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方法文章

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/59978

⸱

2019年7月5日

 ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, Melbourne VIC 3800, Australia.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究概述了利用免费提供的图像处理工具，对C. elegans中的突触大小与定位、肌肉形态以及线粒体形态进行定量测量的方法。该方法可使未来在 C. elegans 中开展的研究，能够对因基因突变所导致的组织和细胞器结构变化程度进行定量比较。

摘要

明确疾病背后的细胞机制对于开发新型治疗方法至关重要。为揭示这些机制，常用策略是引入候选基因的突变，并对组织和细胞器形态的变化进行定性描述。然而，定性描述可能无法捕捉细微的表型差异，可能误判群体中个体间的表型变异，且通常依赖主观评估。本文介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜结合商用生物图像处理软件，对线虫 Caenorhabditis elegans 的组织和细胞器形态进行定量分析的方法。通过定量分析影响突触完整性（大小和整合荧光强度）、肌肉发育（肌细胞大小和肌球蛋白丝长度）以及线粒体形态（圆形度和大小）的表型，以理解基因突变对这些细胞结构的影响。这些定量方法不仅限于本文所述的应用，还可广泛用于对线虫及其他模式生物中其他组织和细胞器形态的定量评估。

引言

线虫 秀丽隐杆线虫 （秀丽隐杆线虫） 作为一种模式生物系统，其在揭示人类疾病相关的生物学和分子过程中的应用日益广泛。成年线虫体长略超过1毫米，可产生多达300枚卵的大量后代。1孵化后， 秀丽隐杆线虫 仅需 3-4 天即可发育至成虫，寿命约为 2 至 3 周2由于其易于培养， 秀丽隐杆线虫 目前，该动物模型是进行低成本、快速药物筛选以发现人类疾病治疗方法最受追捧的体内模型之一。此外，其基因的高度保守性、明确的行为学范式、通体透明便于荧光或光学显微镜观察，以及易于进行遗传操作等特点，使其成为研究基因突变所导致的细胞与分子效应的理想选择。3。该 秀丽隐杆线虫 基因组与人类基因的直系同源性约为60%至80%，其中约40%的基因已知与疾病相关。部分已在该模型中建立并研究的人类疾病包括 秀丽隐杆线虫 包括神经退行性疾病（阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症）、肌肉相关疾病（杜氏肌营养不良症）和代谢性疾病（高血糖）2,4在大多数人类疾病中，会引发细胞和细胞器的定位及形态学改变，这些变化可在线虫模型中 easily 进行评估。

荧光标记已广泛用于在显微镜下对组织和细胞器进行动态可视化标记。然而，在C. elegans中，评估由基因突变引起的形态学异常的传统方法在很大程度上依赖于视觉描述。虽然定性评估能够涵盖更广泛的表型描述（如突触形态、GFP 聚集、特定轴突形状、肌纤维厚度等），并提供形态变化的总体概览，但其在比较不同组别之间细微差异方面效果较差。此外，定性评估基于视觉和主观判断，可能导致对形态异常的过高或过低估计。最后，定性观察在不同个体之间也可能存在显著差异，从而导致数据重复困难。 

近年来，已开发出多种易于使用且 readily available 的计算算法，可对图像进行定量分析。然而，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中，此类图像分析软件在某些形态学研究中的应用仍相对滞后，尤其是在体壁肌肉和线粒体相关研究方面。为了改进对 C. elegans 中基础结构的分析，本研究尝试使用了一些 readily available 的开源图像分析软件，以定量比较基因突变对肌肉中线粒体、体壁肌肉以及突触形态的影响。这些实验流程详细说明了如何利用这些程序（Fiji、ilastik、CellProfiler、SQUASSH）来评估基因突变导致的突触大小及突触蛋白定位的变化、体壁肌肉面积与肌纤维长度，以及线粒体的大小和圆形度。 

