入数滴聚山梨酯20，对组织进行15分钟消毒。随后，用高压灭菌水冲洗组织6次。
    注意：此步骤及后续步骤均需在层流负压超净工作台内操作，以保持组织无菌。
  4. 重悬 A. tumefaciens 来自1-2个培养皿的细胞，置于25 mL浸润培养基中（参见 表1) 含乙酰丁香酮（20 mg/L）和非离子型表面活性剂（0.001% v/v），调节至光密度（OD600约 5.
    注意：用70%乙醇配制乙酰丁香酮储备液，并于-20℃保存 °C. 非离子型表面活性剂在加入浸润培养基前需经滤膜除菌。
  5. 将茎和叶柄组织在无菌条件下切成约1厘米长的小段 A. tumefaciens 悬浮液中，从而在两侧产生新的伤口。将组织块留在其中 A. tumefaciens 悬浮10-30分钟。
  6. 准备生根培养基（参见 表1）并在高压灭菌后加入乙酰丁香酮（20 mg/L）。将组织块置于无菌滤纸上干燥，然后放置于培养基上（约10个外植体/皿）。将培养皿于黑暗条件下21℃培养 °2天，4℃
    注意：让培养基冷却至约60 °添加乙酰丁香酮之前的 C
  7. 2 天后，检查培养皿中是否存在真菌或明显的细菌污染（除农杆菌外的其他细菌）。 A. tumefaciens污染的培养皿需要丢弃。
  8. 制备液体 SH-10 培养基（参见 表1）。高压灭菌后，加入聚山梨酯20（0.01%，v/v）。将组织块转移至含有聚山梨酯20的10 mL SH-10培养基中。在至少10分钟的时间内，每隔2-3分钟轻轻振荡一次，以清洗组织。
  9. 用含聚山梨酯20的新鲜SH-10溶液再清洗两次，每次清洗步骤孵育2-3分钟即可。
  10. 准备生根培养基（参见 表1）。高压灭菌后，加入头孢噻肟（300 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L），倒平板。对于二次转化（对转基因卡那霉素抗性株系的转化），采用潮霉素（15 mg/L）进行筛选。
  11. 将组织块置于无菌滤纸上干燥。随后，将组织块转移至步骤3.9中准备好的培养皿中。
  12. 在28℃下培养平板7天 °C，16小时光照：8小时黑暗。每2天检查一次培养皿是否存在真菌或细菌污染以及过度生长情况 A. tumefaciens若发生污染，将未感染的组织块转移至新的培养皿中。
  13. 7天后，将组织块转移至增殖培养基（参见 表1) 含头孢噻肟（300 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）。将平板置于28 °C，16小时光照：8小时黑暗。每周更换一次培养板，直至转基因芽出现。确保仅将未感染的组织块转移至新鲜培养板上。丢弃被过度生长的 A. tumefaciens.
  14. 当假定的转基因芽长至≥1 cm时，将其剪下，并分别接种于含有头孢噻肟（300 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）的增殖培养基中进行独立培养。为确保所获得的芽为独立的转化事件，每个外植体的每侧仅取一个芽。
  15. 按照步骤5.2所述，对疑似转基因芽进行营养繁殖。

4. 拟转基因苗的基因分型

  1. 设计跨越sgRNA识别位点的引物。为便于PCR扩增子测序，选择距离sgRNA识别位点150-250 bp的引物。
  2. 从每株需要进行基因分型的转基因苗中切取一片叶尖（约5 mm）。同时，采集一株野生型对照样品。
  3. 进行 50 µ使用步骤4.1中设计的引物和商业试剂盒，直接从植物样品中扩增DNA进行L PCR反应。或者，可使用高保真DNA聚合酶对纯化的DNA进行PCR反应。
  4. 在1.5–2%琼脂糖凝胶上分离PCR扩增产物。
  5. 分析琼脂糖凝胶电泳结果。检查样品中是否出现多条带（超过1个等位基因）以及PCR扩增产物大小是否与野生型不同，后者表明存在中等大小的插入或缺失（indel）。
  6. 对PCR扩增子进行测序以确定突变的具体类型。对于仅产生单一条带的样本，可直接对PCR产物进行测序。若样本在凝胶电泳后出现多条带，或PCR扩增子直接测序结果显示为杂合状态，则需先将产物克隆至平末端克隆载体中。随后，对每个样本的多个克隆进行测序，以鉴定样本中存在的所有可能等位基因。
  7. 将测序结果比对至目标基因，并检查比对结果以确认sgRNA靶位点附近是否存在突变。随后，检查这些突变是否引起移码。弃用具有 > 2个等位基因，以及包含框内突变的株系。
  8. 选择若干株系进行进一步分析。
  9. 按照第5.2步所述方法扩增所选株系。
  10. 当植株长出多个新芽后，从≥3个叶片尖端取新样品，重复步骤4.3–4.7。确定来自同一条系及原始PCR样品的各份样品中所含突变是否一致。若所有样品中的突变均相同，则该条系为均一突变，可用于后续实验。结果不一致的条系应予以淘汰，因其为嵌合体。

5. 实验用生根的 P. andersonii 植株幼苗的准备

  1. 启动一个新的组织培养系 P. andersonii.
    1. 从健康植株上采集腋芽、幼嫩的不定芽或叶片组织。 alternatively，也可使用幼苗作为起始材料。
    2. 使用1:1稀释的商用漂白剂（稀释后约含2%次氯酸盐）并加入数滴聚山梨酯20，对组织进行15分钟消毒。随后，用高压灭菌水冲洗组织6次。
      注意：此步骤及后续步骤均需在垂直层流或水平层流超净工作台内操作，以保持组织无菌。
    3. 将组织转移至增殖培养基（参见 表1）。用两层弹性密封膜封盖培养皿，并在28 ℃下培养。 °C，16小时光照：8小时黑暗。
    4. 在最初的两周内，每隔几天检查一次培养皿，以确保组织无真菌或细菌污染。
  2. 将约10个芽接种于新鲜的增殖培养基平板上，用两层弹性封口膜密封平板。将平板置于28℃培养 °C，16小时光照：8小时黑暗。每4周重复此步骤一次。
  3. 当芽长出时 >长1厘米，从基部切下茎段并置于生根培养基上（参见 表1。每个生根培养板可放置约10个茎段。将茎段基部末端插入培养基中，使其直立放置。培养板在28 °C下培养10–14天后开始出现根。 °C，16小时光照：8小时黑暗。
    注意：不要将所有芽都诱导生根，应保留部分用于组织培养繁殖（见步骤5.2）。

