用于评估细胞运动和相关信号事件的机械控制的单细胞Durotaxis测定

摘要

机械力对于控制细胞迁移非常重要。该协议演示了弹性水凝胶的使用，可以使用玻璃微移液器和微操纵器变形，以刺激具有局部刚度梯度的细胞，从而引起细胞结构和迁移的变化。

摘要

杜罗拉茨是细胞感知和响应紧张梯度的过程。为了在体外研究这个过程，必须操纵细胞基础基板的刚度。虽然具有分级刚度和长期迁移检测的水凝胶已证明在durotaxis研究中有用，但是对基质张力局部变化的即时急性反应允许对单个细胞运动和亚细胞信号事件进行重点研究。为了重复测试细胞对底层基底刚度的感知和反应能力，采用了一种改进的方法，用于对在可变形水凝胶上培养的单个细胞应用增加张力的急性梯度，从而实现实时操作刚度梯度的强度和方向传授给有问题的细胞。此外，通过微调测定的细节和参数，如微移液器的形状和尺寸或应用梯度的相对位置、位置和方向，可以优化测定，以进行机械研究。敏感细胞类型和系统。这些参数可以改变，以可靠地改变应用的刺激，并扩展测定的功能和多功能性。这种方法允许检查长期的柔化运动，以及细胞信号和形态动力学的更直接的变化，以响应不断变化的刚度。

引言

在过去的几十年里，细胞环境的机械特性的重要性在细胞生物学中得到了越来越多的认可。不同的组织和细胞外基质具有不同的相对刚度，当细胞在全身迁移时，它们会导航这些变化，使用这些机械特性来引导它们1，2，3^,4,5,6,7.细胞使用给定组织的刚度在发育、伤口愈合和癌症转移等过程中告知其活动行为。然而，允许感觉和响应这些机械输入的分子机制在很大程度上仍然未知1，2，3，4，5，^6,7.

为了研究细胞对物理环境线索的反应机制，必须操纵基底基体附着细胞的刚度或刚度。2000年，罗春敏、王玉丽及其同事研制出一种测定8，通过拉伸可变形的细胞外基质（ECM）涂层聚丙烯酰胺，直接测试单个细胞对机械线索变化的移动反应。水凝胶，细胞被镀。细胞表现出对向更硬基质迁移的偏好，他们称之为"杜罗塔克"。

自2000年提交原始报告以来，还采用了许多其他技术来研究杜罗塔。通过将凝胶铸造在硬质特征（如聚苯乙烯珠⁹或硬聚合物柱^10）上，或通过在玻璃盖玻片¹¹的边缘聚合基板来制造陡峭的刚度梯度，从而形成机械性'步进边界'。或者，采用较浅但固定刚度梯度的水凝胶由多种方法制成，例如微流体装置^12、13或并排水凝胶溶液液滴创建的交联物梯度不同的刚度 8 ，或水凝胶与光活联处理与分级紫外线光曝光，以创建线性刚度梯度 14 ， 15 。这些技术已经被用来研究随着时间的推移，大量的二维细胞运动。然而，这些特征通常是在细胞电镀之前制造的，在实验过程中，它们的性能保持一致，依靠随机细胞运动对机械梯度进行采样。这些技术都无法观察细胞行为在急性机械刺激下的快速变化。

为了观察细胞对机械环境急剧变化的反应，单细胞durotaxis测定具有几个优点。在这些测定中，通过用玻璃微移液器将底层基板从细胞中拉出，从而引入细胞基质张力的方向梯度，从而给单个细胞一种急性的机械刺激。然后，活细胞相对比显微镜观察移动行为的变化，如迁移的速度或方向。这种方法有助于直接观察机械刺激和细胞迁移之间的因果关系，因为它允许快速、反复地操作张力梯度的方向和幅度，并评估其细胞实时反应。此外，该方法还可用于机械刺激细胞表达荧光融合蛋白或生物传感器，以可视化被怀疑参与机械感应和杜罗塔斯。

这项技术已被研究杜罗塔克8，16的小组使用，并在这里描述，因为它已被豪实验室改造，以研究SKOV-3卵巢癌细胞的杜罗法行为和分子机制，下杜罗塔17。此外，还描述了一种改进方法，用于在细胞培养表面附近用单层甚至荧光微球制造水凝胶;这有利于微移液器生成的应变梯度的可视化和优化，并可能允许通过牵引力显微镜评估细胞收缩性。

