Saccharomyces 酵母物种间热耐受性差异的全基因组范围相互半合子分析遗传定位

摘要

通过测序实现的相互半合子化（RH-seq）是一种强大的新方法，可用于定位物种间性状差异的遗传基础。该方法利用转座子诱变生成半合子池，并通过高通量测序结合竞争性生长来追踪其适合度。对所得数据的分析可精确定位控制该性状的基因。

摘要

现代遗传学的一个核心目标是理解野生生物在表型上存在差异的原因和机制。迄今为止，该领域的发展主要依赖于连锁分析和关联作图方法，这些方法通过分析同一物种内个体杂交后产生的重组子代中DNA序列变异与表型之间的关系来推进研究。尽管这些方法十分强大，却不适用于生殖隔离物种之间的性状差异研究。本文介绍一种可用于不相容物种的全基因组水平解析自然性状变异的新方法。我们的策略——RH-seq，是全基因组范围实施的互惠半合子检验。我们利用该方法鉴定了导致酵母菌Saccharomyces cerevisiae相较于其姐妹种S. paradoxus具有显著高温生长能力的相关基因。RH-seq利用转座子诱变构建一组互惠半合子文库，并通过高通量测序追踪这些半合子在高温环境下的竞争表现。本文所描述的RH-seq工作流程为解析芽殖酵母类群中古老的复杂性状提供了一种严谨且无偏倚的方法，但需注意该方法需要投入大量资源进行深度测序，以确保遗传作图所需的基因组覆盖度。随着测序成本的降低，该方法在未来有望广泛应用于真核生物的研究中。

引言

自遗传学领域诞生以来，理解野生个体间变异的机制基础一直是核心目标。当我们定位到与特定性状相关的基因座时，所发现的基因可立即作为诊断和药物研发的靶点，并有助于揭示进化的基本原理。目前业界普遍采用的方法是通过连锁分析或关联分析，在群体中检测基因型与表型之间的关系¹。尽管这些方法非常强大，但仍存在一个关键局限——它们依赖于可育个体杂交后产生的大量重组子代。因此，对于那些根本无法交配产生后代的物种，这些方法完全无法应用。正因如此，该领域长期以来难以对生殖隔离物种之间的性状差异进行无偏性的解析²。

在本研究中，我们报道了一种新方法RH-seq³的技术基础，该方法可用于在基因组尺度上系统调查物种间性状变异的遗传基础。该方法是互惠半合子检测法^4,5的大规模并行版本，后者最初被提出用于评估在特定基因座上，两个遗传背景不同的个体之间等位基因差异对表型效应的影响（图1A）。在此方案中，首先将两个遗传差异显著的个体杂交，产生一个杂合子后代，其基因组的一半来自各自的亲本。在此杂合背景下，构建多个菌株，每个菌株均含有其中一个亲本等位基因被中断或删除的拷贝。这些菌株被称为半合子，因为其基....

方案

1. 用于转化的含 piggyBac 质粒的制备

1. 将含有质粒 pJR487 的 E. coli 菌株划线接种至 LB + 羧苄青霉素琼脂平板上，以获得单菌落。在 37 °C 下培养 1 夜，或直至单菌落出现。
   注意：关于质粒 pJR487 克隆方法的描述可参见我们之前的研究³。
2. 在 2 L 玻璃烧瓶中，用 1 L 含 100 μg/mL 羧苄青霉素的 LB 培养基接种一个含有 pJR487 的 E. coli 单菌落。在 37 °C、200 rpm 振荡条件下过夜培养，直至培养物饱和（OD₆₀₀ ≥ 1.0）。
3. 按照制造商公布的说明书，使用大提质粒试剂盒从上述培养物中纯化质粒 DNA（详见材料表）。在 37 °C 预热的 5 mL 洗脱缓冲液中孵育 10 分钟后洗脱 DNA。
4. 使用分光光度计测定质粒 DNA 的浓度和纯度（详见材料表）。
5. 重复步骤 1.2 – 1.4，直至获得至少 11 mg 的质粒 DNA，且其 A₂₆₀:A₂₈₀ 比值不低于 1.8。根据提取效率不同，可能需要进行数次提取。
6. 将所有质粒提取物合并至同一离心管中，并用洗脱缓冲液或水将总体积调至 20 mL。再次使用....