6. 盆栽P. andersonii幼苗的结瘤

  1. 准备根瘤菌接种物。
    1. 从 Mesorhizobium plurifarium BOR26 的单菌落接种 10 mL 液体 YEM 培养基（见表 2），在 28 °C 下培养 2 天。
      注意：优先选用 M. plurifarium BOR2，因其对 P. andersonii 的结瘤效率高。然而，其他根瘤菌菌株也可用于 P. andersonii 的结瘤（例如 Bradyrhizobium elkanii WUR325、Rhizobium tropici CIAT89926,27 或 Bradyrhizobium sp. Kelud2A4）。
    2. 用该 10 mL 菌液接种更大体积的液体 YEM 培养基。该培养物的体积取决于需要接种的盆数。
    3. 制备液体 EKM 培养基（见表 3、表 4）。将菌液在 3,500 x g 条件下离心 10 分钟以收集菌体。随后，将菌体沉淀重悬于液体 EKM 中（体积约等于原始 YEM 培养液体积），并测定光密度（OD600）。
  2. 对于约 20 个盆，准备 3 L 液体 EKM 培养基，并加入步骤 6.1.3 制备的根瘤菌悬液，调节至 OD600 = 0.025。
  3. 将含根瘤菌的 3 L EKM 培养基与 1,250 g 珍珠岩混合。随后，将 210 g 该混合物加入无菌透明聚丙烯盆中。或者，可使用沙子代替珍珠岩作为结瘤试验的基质。
  4. 每盆种植 1–3 株 P. andersonii 幼苗。同时，准备若干盆含有经 CRISPR 对照载体转化的 P. andersonii 幼苗（见补充表 1）。称量若干盆的重量，以便在实验期间测定水分损失。覆盖每盆底部，以避免根部暴露于光照。
  5. 将盆置于控温培养室（28 °C，16 小时光照 : 8 小时黑暗）中培养 4–6 周。每周称量若干盆的重量以测定水分损失。若水分损失超过 10 mL，需补充超纯水以补偿损失。
  6. 4–6 周后，将根部从珍珠岩中清洗干净，并使用双目显微镜检查结瘤效率，统计根瘤数量。

7. 在培养皿上进行 P. andersonii 幼苗结瘤

  1. 准备玻璃纸膜28。
    1. 将玻璃纸膜裁剪至可放入12 cm × 12 cm的方形培养皿中。在顶部稍作裁短，以留出空间供芽体生长。
    2. 为提高玻璃纸膜的通透性，将膜在EDTA溶液（1 g/L）中煮沸20分钟。随后用去离子水至少冲洗6次，以去除残留的EDTA。
      注意：干燥的膜遇水后容易起皱，因此应将干燥膜逐片浸入溶液中。
    3. 将膜平铺于圆形玻璃板中的薄层水中，通过两次高压灭菌对膜进行灭菌处理。
  2. 将一片经高压灭菌的玻璃纸膜置于含有琼脂固化EKM培养基的12 cm × 12 cm方形培养皿中（见表3、表4）。在膜上放置两株3周龄已生根的P. andersonii植株（见第5节）或4周龄幼苗（见第1.1节）。应仅选择根尖呈白色的植株或幼苗，以确保根系仍处于生长状态。
  3. 用第二片玻璃纸膜轻轻覆盖根部，形成夹心结构。用三层弹性封口膜密封培养皿，并用铝箔包裹培养皿下半部分，以避免根部暴露于光照下。
  4. 将培养皿置于控温培养室（28 °C，16小时光照:8小时黑暗）中培养3–4周。标记根尖位置，以便随时间追踪根的生长情况。
  5. 若因培养时间较长导致EKM培养基干燥，应在细菌接种前数天将植株转移至新鲜的EKM培养基平板上。
  6. 按步骤6.1所述方法制备细菌接种液。
  7. 移除顶部玻璃纸膜，向根部加入1 mL根瘤菌培养液（OD600 = 0.025）。随后在接种后的根部覆盖新的玻璃纸膜，并用铝箔包裹培养皿外部，防止根部见光。
  8. 4周后，使用双目显微镜观察根瘤数量，以评估结瘤效率。

8. 在培养袋中进行 P. andersonii 幼苗结瘤

  1. 按照第1.1节所述方法萌发 P. andersonii 种子。当子叶完全展开后（约在28 °C条件下于SH-0培养基平板上培养12天），将幼苗转移至种植袋中。
  2. 准备种植袋时，撕开纸芯的折叠部分，并加入7 mL改良EKM培养基（见表3、表4）。
  3. 将1至2株幼苗插入种植袋中，使根部位于构成纸芯的两层滤纸之间，并紧贴种植袋的前层塑料片。
  4. 用铝箔包裹种植袋以遮蔽根部免受光照。将种植袋悬置于带有透明盖子的塑料盒内，以维持高湿度环境。将盒子置于控温培养室中（28 °C，16小时光照:8小时黑暗）。
  5. 为补偿水分蒸发，定期添加无菌超纯水，确保纸芯保持湿润（避免种植袋底部积水）。第一周后，通常每4天需补充2–3 mL水。
  6. 按照步骤6.1所述方法制备根瘤菌接种液。
  7. 幼苗在种植袋中生长10–12天后，用500 µL根瘤菌培养液（OD600 = 0.025）对根系进行接种。
  8. 持续观察根瘤形成过程。接种后四周可统计根瘤数量并进行采集，以测定结瘤效率。