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方案

1. C. elegans 品系的培养与维持

  1. 在超净工作台中，用300 µL缓慢生长的E. coli菌株OP50接种线虫生长培养基（NGM，参见材料表）琼脂平板。
  2. 将NGM琼脂平板留在超净工作台中晾干。
    注意：若无超净工作台，可将平板置于实验台上晾干，但更易受到污染。
  3. 将至少20只线虫转移至两个已接种OP50的NGM琼脂平板，以建立工作种群。转移线虫主要有两种方法：
    1. 挑取法：使用经加热灭菌的挑针轻轻挑取线虫。该方法适用于从琼脂平板上选择单个或多个线虫。挑取时，挑针尖端带有少量细菌有助于转移。
      注意：挑针由一段长约4 cm的铂金丝制成，嵌入玻璃毛细管中，其末端压平呈“矛状”。每次挑取之间需对挑针进行加热灭菌，以防止交叉污染。
    2. 切块法：使用灭菌的刮铲，从原平板上切下一小块含有线虫的琼脂，倒置转移至新平板。
      注意：该方法通常适用于转移大量线虫，并可通过多轮切取无污染的琼脂块来去除平板上的污染。为避免交叉污染，每次转移之间应将刮铲在火焰上灼烧数秒，并浸入100%乙醇中。不建议从饥饿平板上进行转移，因为饥饿和过度拥挤可能影响细胞及亚细胞结构的健康状态和形态。
  4. 将线虫维持在标准培养温度（20 °C）。为确保持续获得营养充足的线虫，每2至3天将线虫转移至新的接种OP50的平板上。

2. 年龄同步化 C. elegans

  1. 将线虫培养在3-4个NGM平板上，直至种群密集但未饥饿。
  2. 用M9溶液轻轻冲洗NGM平板上的线虫。由于卵会黏附在E. coli OP50上，因此会留在平板上。再重复冲洗四次，以去除所有已孵化的个体。
  3. 让线虫孵化40分钟。
  4. 向平板中加入1-2 mL M9溶液，并轻轻旋转以松动刚孵化的线虫。
  5. 收集含有新生线虫的M9溶液，并将该溶液连同线虫转移至新的NGM平板上。
  6. 将NGM平板暴露于空气中，使M9溶液蒸发。操作时应靠近明火以避免平板污染。
  7. 在20 °C下培养27小时，使线虫发育至三龄幼虫（L3）阶段。若需获得同步化的3日龄成虫，可在四龄幼虫阶段挑取线虫，继续培养3天至3日龄成虫阶段。

3. 成像用载玻片的制备

  1. 在耐微波的瓶中配制3-4% w/v琼脂糖母液（将3-4 g琼脂糖溶于100 mL超纯水中）。
    注意：可在相同浓度下用琼脂替代琼脂糖。
  2. 将琼脂糖在微波炉中小心加热熔化，注意避免过度沸腾，直至琼脂糖完全溶解（形成澄清溶液）。保持溶液温度在70 °C，以防止凝固。
    注意：琼脂糖母液可多次使用。若琼脂糖已凝固，使用前重新加热即可。
  3. 用巴斯德吸管将一滴熔化的琼脂糖滴加到显微镜载玻片上。
    注意：应避免在液滴中产生气泡，因为气泡会破坏琼脂垫的完整性。
  4. 立即用另一张显微镜载玻片轻轻压下琼脂糖液滴，使琼脂糖在两张载玻片之间均匀压平成垫状。
    注意：此步骤应去除所有残留气泡。若未能去除，需重新制备载玻片，因为实验动物容易卡在气泡中。压片时应避免琼脂溢出至边缘。
  5. 让琼脂糖静置干燥1分钟。
  6. 小心分离两张载玻片，避免损伤琼脂糖，同时将凝固的琼脂垫保留在其中一张载玻片上。
    注意：琼脂糖垫载玻片应在实验前新鲜制备，因其容易干燥。确保琼脂糖垫厚度均匀一致，且无气泡或裂纹，以免影响成像。
  7. 在琼脂糖垫中央加入一小滴（5–10 µL）0.05%盐酸四咪唑（麻醉剂）。
  8. 使用经加热灭菌的挑针，迅速将约10–15只动物从保存平板转移至麻醉液滴中，避免溶液干燥。转移时应避免带入过多OP50细菌，以免溶液浑浊而干扰成像。
    注意：若在挑取过程中麻醉液已干燥，可直接用移液器再加入一滴0.05%盐酸四咪唑至动物所在位置。动物在麻醉液中通常会侧卧。
  9. 将盖玻片置于琼脂糖垫上方，轻轻放下，以避免产生气泡。切勿对盖玻片施加压力，以免压碎动物。
  10. 用菌株名称标记载玻片。