结果

我们将酿酒酵母（S. cerevisiae）与奇异酵母（S. paradoxus）杂交，获得一种不育的杂交子，随后对该杂交子进行转座子诱变。每个诱变克隆均为半合子，即二倍体杂交子中某一基因的一个等位基因被破坏（图 1A， 图 2）。我们通过在 39 °C 条件下共同培养这些半合子进行竞争实验，并在另一独立实验中以 28 °C 作为对照条件（图 1B），随后从每种培养物中提取 DNA。为评估各半合子的适合度，我们采用大规模测序方法定量其丰度，具体方案为：将 DNA 片段化后连接接头，再扩增转座子插入位点（图 1C）。若该扩增所用引物与方案中提供的引物不同或效率较低，则测序数据中将出现大量背景读段，导致可用读段减少，从而降低适合度估计的准确性。若测序文库构建过程中 DNA 起始投入量过低，也可能引发类似的质控问题。

讨论

与以往的统计遗传学方法相比，RH-seq 具有多重优势。与连锁分析和关联分析不同，RH-seq 能够实现单基因水平的定位分辨率；因此，即使在研究特定物种个体间性状变异或种间差异时，该方法也可能具有重要应用价值。此外，以往的全基因组范围的互惠半合子分析尝试依赖于基因缺失突变体文库，其中部分突变体携带继发性突变，可能导致假阳性结果^9,10。RH-seq 策略通过依次对每个基因产生并表征多个半合子突变体，使得单个突变克隆的遗传背景对最终结果的影响微乎其微，从而规避了这一问题。理论上，RH-seq 还可用于研究非编码位点，但在本研究中我们仅专注于基因。

RH-seq 存在一些生物学和技​​术上的特殊性，成功的实践者需要提前解决这些问题，以最大化该方法的实用性并加速获得最佳结果。从生物学角度来看，只有当两个目标物种能够杂交形成稳定且可存活的杂合子，并能进行遗传操作时，RH-seq 才具有技术意义。因此，我们无法将 RH-seq 应用于那些亲缘关系过于遥远、无法融合形成核型稳定.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-2 种质粒Gigaprep试剂盒	Zymo Research	D4204	所需试剂盒数量取决于每个试剂盒中提取的效率。该试剂盒包含5个独立的质粒提取柱。每个提取柱通过1 L饱和的大肠杆菌（E. coli）培养液，因为每柱使用超过1 L可能导致提取滤膜堵塞，从而导致DNA得率低和质量差。
10X Tris-EDTA（TE）缓冲液（100 mM Tris-HCl 和 10 mM EDTA）	任意品牌	N/A	使用前通过0.22 μm滤膜过滤除菌。
1M LiOAc	任意品牌	N/A	使用前通过0.22 μm滤膜过滤除菌。
300 mg/mL Geneticin（G418）	Gibco	11811023
52% 聚乙二醇（PEG）3350	Sigma	1546547	溶于水后，使用前通过0.22 μm滤膜过滤除菌。1X 转化混合液（trafo mix）：228 μL 52% PEG，36 μL 1M LiOAc，36 μL 10X TE缓冲液
高压灭菌的LB液体培养基	BD Difco	244620	使用任意品牌的粉末和milliQ水配制LB液体培养基，使用前进行高压灭菌。
水中的羧苄青霉素储备液（100 mg/mL）	任意品牌	N/A	使用前通过0.22 μm滤膜过滤除菌。
含5-氟乳清酸（5-FOA）的完全合成琼脂平板（24.1 cm × 24.1 cm）[0.2% 缺陷型氨基酸混合物（不含尿嘧啶或酵母氮源基础，YNB）, 0.005% 尿嘧啶, 2% D-葡萄糖, 0.67% 不含氨基酸的YNB, 0.075% 5-FOA]	5-FOA：Zymo Research，缺陷型混合物：US Biological，尿嘧啶：Sigma，D-葡萄糖：Sigma，YNB：Difco	5-FOA：F9001-5，缺陷型混合物：D9535，尿嘧啶：U0750，D-葡萄糖：G8270，YNB：DF0919
DMSO	任意品牌	N/A
携带pJR487质粒（CEN-/ARS+ 含piggyBac的质粒）的大肠杆菌菌株	N/A	N/A	向Brem实验室申请获取。
杂合酵母菌株JR507（酿酒酵母DBVPG1373 × 奇异酵母Z1，URA-/URA-）	N/A	N/A	向Brem实验室申请获取。
Illumina Hiseq 2500			用于SE-150测序读长
带可变温度设置的大型摇床培养箱	任意品牌	N/A
含羧苄青霉素的LB琼脂平板（100 μg/mL）	琼脂：BD Difco	琼脂：214010	正常制备LB琼脂平板，并在凝固前加入羧苄青霉素至终浓度100 μg/mL。
Nanodrop分光光度计	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit荧光计	Thermo Scientific	Q33240
鲑鱼精子DNA	Invitrogen	15632011
39°C水浴	任意品牌	N/A
酵母真菌基因组DNA提取试剂盒	Zymo Research	D6005
酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）液体培养基	BD Difco	蛋白胨：211677，酵母提取物：212750	高压灭菌后，加入过滤除菌的D-葡萄糖至终浓度2%。
含G418的YPD琼脂平板（300 μg/mL）	琼脂：BD Difco	琼脂：214010	正常制备YPD琼脂平板，并在凝固前加入G418至终浓度300 μg/mL。
YPD琼脂平板	琼脂：BD Difco	琼脂：214010