9. 根瘤细胞结构分析

  1. 在含有固定液（5% 戊二醛溶于 0.1 M 磷酸缓冲液，pH 7.2）的 2 mL 离心管中收集 10–15 个根瘤。抽真空处理 ½–1 小时，然后在 4 °C 下过夜孵育。在此期间，样品会沉入管底。
    注意：固定液可在使用前于 4 °C 下保存约 2–4 周。操作组织固定液时务必佩戴手套。
  2. 用 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.2）清洗根瘤 2 次，每次清洗间隔 10 分钟。
  3. 依次将样品在 30%、50%、70% 和 100% 乙醇中进行脱水处理。为确保完全去除样品中的水分，100% 乙醇步骤需重复 3 次。每次脱水步骤之间间隔 10 分钟。
  4. 通过将 1 包固化剂 I 加入 2.5 mL PEG400 与 100 mL 基于 HEMA（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）树脂溶液的混合液中，配制聚合混合液 I（PM-I）。搅拌约 15 分钟，直至固化剂 I 完全溶解。随后将 PM-I 储存于 -20 °C。
  5. 去除步骤 9.3 中的乙醇，并按以下顺序对样品进行渗透处理：PM-I : 100% 乙醇（1:3, v/v）、PM-I : 100% 乙醇（1:1, v/v）以及 PM-I : 100% 乙醇（3:1, v/v）。每种溶液中于室温孵育 ½–1 小时，或直至样品沉至底部。
  6. 在 100% PM-I 溶液中于 4 °C 过夜孵育样品。
  7. 通过将 PM-I 与固化剂 II 按 15:1（v/v）比例混合，配制聚合混合液 II。将聚合溶液注入塑料模具中，将样品水平放置于模具底部，并用一片弹性密封箔覆盖。避免产生气泡。
    注意：由于溶液在室温下暴露后即开始聚合，应尽快在塑料支架中完成样品定位。聚合过程可在室温下过夜完成，或在 37 °C 下 1 小时内完成。
  8. 移除步骤 9.7 中的弹性密封箔盖，并将支架置于已聚合的样品上。为将支架固定在样品上，将 10 mL 甲基丙烯酸甲酯基树脂粉末溶解于 5 mL 甲基丙烯酸甲酯基树脂溶液中。迅速将该溶液加入支架顶部的孔中。
    注意：此聚合步骤应在通风橱中进行（室温下约 30 分钟）。
  9. 使用切片机将样品切成 4–5 µm 厚的切片。将载玻片置于 58 °C 的加热板上，并在每张载玻片上加一滴较大的水滴。将切片置于水滴表面。待水分蒸发后，切片将牢固附着于载玻片上。
  10. 将载玻片浸入 0.05%（w/v）甲苯胺蓝溶液中染色 2 分钟，随后用超纯水冲洗 3 次。染色后的载玻片可在明场显微镜下观察。

10. 安氏丛枝菌根（P. andersonii）幼苗的菌根化

  1. 准备不规则球囊霉（Rhizophagus irregularis）孢子接种物
    1. 准备一组由聚酯编织滤膜组成的滤膜堆，其孔径自上而下依次为：210 µm、120 µm 和 36 µm。
    2. 将适量商业孢子悬浮液移液至该聚酯滤膜堆上。用 100 mL 经高压灭菌的去离子水冲洗滤膜 3 次。孢子将保留在 36 µm 滤膜表面。
      注意：应在层流洁净台中制备孢子悬浮液，以防止污染。
    3. 拆开滤膜堆，仅保留 36 µm 滤膜。使用高压灭菌的去离子水重复清洗步骤，至少清洗 6 次。
    4. 将滤膜置于培养皿中，用高压灭菌的去离子水重悬孢子。所用水的体积应等于步骤 10.1.2 中使用的孢子悬浮液的体积。用移液器将孢子悬浮液转移至无菌离心管中。
    5. 取 5 滴 20 µL 的孢子悬浮液置于载玻片上，使用明场显微镜计数孢子数量。将孢子计数换算为每毫升孢子数（spores/mL），并通过稀释使孢子悬浮液浓度达到 250 spores/mL。将孢子悬浮液储存于 4 °C。
  2. 进行菌根侵染实验。具体操作为：向无菌半透明聚丙烯盆中加入 800 g 高压灭菌的沙子，并添加 70 mL ½-Hoagland 培养基（见表 5-表 6）。通过剧烈摇动使沙子与培养基在盆内充分混合。
  3. 每个盆中植入一株 P. andersonii 幼苗，并用移液器将 1 mL 孢子悬浮液直接加至 P. andersonii 幼苗根部。实验中需设置若干对照组，包含经 CRISPR 空载体对照构建体转化的 P. andersonii 幼苗（见补充表 1）。
  4. 将盆栽置于控温培养室中（28 °C，16 小时光照:8 小时黑暗）培养 6 周。
  5. 从盆中取出植株，用流动水冲洗根部，尽可能去除附着的沙粒。
  6. 将根切成约 1 cm 长的小段，在含 10% KOH（w/v）的溶液中于 90 °C 沸腾处理 20 分钟。随后将煮过的根段转移至孔径为 100 µm 的细胞筛网上，用 50 mL 水冲洗 3 次。
  7. 将根段置于乳甘油染色液（300 mL 乳酸；300 mL 甘油；400 mL 去离子水）中，加入 0.05%（w/v）的台盼蓝，在水浴或加热块中 90 °C 染色 5 分钟。随后将根段转移至 30% 甘油溶液中。根样品可在室温下保存。
  8. 将 15–25 段根片段置于一张显微镜载玻片上，加入 30% 甘油，盖上盖玻片并轻压使根段展平。使用明场显微镜观察根片段，并对菌根侵染程度进行评分。
    注意：菌根侵染评分方法参照 Trouvelot 等人29 的描述。该方法采用多个评分等级（%F、%M 和 %A），可快速评估每段根的菌根侵染水平及丛枝的丰度。