方案

1. 用嵌入式荧光微球制造可变形的聚丙烯酰胺水凝胶

注:方向描述直径为 22 μm、厚度约为 66 μm 的 25 kPa 水凝胶的聚合。可以修改每个或所有这些参数，并在表 1和备注¹⁷中找到这样做的方向。

1. 激活玻璃底餐具或盖玻片
   1. 准备结合硅烷工作溶液，用于激活玻璃底成像盘或适合活细胞成像室的盖玻片。混合 950 μL 的 95% 乙醇、50 μL 的冰川醋酸和 5 μL 的结合硅烷（y-甲氧丙烯氧氧硅烷）。
      注:与顶盖玻片相比，使用更大的底盖玻片在制备凝胶时将留出额外的工作空间，并有助于在后面的步骤中定位玻璃微移液器。此外，如果使用盖玻片而不是玻璃底成像盘，请按照以下部分所述清洁盖玻片。
   2. 用电晕棒激活玻璃表面 20 s，并立即覆盖 50 μL 的粘结硅烷工作溶液。让溶液干燥10分钟。
   3. 用95%乙醇冲洗两次，然后用异丙醇冲洗两次，然后让盖玻片通风约20分钟。
      注:激活的玻璃可在干燥器中存放长达一周。
2. 清洁顶盖唇
   1. 在 70°C 下孵育 2% HCl 30 分钟，然后在 ddH₂O 中洗涤 10 分钟，清洁 22 mm 顶部盖玻片。
   2. 在 2% 的比色皿溶液中孵育盖玻片，在 50°C 下将浓缩液浓缩在 ddH₂O 中 30 分钟，然后在 ddH₂O 中洗涤 10 分钟两次。
   3. 在90°C下孵育ddH₂O的盖玻片30分钟，然后在70°C下在70°C中孵育10分钟，然后在60°C下晾干至少2小时。
      注:清洁的盖玻片可以无限期地存放在清洁的干燥器中。
3. 荧光微球/珠沉积在顶部盖玻片上
   1. 在超声波水浴中将荧光微球的库存溶液声波1小时。将珠子1:200在100%乙醇中稀释，再用声波1小时制作工作珠溶液。
   2. 在珠子溶液完成声波处理前15分钟，将盖玻片垂直放置在陶瓷盖玻片支架中，并在桌面等离子清洗器中用室内空气等离子体处理3分钟，彻底清洁盖玻片。
   3. 为了便于处理并防止在后续步骤中滑动盖玻片，将一块片片片放在 60 mm 培养皿盖或类似容器中。将盖玻片放在稳定器中，轻轻向下敲击，确保片胶和盖玻片之间保持良好的接触。
   4. 对于 22 mm 盖玻片，将 150 μL 的工作珠溶液添加到盖玻片顶部。立即从盖玻片侧面吸出乙醇溶液，将珠子留在盖玻片上。让盖玻片通风。
      注:添加的工作珠溶液的量应为+4 μL/cm^2，并可缩放以适应任何尺寸的盖玻片。
4. 铸造带嵌入式荧光珠的水凝胶
   1. 制备丙烯酰胺和二丙烯酰胺的水凝胶溶液。根据表1混合溶液，然后加入2.5 μL的10%APS和0.5 μL的TEMED。混合好。立即移动到下一步。
      注:水凝胶溶液混合物可以通过改变丙烯酰胺与二丙烯酰胺的比例来改变杨的模量或刚度，如表1所示。这些值已验证，可在豪实验室使用原子力显微镜，但应在机构内确认。
   2. 制作水凝胶溶液后，立即将 25 μL 滴到玻璃底盘或底盖玻片的激活侧，然后立即将镀珠涂层盖玻片放在溶液上，珠侧向下。将跌落与盖玻片的远侧接触，然后缓慢降低，有助于避免在水凝胶中捕获气泡。
      注:水凝胶的高度应位于目标透镜的工作距离内，以备后续实验使用。水凝胶高度为 66 μm，适用于大多数系统。水凝胶的大小可以通过根据盖玻片的大小添加更多或更少的水凝胶溶液来缩放。要计算水凝胶溶液的适当体积，请使用圆柱体体积的方程，V = μr²h，其中r是盖玻片半径，h 是所需的水凝胶高度。 通常，此计算可以相当准确地预测水凝胶的实际高度，通过在顶部和底部制备带有珠涂层盖玻片的凝胶并使用共聚焦显微镜测量两个珠平面之间的距离来测量。然而，据观察，水凝胶的实际高度可能偏离此计算 ±20 μm（例如，取决于顶部玻璃盖玻片的厚度和制造商）。建议使用上述方法直接测量凝胶高度。
   3. 让凝胶聚合30分钟，然后用钳子轻轻取出顶盖滑。向盘中添加 50 mM HEPES pH 8.5 可促进去除。在 50 mM HEPES pH 8.5 中洗涤 5 分钟，三次。
5. 水凝胶活化和细胞外基质涂层
   1. 在 50 mM HEPES pH 8.5 中孵育 0.4 mM Sulfo-SANPAH（磺酸二氮酰胺 6-（4'-azido-2'-硝基苯甲酸酯）六溴二苯酚，激活水凝胶表面。立即暴露在封闭区域的紫外线电弧灯中。
      注:在激活前保护 Sulfo-SANPAH 免受光光照射。对于 400 W 灯，将凝胶放置在灯箱内，将凝胶与灯泡 10 厘米分开，并亮起 100 s。Sulfo-SANPAH 溶液将从亮橙色变为深棕色。
   2. 在 50 mM HEPES pH 8.5 中洗涤 5 分钟，三次。
      注:水合凝胶可在4°C下储存长达一周。
   3. 在50 mM HEPES pH 8.5中孵育活性水凝胶20μg/mL纤维素，在37°C下孵育1小时。
   4. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中吸气纤维奈酸溶液，洗涤5分钟三次。在低体积的PBS组织培养罩下，在紫外线照射下对水凝胶和盘子盖进行15分钟的消毒。在无菌PBS中洗一次。
      注:其他类型的ECM蛋白可用于涂覆水凝胶，包括胶原蛋白和层宁。