4. 评估突触形态

注意：通过使用线扫描共聚焦显微镜定量突触大小和定位，研究了 MEC-17 过表达对后侧微管（PLM）触觉感受神经元中突触完整性的效应。PLM 神经元（包括突触区域）通过以下方法进行可视化 uIs115(Pmec-17::tagRFP) 转基因（品系：TU4065）5）并使用特异性标记物对突触区域进行标记 jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) （菌株：NM664）6). 本研究在同步化的L3非转基因动物和染色体外MEC-17过表达品系BXN507的转基因动物中进行cjnEx036(Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37; uIs115]7本研究中使用的所有菌株的完整列表见于 表1.

  1. 触觉感受神经元突触的共聚焦成像
    1. 为了成像突触区域，使用配备488 nm和552 nm光学泵浦半导体二极管激光器的线扫描共聚焦显微镜，并连接图像采集软件。
    2. 使用最低放大倍数定位线虫。
    3. 当动物体位调整到位后，切换至40倍放大倍数，并加入浸没介质（本研究中使用的是40X/1.10 HC PL APO CS2多浸没物镜，采用水浸）。
    4. 通过488 nm激光（2%功率）激发GFP荧光基团，552 nm激光（1%功率）激发tagRFP荧光基团，以观察突触区域。
    5. 确定用于捕获完整突触区域的最佳x和y方向帧尺寸。在选择帧尺寸时，务必考虑最佳像素大小。本研究中获得的像素大小一致为56 nm。
    6. 使用混合型光电探测器采集图像，并设置增益以防止荧光染料过曝（488 nm 激发时设为 100%，552 nm 激发时设为 15%）。
    7. 使用与所用物镜相匹配的最佳z步长，采集覆盖整个突触的z轴层扫图像。本研究中采用的最佳z步长为0.211 nm。
      注意：确保在严格条件下拍摄所有图像，以便进行整合的荧光定量与比较。可通过在所有采集图像中保持显微镜参数一致来实现（即激光与检测器设置、像素大小、扫描速度以及最佳z步进尺寸）。最佳设置取决于所用物镜，可使用可获取的生物信息学程序（如Nyquist计算器，https://svi.nl/NyquistCalculator）进行计算。系统性地标记图像，这在使用基于文件名组织和处理文件的生物信息学软件时将非常有用。
  2. 突触区域的定量分析
    1. 为分析突触区域，将图像导出为TIFF文件。可使用基于Java的图像处理软件（如ImageJ）进行处理（本研究中使用了ImageJ中的MRI图像转换宏）。
    2. 使用 CellProfiler-3.1.5 对获取的 z 层图像进行最大强度投影后，测量突触的大小及整合荧光强度水平。将图像载入 CellProfiler 3.1.5 软件中。如有需要，可根据图像文件名对图像进行筛选。
    3. 设置名称和类型模块。可选地，从图像标签中提取元数据，以相应地组织计算得到的数据。
    4. 通过使用弥散性表达的tagRFP手动界定突触区域来确定突触区域 uIs115(Pmec-17::tagRFP) 转基因。这可以通过将相应的模块添加到 CellProfiler-3.1.5 分析流程中来实现。
    5. 为了测量手工定义的突触的大小和荧光强度，添加 测量 物体 大小 和 形状 和 测量 物体 强度 将模块添加到流程中。
    6. 通过累加各部分的荧光强度来计算相对总荧光强度 计算 数学 模块。将从整合强度单位中获得的数据进行分割 jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) 由所获得的整合单元决定 uIs115(Pmec-17::tagRFP).
    7. 导出测量结果和计算数据。