结果

P. andersonii 树木可在温度为 28 °C、相对湿度约为 85% 的可控温室中生长（图 1A）。在此条件下，树木在种植后 6–9 个月开始开花。P. andersonii 雌花结出浆果，每颗浆果内含一粒种子。浆果成熟过程中颜色会发生变化：首先由绿色变为白色，随后由白色变为棕色（图 1B）。从成熟的棕色浆果中提取的种子，在经历 10 天的变温处理后，接种于 SH-0 培养基平板上培养 7 天，即可获得良好的萌发效果（图 1C）。萌发后的种子继续发育成幼苗，约 4 周后即可用于实验（图 1D）。

我们先前已证明，幼嫩的叶柄和叶段 P. andersonii 茎可使用农杆菌进行高效转化 A. tumefaciens 菌株 AGL110在转化程序开始时，外植体组织与 A. tumefaciens 在21 °C下培养2天（图 2A。延长共培养会导致外植体组织被过度定植 A. tumefaciens 因此应予以避免（图2B共培养期结束后，将外植体转移到选择性培养基上，以促进转化组织的生长。通常在两到三周后，可在原始伤口表面观察到微小的绿色微愈伤组织。图2C）。这些愈伤组织应在转化程序启动后6-8周内持续生长，并发育出1个或多个疑似转化的芽。图2D）。在此阶段，使用来自成熟且部分木质化枝条的外植体进行转化时，转化效率通常在10%至30%之间。表7）。如果使用尚未开花的幼嫩且快速生长的枝条顶端作为外植体进行转化，则转化效率可达约65–75%（表7偶尔，外植体未接触培养基的一侧会形成白色愈伤组织，因此这些愈伤组织未经历卡那霉素筛选。这些愈伤组织通常不是转基因的，由此类愈伤组织产生的芽在直接接触含卡那霉素培养基后通常会褪绿并死亡。图 2E）。如果转化率较低和/或起始材料不理想，组织块可能会变褐（图 2F）并遭受过度增殖的困扰 A. tumefaciens (图2G）。为防止 A. tumefaciens 为防止污染扩散并避免邻近外植体过度生长，需定期更换培养基，并及时移除严重感染的外植体。当单个转基因芽接种至增殖培养基后，其过度增殖现象可通过 A. tumefaciens 通常不再发生（图2H）。转基因芽可通过体外繁殖进行扩增，每月可产生数十个芽（图3A-B这些芽可转移至生根培养基，约2周后应诱导生根。图3C-D生根的植株可随后用于实验。

为了创制基因敲除突变体品系，我们采用CRISPR/Cas9介导的诱变技术。具体而言，我们使用一种双元载体，该载体包含卡那霉素抗性基因NPTII、由CaMV35S启动子驱动的Cas9编码序列，以及两个由AtU6p小RNA启动子驱动表达的靶向目标基因的sgRNA20。用于P. andersonii的CRISPR/Cas9介导诱变的载体结构示意图见图4A。采用该方法，约40%的疑似转化芽中可观察到基因组编辑事件10。为鉴定突变体品系，需对疑似转化芽进行基因分型，使用跨越靶区域的引物扩增sgRNA靶位点，检测是否存在突变。预期结果示例如图4所示。如凝胶电泳照片所示，多个样本产生的PCR扩增片段大小与野生型相似（图4B）。这些植株可能含有无法通过琼脂糖凝胶电泳分辨的小片段插入或缺失（indel），或未被Cas9酶编辑。此外，多个样本产生的条带大小与野生型不同（例如图4B中的2、4、7和8号株系）。在这些株系中，一个（4、7和8号株系）或两个（2号株系）等位基因含有较大的插入或缺失，易于通过电泳检测。靶位点突变的具体性质需通过PCR扩增产物测序进一步确定。如图4C所示，CRISPR/Cas9诱变后可获得1–4 bp的小片段indel，也可产生较大的缺失。在图4C中，1号株系的序列与野生型完全一致，表明该株系未发生编辑，应予以剔除。在含有突变的株系中，可鉴定出杂合突变体、纯合突变体和双等位基因突变体（图4C）。然而，杂合突变体通常较为罕见10。纯合或双等位基因敲除突变体可通过营养繁殖扩增，以获得足够的材料用于表型分析。由于表型分析在T0代进行，因此必须确认突变体株系是否为嵌合体。为此，需从每个突变体株系中至少取3个不同样本重复进行基因分型。若各次基因分型结果彼此一致，且与原始样本结果相同（例如图4D中的8号株系），则表明该株系突变均一，可用于后续分析。反之，若不同独立样本的基因分型结果存在差异（例如图4D中的4号株系），则该突变体株系为嵌合体，应予以剔除。

P. andersonii 接种 M. plurifarium BOR2 后会形成根瘤（图5）。如图5A所示，这些根瘤分布在根系上。P. andersonii 的根瘤呈浅褐色，但可根据其形状与根组织明显区分（图5B）。在花盆中进行接种实验并培养4-6周后，通常可形成约10-30个根瘤（图6A）。接种后4周，EKM平板上生长的P. andersonii幼苗形成的根瘤数量与此相似（图6A）。在培养袋中，P. andersonii幼苗通常在接种后5周形成约5-15个根瘤（图5C-D、6A）。为分析根瘤的细胞结构，可对根瘤进行切片，并使用明场显微镜观察。图6B展示了一个通过P. andersonii根瘤中部的纵向切面示例。该切面显示了P. andersonii根瘤的中央维管束，其两侧为含有被侵染细胞的根瘤小叶（图6B）。

P. andersonii 幼苗也可进行菌根共生。接种后6周 R. irregularis，菌根定植频率通常达到 > 80% (图6C）。此时，通常约有30%的细胞含有丛枝结构（arbuscules）图6C）。一个代表性图像 P. andersonii 显示含有丛枝的根段 图6D.

Potted tree growth, fruit ripening stages, seed germination in petri dish, seedling development.
图1：代表性图像 P. andersonii 树木、种子与幼苗 (A6个月大 P. andersonii 在28 °C条件下温室中种植于盆栽土中的树木。B代表性图像展示 P. andersonii 不同成熟阶段的浆果。幼嫩 P. andersonii 未成熟的浆果在成熟过程中颜色会从绿色变为白色，最后变为棕色（成熟）。C) P. andersonii 在SH-0培养基上孵育1周的种子。黑色圆圈表示已萌发的幼苗。D4周龄 P. andersonii 在SH-0培养基中生长的幼苗。（比例尺为25 cm）A）和1厘米（B-D). 请点击此处以查看此图的放大版本。

Plant tissue culture stages, microscopy; callus formation, regeneration; experimentation results.
图2：稳定转化过程中不同阶段外植体的代表性图像。 (A外植体与农杆菌共培养 A. tumefaciens. (B外植体被过度生长 A. tumefaciens 转化后的前两周内。 (C) 共培养2.5周后，在外植体的伤口附近形成转基因微愈伤组织。D) 共培养6周后外植体的代表性图像，显示芽从（转基因）愈伤组织中萌出。E) 与含有卡那霉素的培养基直接接触后变白并最终死亡的芽的代表性图像。该芽极可能为非转基因组织，在连接于外植体时逃逸了卡那霉素筛选。F) 转化失败的外植体代表性图像。G) 转化失败且被过度生长的外植体的代表性图像 A. tumefaciens. (H) 共培养8周后在增殖培养基上生长的单个转基因芽 A. tumefaciens比例尺为2.5 mm。含有绿色对勾或红色叉的方框分别表示外植体转化成功或失败。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Plant tissue culture experiment; growth stages in petri dishes A-D; biotechnology research.
图3：代表性图像 体外 繁殖 (A) 在增殖培养基上生长的芽。图像拍摄于培养皿更换培养基一周后。B) 在增殖培养基上生长的芽。图片拍摄于培养皿更换后4周。C) 放置于生根培养基上的新鲜切段茎条。 (D) 在生根培养基上培养2周的芽。注意根的出现。比例尺为2.5 cm。 请点击此处以查看该图的放大版本。

CRISPR-Cas9 基因编辑；质粒图谱、凝胶电泳、序列分析；双等位基因突变。
图 4：对 P. andersonii T0 转基因 CRISPR/Cas9 突变株进行基因分型后的代表性结果。 （A）用于 P. andersonii CRISPR/Cas9 介导突变的双元载体的代表性图谱。（B）使用跨越 sgRNA 靶位点的引物对潜在 CRISPR/Cas9 突变株进行基于 PCR 的基因分型后的代表性结果。图中显示的是扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后的图像。来自各个转基因株系的样品以数字标示。野生型（WT）和无模板对照（NTC）分别表示阳性对照和阴性对照泳道。（C）CRISPR/Cas9 介导基因编辑后获得的突变等位基因的示意图。sgRNA 靶位点和 PAM 序列分别以蓝色和红色高亮显示。（D）对潜在嵌合突变株进行基于 PCR 的筛选后的代表性结果。图中显示的是从突变株 4 和 8 中提取的 3 个独立样品经琼脂糖凝胶电泳后的图像。请注意，转基因突变株 4 为嵌合体。请点击此处查看该图的放大版本。

植物生长和根系发育实验；培养皿设置、根部细节、水培系统。
图 5：培养皿和种植袋中结瘤实验的代表性图像。 （A）在含琼脂固化的 EKM 培养基的培养皿中接种 M. plurifarium BOR2 菌株培养 4 周后的结瘤情况。 （B）P. andersonii 根瘤的代表性图像，拍摄于接种 M. plurifarium BOR2 菌株 4 周后。 （C）在含液体 EKM 培养基的种植袋中结瘤的情况，幼苗接种 Bradyrhizobium sp. Kelud2A4 菌株培养 5 周。 （D）种植袋中结瘤实验所用完整装置的代表性图像。比例尺在（A, C）中为 2.5 cm，在（B）中为 1 mm，在（D）中为 5 cm。 请点击此处查看该图的放大版本。

结瘤图表、植物组织显微图像、固氮研究结果。
图6：结瘤与菌根共生实验的代表性结果。（A）代表性柱状图，显示接种M. plurifarium BOR2后4周内在花盆或培养板中每株植物形成的结瘤数量，以及接种Bradyrhizobium sp. Kelud2A4后5周内在培养袋中的结瘤数量。数据表示均值 ± 标准差（n = 10）。（B）接种M. plurifarium BOR2后4周形成的结瘤纵切面代表性图像。切片经甲苯胺蓝染色。（C）菌根定殖程度定量分析的代表性柱状图。根据Trouvelot等29的方法测定以下参数：F，被菌根侵染的根片段在分析样本中的频率；M，侵染强度；A，整个根系中成熟丛枝的丰度。菌根定殖程度在接种R. irregularis（菌株DAOM197198）后6周进行量化。数据表示均值 ± 标准差（n = 10）。（D）接种R. irregularis后6周，P. andersonii根皮层细胞中存在成熟丛枝的代表性图像。比例尺为75 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

化合物SH-0SH-10增殖培养基生根培养基侵染培养基
SH-基本盐培养基3.2 g3.2 g3.2 g3.2 g3.2 g
SH-维生素混合物1 g1 g1 g1 g1 g
蔗糖-10 g20 g10 g10 g
BAP (1 mg/mL)--1 mL (4.44 µM)--
IBA (1 mg/mL)--100 µL (0.49 µM)1 mL (4.92 µM)-
NAA (1 mg/mL)---100 µL (0.54 µM)-
1 M MES pH=5.83 mL3 mL3 mL3 mL3 mL
1 M KOH调节 pH 至 5.8调节 pH 至 5.8调节 pH 至 5.8调节 pH 至 5.8调节 pH 至 5.8
大新琼脂8 g-8 g8 g-