5. 体壁肌肉结构的定量分析

  1. 荧光 体壁肌肉结构成像
    1. 获得携带转基因的菌株（例如，RW1596） stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))8，该方法用GFP标记肌球蛋白纤维。
      注意：将转基因引入动物体内可通过将目标品系与已表达该转基因的动物杂交，或向性腺远端臂显微注射DNA来实现。由以下因素诱导产生的“滚动”表型 rol-6 该转基因中的突变有助于肌肉的可视化。体壁肌肉沿背侧和腹侧分布，在野生型动物中通常难以观察，因为它们通常侧卧于一侧。 rol-6(su1006) 等位基因导致动物发生扭曲，从而暴露部分肌肉细胞以便成像。
    2. 使用配备高分辨率电荷耦合器件相机（CCD）、40倍或更高倍数物镜、GFP滤光片及图像采集软件的荧光显微镜对动物进行成像。
    3. 调整曝光时间和光照强度，以防止图像过饱和。
    4. 以400倍放大倍数拍摄并保存动物切片中至少包含一个完整可见斜肌细胞的肌肉图像。避免选择仅含不完整单个肌细胞的区域或焦距不清晰的切片区域。同时排除来自最前端和最后端区域以及靠近阴门区域的图像。
      注意：如果动物体内没有一个清晰可见的完整肌细胞，可轻轻滑动盖玻片以翻转动物，从而暴露一个完整的细胞。
  2. 肌细胞面积的测量
    1. 在 Fiji 软件中打开图像9 （本研究使用了2.0.0版本）。
    2. 使用多边形选择工具仔细勾勒单个斜肌细胞的轮廓。通过拖动锚点调整多边形线条的末端，以优化勾勒效果。
    3. 前往 分析 软件顶部的标签并点击 测量 计算所选区域的面积。将显示一个独立的结果表格，其中包含面积及其他测量数据。如果结果表格中缺少面积测量值，请前往 设置 测量 在……之下 分析 单击选项卡并确认已勾选面积框。同样，取消勾选其他不需要的测量选项。
    4. 对于发生退化或缺失区域的肌细胞，使用多边形选择工具勾勒缺失区域并点击 测量 如果有多个细胞间隙，则需分别描记每个间隙。
    5. 计算单个肌细胞中空隙区域面积与整个细胞面积的比值。该比值较高表明细胞内存在较大空隙，提示肌肉变性程度较高。若无缺失区域（如野生型动物中常见情况），则该比值为零。
      注意：作为对照，需同时通过肉眼观察评估肌肉结构缺陷，并将结果与定量测量进行比较。当实验室首次研究某一品系时，此步骤尤为有用。进行表型评分时，应根据肌丝完整性判断个体是否为缺陷型。例如，若个体出现肌丝横纹结构模糊、GFP 聚集或因结构破坏导致肌细胞内出现空隙等情况，则记为缺陷型。
  3. 肌纤维长度的分割与定量
    1. 如有必要，首先将文件转换为 .tif 使用 Fiji 或其他软件包。将 TIFF 文件保存至指定位置。
    2. 打开 ilastik10 （免费软件，1.3.2 版本可从 https://www.ilastik.org/ 下载）。
    3. 进入 ilastik 后，选择 像素 分类 下 创建 新 项目软件将提示保存项目。重命名项目并保存至指定位置。
      注意：新项目只需创建一次。后续分割可使用同一项目完成。如需使用相同的项目设置，请前往 项目 顶部的标签，然后点击 开放 项目 以访问项目文件。
    4. 左侧面板应有 5 个标签页（Input Data、Feature Selection、Training、Prediction Export 和 Batch Processing）。在 输入 数据 标签，单击 添加 新 然后 添加 分离 图像 将弹出窗口导向包含 TIFF 文件的文件夹，并选择要打开的图像。
    5. 在下方的下一个标签页中（特色 选择），点击 选择 特点 选择所有像素特征，即由绿色勾选框标示的特征。此步骤中的像素选择用于在下一步中区分不同类别的像素。
      注意：像素特征选择取决于图像分辨率。因此，若处理能力和时间允许，开发者建议尽可能选择全部或尽可能多的特征。
    6. 以下 培训 面板可根据像素对不同对象类别进行分类。在此情况下，两类分别为表达GFP的肌球蛋白细丝以及不需要的背景或模糊边缘。点击 添加 标记 添加第一个标签。在多个纤维上涂鸦，以开始分类器训练。
      注意：双击标签可更改名称（例如，将“label 1”重命名为“filament”）。双击彩色方框可更改绘图和概率显示的颜色。画笔的默认大小为1，但可增大至61。若绘制了错误的像素，可直接使用橡皮擦工具删除绘图。可使用键盘快捷键（-）和（Shift +）分别实现图像的缩小与放大。方向键用于在图像中导航。
    7. 添加第二个标签并将其重命名为 背景涂抹掉不需要的背景以及纤维之间的空白区域。
    8. 点击 活体 更新 并确保软件已正确完成分类。如有必要，添加更多涂鸦并进一步优化训练。
      注意：在此步骤中，需密切关注融合的纤维和模糊的边缘（如体线）。应尽可能优化此处的预测，以提高测量的准确性。预测准确性还取决于图像分辨率，因为低质量图像中的像素更难区分。建议（可选但推荐）运行 过滤 方法 在 建议 特点 功能邻近 活体 更新 对照
    9. 训练分类器完成后，进入 预测 导出 面板。单击 选择 导出 图像 设置 与 概率 作为来源。
    10. 使用以下设置。裁剪子区域 x 和 y 已勾选，且 c 未勾选。起始值和终止值为 c 应分别为 0 和 1。勾选并转换数据类型 转化 转换为无符号8位，勾选重新归一化[min, max]并使用默认值。将输出文件视频的格式更改为PNG，并根据需要重命名文件和目录。
    11. 关闭导出设置窗口，并导出刚刚完成分割的特定图像。
    12. 在 Fiji 软件中打开保存的 PNG 图像。图像应以黑白形式显示。
    13. 使用默认设置调整图像的阈值。
    14. 应用骨架化插件（Skeletonize 2D/3D，然后 Analyze Skeleton）。将显示一个独立的结果表格，其中包含分支长度。该分支长度代表纤维长度。结果中的其他数据也可能有用，例如欧氏距离。
      注意：忽略长度为0 µm或超过250 µm的纤维，因为这些尺寸在生理上是不可能的。