表1：用于培养 P. andersonii 幼苗、稳定转化及 in vitro 繁殖的基于Schenk-Hildebrandt30 的培养基成分。 在加入液体母液前，先将固体化合物溶解于750 mL超纯水中，然后将培养基定容至1 L。BAP、IBA和NAA母液用0.1 M KOH配制，并于-20 ᵒC保存。

高压灭菌前：
化合物每升用量终浓度
Mannitol5 g27.45 mM
Na-Gluconate5 g22.92 mM
Yeast extract0.5 g-
MgSO4·7H2O0.2 g0.81 mM
NaCl0.1 g1.71 mM
K2HPO40.5 g2.87 mM
高压灭菌后：
化合物每升用量终浓度
1.5 M CaCl21 mL1.5 mM

表2：用于培养根瘤菌的酵母甘露醇（YEM）培养基成分。 将pH值调节至7.0，并用超纯水定容至1 L。制备琼脂固化YEM培养基时，灭菌前加入15 g微琼脂。

高压灭菌前：
化合物储存浓度每升培养基添加量终浓度
KH2PO40.44 M添加 2 mL0.88 mM
K2HPO41.03 M添加 2 mL2.07 mM
500倍微量元素储备液-添加 2 mL-
MES pH=6.61 M添加 3 mL3 mM
HCl1 M调节 pH 至 6.6-
超纯水-加至 990 mL-
高压灭菌后：
化合物储存浓度每升培养基添加量终浓度
MgSO4·7H2O1.04 M2 mL2.08 mM
Na2SO40.35 M2 mL0.70 mM
NH4NO30.18 M2 mL0.36 mM
CaCl2·2H2O0.75 M2 mL1.5 mM
Fe(III)-柠檬酸盐27 mM2 mL54 μM

表3：用于 P. andersonii 结瘤实验的1 L改良EKM培养基成分31。 500倍微量元素储备液的成分见表4。配制2%琼脂固化的EKM培养基时，需在灭菌前加入20 g大新琼脂。将MgSO4·7H2O、Na2SO4、CaCl2·2H2O和Fe(III)-柠檬酸盐储备液进行高压灭菌。NH4NO3储备液需通过过滤除菌。

化合物每升用量储存浓度
MnSO4500 mg3.31 mM
ZnSO4·7H2O125 mg0.43 mM
CuSO4·5H2O125 mg0.83 mM
H3BO3125 mg2.02 mM
Na2MoO4·2H2O50 mg0.21 mM

表4：配制改良EKM培养基所用的500倍微量元素储备液成分。 将微量元素储备液在4 °C下保存。

化合物储存浓度每升培养基添加量终浓度
K2HPO420 mM1 mL0.2 mM
NH4NO30.28 M10 mL2.8 mM
MgSO440 mM10 mL0.4 mM
K2SO440 mM10 mL0.4 mM
Fe(II)-EDTA9 mM10 mL0.9 mM
CaCl280 mM10 mL0.8 mM
50x 微量元素储备液-10 mL-

表5：用于菌根化测定的½-Hoagland32培养基的组成。 50倍微量元素储备液的配方见表6。将FeSO4·7H2O（9 mM）与Na2·EDTA（9 mM）混合配制成1种铁（II）-EDTA储备液，并于4 °C保存。用1 M KOH将培养基pH调节至6.1，并用超纯水定容至1 L。

化合物每升用量储存浓度
H3BO371.1 mg1.15 mM
MnCl2·4H2O44.5 mg0.22 mM
CuSO4·5H2O3.7 mg23.18 µM
ZnCl210.2 mg74.84 µM
Na2MoO4·2H2O1.2 mg4.96 µM

表6：配制½-Hoagland培养基所用的50倍微量元素储备液的成分。

外植体年龄转化效率
幼嫩69.4 ± 6.2% (n = 2)
成熟18.3 ± 10.2% (n = 15)

表7：P. andersonii 的转化效率。 此处转化效率定义为形成至少一个转基因愈伤组织或芽的外植体所占的百分比。转化效率在转化后6周进行评估，以均值±标准差表示。n 表示用于确定转化效率的转化实验次数。

补充文件1：用于CRISPR/Cas9诱变的1级和2级载体构建概览。 请点击此处下载该文件。

讨论

豆科植物与亲缘关系较远的大麻科Parasponia属是目前已知唯一能够与固氮根瘤菌建立内共生关系并形成根瘤的两个植物类群。对这两个类群中物种的比较研究，对于揭示支持该共生关系的核心遗传网络具有重要意义。目前，遗传学研究主要集中于豆科植物，尤其是两个模式物种M. truncatula和L. japonicus。为了提供一个额外的实验平台，并促进与结瘤非豆科植物的比较研究，本文描述了P. andersonii中稳定的遗传转化及反向遗传学分析的详细实验方案。本方案采用T0代转基因P. andersonii植株的体外繁殖技术，可在A. tumefaciens共培养后4个月内启动表型分析。这显著快于目前已建立的豆科植物稳定转化方案33，使P. andersonii成为一个极具吸引力的研究模型。

本文所述方案包含多个关键步骤。第一步涉及种子萌发。为准备 P. andersonii 种子进行萌发，需将种子从浆果中分离。此操作可通过在滤纸或茶筛内壁轻轻揉搓浆果完成。该过程需轻柔操作，以防止种皮受损。若种皮受损，灭菌过程中次氯酸钠可能渗入种子内部，从而降低种子活力。为打破种子休眠，需对种子进行为期10天的变温处理。然而，即使经过此处理，种子萌发仍无法完全同步。通常情况下，部分种子在7天后开始出现胚根萌出，但其他种子可能需要更长时间才能萌发。