6. 线粒体形态的定量分析

注意：本研究使用 BXN0387 品系，该品系含有 uIs115(Pmec-17::tagRFP)5 转基因以可视化 PLM 神经元，以及 jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP)11 以特异性可视化 PLM 神经元内的线粒体，用于线粒体形态的定量分析。本研究在同步化的 3 日龄成虫线虫中进行，但也已在其他年龄阶段及其他组织中成功实施7。

  1. PLM神经元内线粒体的荧光成像
    1. 为了测量 PLM 神经元内线粒体的大小和形态变化，使用荧光转基因同时标记背景神经元和线粒体进行观察。
    2. 使用配备488 nm和552 nm光学泵浦半导体二极管激光器及图像采集软件的共聚焦显微镜对PLM神经元进行成像。
    3. 按照上述步骤 4.1.1–4.1.4 对线虫进行成像，确保使用非饱和曝光条件。
    4. 为了可视化整个神经元，可能需要获取一幅拼接图像。为此，可使用具有拼接扫描功能的软件，先在神经元一端的角落定位并放置一个标记，然后找到其对侧末端并放置另一个标记。软件将自动计算出覆盖所需区域的最佳图像拼接数量。
      注意：为了缩短扫描时间，通常更容易定位位于单一平面上的神经元，这样可减少成像 tile 的数量。
    5. 为将拼图扫描与Z轴层扫结合，请在开始拼图扫描前设置下限和上限，并确保已设定最佳切片尺寸。
    6. 确保分辨率已优化，因为更高的分辨率会使分割更加精细（此处使用的分辨率为3224 x 3224像素）。
      注意：尽管 uIs115(Pmec-17::tagRFP) 转基因用于标记PLM并成功定位相机，由于观察到微弱的背景荧光，因此不一定需要对其进行成像 jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP) PLM 轴突自身的转基因。因此，可通过从实验中移除 552 nm 滤光片来减少扫描和成像时间。
  2. 使用 SQUASSH 进行对象分割
    1. 将图像文件转换为 .tiff 使用 Fiji 成像软件对 Z 轴层扫图像生成最大强度投影。在确保包含完整神经元的前提下，将图像裁剪至最小尺寸，以降低计算负荷并减少背景噪声。
      注意：在代表性结果中，仅考虑长轴突过程内的线粒体，因此每个图像中的细胞体及其内部的线粒体均被排除。
    2. 使用 ImageJ 的 Mosaic Suite SQUASSH 宏执行分裂布雷格曼分割12 在最大投影图上。有关该宏的安装和应用的详细指南可在 Mosaic 网站（http://mosaic.mpi-cbg.de/）获取，并由 Rizk 等人进行了描述。. 201413图像分割的过程简述如下。
      注意：该分割方法通过荧光强度阈值识别对象（在此为单个线粒体），从而实现对每个独立对象的大小和形状进行准确测量。
    3. 使用滚动球方法去除图像中的背景噪声，该方法通过一个用户定义的窗口在图像上移动，从每个窗口内出现频率最高的灰度值来估算局部背景强度，从而校正不均匀的背景灰度。
    4. 使用目标检测方法，根据荧光强度和像素数量，粗略定位图像中包含目标对象（线粒体）的区域。控制该步骤的参数为正则化参数和最小目标强度。
      注意：使用正则化可避免对由噪声引起的小强度峰进行分割，而最小对象强度阈值有助于从背景组织荧光中识别亚细胞器。这两个是用于优化线粒体分割效果的主要参数，优化过程通常需针对测试图像尝试不同参数组合，并结合手动检查，以实现最佳分割。
    5. 使用软件估算每个对象周围的局部背景强度，以辅助计算最佳分割。