转化过程中的关键点包括起始材料的选择以及共培养步骤的持续时间。为了实现高效的转化，最好选用健康且幼嫩的茎段或叶柄作为起始材料，这些材料应来自非无菌条件下温室培养的植株。为促进幼嫩枝条的生长，建议每2-3个月对Parasponia植株进行一次修剪，并每年更新植株一次。此外，共培养步骤仅需进行2天。延长共培养时间会促进A. tumefaciens对组织外植体的过度定植，通常会降低转化效率。为防止A. tumefaciens的过度定植，还应定期更换外植体培养所用的培养基平板。若发生过度定植，可对外植体进行清洗（见第3.8节），以去除A. tumefaciens细胞。我们建议在用于清洗的SH-10溶液中加入漂白剂（终浓度：约2%次氯酸盐）。需要注意的是，该额外清洗步骤可能对严重感染的外植体无效（图2B）。如果使用CRISPR/Cas9构建体进行转化时仅获得少量疑似转化的芽，或预期特定基因的突变会对再生造成困难，则建议设置空载体对照构建体作为阳性对照。最后，必须确保所筛选的所有转基因株系均来源于独立的T-DNA插入事件。因此，我们建议从每个外植体的两侧各取一个疑似转基因芽即可。然而，我们意识到这种做法会减少可能获得的独立株系数量。如果需要获得大量株系，研究人员可在愈伤组织达到≥2 mm大小时，将其从原始外植体上分离，并进行独立培养。通过这种方法，可从单个外植体中分离出多个株系，从而提高潜在转基因株系的数量。

P. andersonii 的转基因株系在本实验方案中通过离体营养繁殖方式进行扩繁。该方法的优势在于可在相对较短的时间内获得大量转基因植株。然而，该方法也存在若干局限性。首先，通过离体繁殖维持 T0 代转基因株系需要大量人力，且可能导致非预期的遗传或表观遗传变异34,35。其次，T0 代株系仍含有 T-DNA 拷贝，包括抗生素抗性表达盒。这限制了后续重复转化的次数，因为每次重新转化均需使用不同的筛选标记。目前，我们仅测试了卡那霉素或潮霉素筛选条件下的转化（数据未显示）。此外，T0 代转基因株系中存在编码 Cas9 的序列及单导 RNA（sgRNA），这会为互补实验带来困难。尽管仍可开展互补实验，但必须对互补载体中的 sgRNA 靶位点进行突变，以避免其被基因编辑系统识别和切割。第三，使用 T0 代株系的另一缺点是 CRISPR/Cas9 诱导的突变体可能具有嵌合性。为避免对嵌合突变体进行表型分析，我们建议在离体繁殖后，至少对 3 个不同枝条重复进行基因型鉴定。尽管采用本方案获得的嵌合突变体数量较少，但仍偶有发现10。为克服使用 T0 代株系的局限性，可考虑采用有性繁殖方式扩繁 P. andersonii 突变株系。P. andersonii 为雌雄异株植物，依靠风媒传粉2。这意味着每个转基因株系需经处理以使单个个体同时产生雄花和雌花，并在后续生长过程中防止异花授粉。由于 P. andersonii 生长迅速，其在热带温室（28 °C，相对湿度约 85%）中栽培需要较大的空间。因此，尽管从技术上可行，P. andersonii 转基因株系的有性繁殖在实际操作中仍面临较大挑战。

在实验方案部分，我们描述了三种用于P. andersonii结瘤的方法。平板法和育苗袋法的优点在于根系易于观察，可用于细菌的定点接种，并可随时间追踪根瘤的形成过程。然而，平板法操作较为耗时，因此不太适用于大规模的结瘤实验。育苗袋法的一个缺点是难以避免真菌污染。育苗袋本身并非无菌，因此常可在育苗袋上半部分观察到真菌生长。但这种情况并不影响P. andersonii的生长，因此不会干扰结瘤实验的结果。此外，育苗袋法仅适用于种子萌发的幼苗。尽管进行了多次尝试，我们仍无法将在体外繁殖获得的植株成功生长于育苗袋中。

该 P. andersonii 此处描述的反向遗传学技术流程相较于现有方法具有显著改进 A. rhizogenes-为基础的根部转化方法11利用所述方法，可高效地获得稳定的转基因株系，并可通过体外繁殖进行维持。相比之下， A. rhizogenes 转化是瞬时的，仅导致转基因根的形成。由于每条转基因根均来源于独立的转化事件， A. rhizogenes­ 基于转化的检测存在显著的表型变异。相比之下，稳定转化株系的变异程度要低得多，尽管体外繁殖仍会带来一定程度的变异。由于变异减少，且每个稳定株系可对多个植株进行表型分析，因此稳定株系比 transient 转化方法更适用于定量检测 A. rhizogenes转化的根。此外，稳定转化不依赖于引入 根诱导位点 A. rhizogenes (rol) 影响内源激素平衡15因此，与瞬时转化方法相比，稳定转化株系更适用于对参与激素稳态的基因进行反向遗传学分析 A. rhizogenes-转化的根。一个更普遍的优势是 P. andersonii 作为研究模型的优势在于其未经历近期的全基因组复制（WGD）。豆科蝶形花亚科（Papilionoideae），包含多种模式豆类植物， M. truncatula 和 L. japonicus，以及包括模式树种在内的杨柳科（Malpighiales 目） 杨树（Populus trichocarpa） 约6500万年前经历了全基因组复制事件36,37. 这些全基因组复制事件产生的许多旁系同源基因拷贝在基因组中得以保留 M. truncatula, L. japonicus 和 P. trichocarpa37,38,39，这会产生冗余，可能会使反向遗传学分析复杂化。正如 P. andersonii 未经历近期的全基因组复制（WGD），对 P. andersonii 旁系同源基因拷贝的功能冗余可能对其影响较小。