    6. 通过像素数量测量单个物体的尺寸、周长和长度，以及信号强度和图像上的 x/y 位置。为计算以纳米（nm）为单位的尺寸测量值，需考虑原始图像的像素大小。
      注意：每次实验前必须首先计算最佳参数。为确保分割的准确性，建议先对测试图像进行 SQUASSH 分析，并手动检查分割结果的准确性。该宏将生成输出文件，显示在原始图像上识别出的各个对象，仔细检查这些结果并根据需要调整参数，可确保实现准确的分割。随后，为保证实验结果的可比性，整个实验必须使用相同的定义参数。代表性结果所用的参数已包含在 表2.
    7. 打开 Fiji 或 ImageJ 分析软件，导航至 Mosaic 宏容器并打开 SQUASSH 菜单。
      1. 打开 背景 减法 子菜单并确保 移除 背景？ 检查完毕。窗口大小的默认值为 10。
      2. 设定所需的 正则化 和 通道1的最小物体强度 根据最佳值来识别和分割对象（参见步骤 6.2.4）。 通道 2 对于标记有单个转基因的对象，无需进行数值测定。
      3. 点击 根据物镜特性估算点扩散函数 根据显微镜的特性估算点扩散函数。这有助于通过考虑每个像素对其邻近像素的影响，实现对位置相近物体的分割。
        注意： 亚像素分割 由于会增加计算机处理负担，本实验未使用该方法。 细胞掩膜 也未被使用，因为轴突易于界定。这些设置适用于更复杂的组织，并可用于逐细胞地定义细胞对象。
      4. 可视化选项设置，请确保 物体轮廓 和 保存对象和图像特征 检查完毕。为后续在图形和统计软件中使用，请确保输入了正确数量的条件。
    8. 找到包含该文件夹的 .tiff 图像并运行宏。此过程可针对单个图像执行，也可针对文件夹内按基因型分类的一批图像批量执行。输出文件将与原始图像一同保存在该文件夹中。
  3. 形状的分析与测量
    1. 利用 SQUASSH 的输出结果提供逐项列出的对象数据 .csv 文件，其中每一行提供一个独立对象及其如上所述的测量数据。
      注意：尽管该宏程序可自动完成物体测量，但在SQUASSH分割后，始终需要手动检查输出图像，以确保宏程序已正确识别线粒体。
    2. 为分析每个线粒体的形态，采用二维的球形度指标进行测量， 圆形度，用于评估物体与理想圆形的偏差程度。
      注意：圆度是面积与周长的函数（圆度 = (4 × π) × (面积/周长)²）2) 其中1表示完美的圆形，0表示直线。该参数可通过图形和统计软件中的公式计算获得。
    3. 为确定线粒体群体在大小和形状上的变异情况，使用图形与统计软件，以0.2 μm为区间计算线粒体大小的直方图及拟合高斯分布，以0.05为区间计算线粒体圆度的直方图及拟合高斯分布。

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结果

C. elegans 由于其结构简单、细胞谱系明确、通体透明且拥有丰富的研究工具，是研究不同组织和细胞器形态的理想模式生物。本文介绍了利用活体荧光成像和免费生物图像处理软件，对细胞器（例如线粒体）以及突触和肌肉等组织进行定量分析的研究方法。

MEC-17 表达的严格调控对正常突触发育是必需的

为了进一步理解α-微管蛋白乙酰转移酶MEC-1714,15,16在神经系统中的功能，我们研究了在C. elegans中过表达该蛋白的触觉感受神经元中的突触形态17。这些细胞结构对神经元功能至关重要，因为它们能够将信号传递给相邻的神经元。使用激光扫描共聚焦显微镜采集PLM突触的图像，并利用可获取的生物图像处理软件进行定量形态学分析（<...

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讨论

形态学变异的评估通常通过手动计数明显差异，或使用任意阈值来判断与野生型表型相比的缺陷。然而，近年来，定量方法已被用于形态学的比较研究，以无偏倚地准确测量和描述细胞及亚细胞水平上的变化。识别表型之间细微但具有生物学意义的差异，是理解由环境因素或遗传疾病引起的形态变化背后分子机制的有力手段。计算能力的持续提升和显微成像分辨率的提高，结合秀丽隐杆线虫（C. elegans）遗传学易于培养和多用途的优势，为复杂的免费成像软件与精细的共聚焦图像相结合提供了理想平台。本文中，我们展示了在多种遗传背景下评估和量化突触大小及蛋白质定位、体壁肌面积与肌纤维长度以及线粒体形态的方法。

尽管这些分析方法已展现出量化细微形态学差异的能力，但仍存在一定的局限性。虽然每种分析方法都使用了开源且易于获取的软件，但它们依赖高质量、高清晰度的图像，以准确分辨细胞结构和亚细胞器。这常常成为限制因素，因为需要使用敏感的高端设备（如配备先进探测器的共聚焦显微镜）才能获得满足分辨率要求的图像。这类设备并非所有实验室都能获得，而使用性能不足的技术进行分析可能导致结果不准确且不可重复。此外，尽管每种技术都旨在...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

我们感谢Neumann实验室成员提供的宝贵讨论和建议。部分菌株由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。作者感谢WormBase提供了关于C. elegans的丰富信息，并感谢莫纳什大学莫纳什显微成像中心提供仪器设备、培训和技术支持。本研究得到了CMTAA研究基金（2015年和2018年）以及授予B.N.的NHMRC项目基金1101974和1099690的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂Merck1.01614.1000
琼脂糖Invitrogen16500-500
共聚焦显微镜LeicaTCS SP8倒置平台
荧光显微镜Carl Zeiss AGZeiss Axio Imager M2
盖玻片 #1Thermo scientifiqueMENCS22221GP
盖玻片 #1.5Zeiss474030-9000-000由 SCHOTT 生产
载玻片Thermo scientifiqueMENS41104A/40
LED 光源SchottKL 300 LED
体视显微镜OlympusSZ51
胰蛋白胨（酪蛋白胨）Merck107213LB 培养基（Lysogeny Broth）成分
酵母提取物Merck103753LB 培养基（Lysogeny Broth）成分
氯化钠Merck106404LB 培养基（Lysogeny Broth）成分
蛋白胨（肉源蛋白胨）Merck107214线虫生长培养基（NGM）琼脂成分
琼脂SigmaA1296线虫生长培养基（NGM）琼脂成分
氯化钠Merck106404线虫生长培养基（NGM）琼脂成分
胆固醇SigmaC8667-25G线虫生长培养基（NGM）琼脂成分
氯化钙Merck102382线虫生长培养基（NGM）琼脂成分
硫酸镁Merck105886线虫生长培养基（NGM）琼脂成分
磷酸氢二钾Merck105101线虫生长培养基（NGM）琼脂成分
磷酸二氢钾Merck104873线虫生长培养基（NGM）琼脂成分
磷酸氢二钠Merck106586M9 缓冲液成分
氯化钠Merck106404M9 缓冲液成分
磷酸二氢钾Merck104873M9 缓冲液成分
硫酸镁Merck105886M9 缓冲液成分
巴斯德吸管CorningCLS7095D5X-200EA
培养皿CorningCLS430589-500EA
铂金丝Sigma267201-2G
刮勺Met-app2616
盐酸四咪唑SigmaL9756-5G

参考文献

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