综上所述，我们提供了一套针对P. andersonii的反向遗传学分析的详细实验方案。利用该方案，可在2-3个月内高效地获得单基因突变株系10。本方案还可通过同时靶向多个基因的sgRNA多重编辑策略，进一步拓展用于构建高阶突变体，这已在其他植物物种中得到验证40,41,42。此外，本文所述的稳定遗传转化方法不仅限于CRISPR/Cas9基因靶向，也可用于导入其他类型的载体（例如启动子-报告基因检测、异位表达或反式互补实验）。我们已将P. andersonii确立为一种可用于比较研究的模式体系，以探究其与固氮根瘤菌或丛枝菌根真菌之间的互利共生关系。然而，本文描述的实验方案同时也为研究这一热带树种的其他生物学特性提供了工具，例如木材形成、两性花的发育，以及大麻科特有次生代谢物的生物合成过程。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Mark Youles、Sophien Kamoun 和 Sylvestre Marillonnet 通过 Addgene 数据库提供了 Golden Gate 克隆元件。此外，我们还要感谢 E. James、P. Hadobas 和 T. J. Higgens 提供 P. andersonii 种子。本研究得到了荷兰科学研究组织（NWO-VICI 资助项目 865.13.001；NWO-开放竞争资助项目 819.01.007）以及印度尼西亚共和国研究、技术和高等教育部（RISET-PRO 资助项目 8245-ID）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Sigma-AldrichN0640NAA
Duchefa BiochemieM1503.0250MES
Sigma-AldrichD134406乙酰丁香酮
Duchefa BiochemieX1402.1000X-Gal
Merck101236用于核酸电泳凝胶
--袋式盒材料，挂架
Merck101188NH4NO3
Sigma-AldrichB3408-1GBAP
Merck100156H3BO3
Thermo-FisherER1011用于Golden Gate克隆组装的限制性内切酶
Thermo-Fisher15561020用于Golden Gate克隆组装
Merck137101CaCl2·2H2O
Duchefa BiochemieC0111.0025C16H16N5O7S2Na
Thermo-FisherK1231用于基因分型过程中平末端PCR扩增子的克隆
AgronutritionAP2011含有Rhizophagus irregularis DAOM 197198（1,000个孢子/mL），用于菌根定殖实验
Merck102790CuSO4·5H2O
Duchefa BiochemieD1004.1000用于植物组织培养琼脂培养基
Merck105101K2HPO4
VWR Chemicals20302.293Na2·EDTA
Duchefa BiochemieM0803.1000C6H14O6
Thermo-FisherER0291用于Golden Gate克隆组装的限制性内切酶
Merck100983C2H5OH
VWR ChemicalsBDH9232-500GEDTA
Sigma-AldrichZ377600-1PAK玻璃纸膜
Biomatters, Ltd.R9 或更高版本用于体外克隆和sgRNA设计的生物信息学软件
Mega International-技术信息见 https://mega-international.com/tech-info/
Sigma-Aldrich65882用于根瘤组织的固定
VWR Chemicals24385.295-
Vink219341袋式盒材料，底部部件
Leica Biosystems14702218311用作塑料包埋的模板
Merck100317HCl
Sigma-AldrichI5386-1GIBA
Merck103862C6H5FeO7
Merck103965FeSO4O·7H2O
Duchefa BiochemieI1401.0005IPTG
Duchefa BiochemieK0126.0010 
Sigma-AldrichL2000 
Merck105886MgSO4O·7H2O
Merck105934MnCl2·4H2O
Merck102786MnSO4O
Duchefa BiochemieM1002.1000用于细菌培养琼脂培养基
Manutan92007687袋式材料
Paraxisdienst130774弹性密封箔
Pull RhenenAgra-Perlite No.3用作结瘤实验盆栽中的生长基质
VWR Chemicals391-0581用作玻璃纸膜的容器
Thermo-FisherF130WH用于转基因系的基因分型
Addgene 503370级终止子，3’UTR，35s（花椰菜花叶病毒）
Addgene 48017连接子2，用于将两个1级元件组装至2级受体
Addgene 48018连接子3，用于将三个1级元件组装至2级受体
Addgene 480011级受体，位置5，正向方向
Addgene 480071级受体，位置1，反向方向
Addgene 502680级启动子（0.4 kb），35s（花椰菜花叶病毒）+ 5’UTR，Ω（烟草花叶病毒）
Addgene 46966用于设计CRISPR/Cas9模块
Addgene 46968用于设计CRISPR/Cas9模块
Addgene 503340级卡那霉素/新霉素/巴龙霉素抗性盒
Topzeven-用作洗涤孢子悬浮液的滤膜
Sigma-Aldrich8.17003PEG400
Duchefa BiochemieE1674.0001用于培养Parasponia植株/幼苗的花盆
Merck104871KH2PO4
Merck105033KOH
Merck105153K2SO4O
Van Leusden b.v.-用作菌根定殖实验的生长基质
Duchefa BiochemieS0225.0050SH基本盐培养基
Duchefa BiochemieS0411.0250SH维生素混合物
Lehle SeedsVIS-02在稳定转化的洗涤步骤中用作非离子型表面活性剂
Merck137017NaCl
VWR Chemicals89230-072C6H11NaO7
Merck106521Na2MoO4·2H2O
Merck106574Na2HPO4·7H2O
Merck567549NaH2PO4·H2O
Sigma-Aldrich239313Na2SO4O
Duchefa BiochemieS0809.5000C12H22O11
Thermo-FisherB69用于Golden Gate克隆组装
Thermo-FisherEL0013用于Golden Gate克隆组装
Kulzer-Mitsui Chemicals Group64708806甲基丙烯酸甲酯基树脂粉末
Kulzer-Mitsui Chemicals Group64709003HEMA（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）基树脂溶液
Kulzer-Mitsui Chemicals Group66022678甲基丙烯酸甲酯基树脂溶液
Merck1159300025 
Acros189350250 
VWR Chemicals663684B聚山梨酯20
Stout Perspex-袋式盒材料，盖子
Duchefa BiochemieY1333.1000 
Merck108816ZnCl2
Alfa Aesar33399ZnSO4O·7H2O

参考文献

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