2. 电镀电池

1. 加入含有21，000个细胞的3 mL培养基，以填充60毫米的培养皿，最终细胞密度为±1000细胞/cm^2。根据需要调整播种密度，以防止拥挤，并允许单个细胞自由移动。
2. 在成像之前，让细胞在37°C下恢复至少4小时，长达18小时。在添加成像介质之前，使用成像介质进行两次成像，为成像做好准备。在成像前，让细胞平衡至少30分钟。
   注:提前筛选媒体条件，以确定将优化所用细胞系迁移的条件。对于SKOV-3细胞，不含苯酚红的DMEM，含有20 mM HEPES和12.5纳克/mL表皮生长因子，可刺激最大迁移。Ref52细胞的最佳条件是Ringer的缓冲液，具有10%的胎儿牛血清（FBS）和25纳克/mL血小板衍生的生长因子。

3. 玻璃微移器的制备:移液器拉拔和锻造

1. 在两步工艺中拉出 100 mm 长的硼硅酸盐玻璃微移管，其外部为 1.0 mm，内部直径为 0.58 mm，以获得超过 2 mm 的分片，在第一毫米内降至 ±50 μm，并在最后一毫米内延伸到一个直径为 10 μm 的长直径管。
2. 负载将移液拉入微锻造。将移液器塑造成一个 15 μm 钝尖，该尖端被封闭在 250 μm 截面的末端，从移液器的其余部分以 ±35° 角弯曲。弯曲处的近似直径应约为 30 μm，以增强刀尖的强度。
   注:可以调整尖头尺寸以正确施加所需的力（参见步骤 5）。在第一步65°C下拉动微移液器3毫米，第二步60°C，产生步骤3.1中描述的尺寸。使用不同移液拉拔器的结果可能会有所不同。
3. 使用前用70%乙醇对微管器进行消毒。

4. 定位微操作器和微移液器

1. 取出盘子盖，将盘子加载到显微镜台和中央。使用 10 倍或类似的低放大倍率目标。用矿物油覆盖介质，防止介质蒸发。
2. 插入拉移液器
   1. 将拉杆插入微移液器护套，将钩子朝下朝向盘子。当降低到凝胶时，钩尖将是最低点。
   2. 将护套插入微操作器并进行调整，直到移液器尖端在 X 和 Y 方向上居中于物镜。
   3. 使用粗机械手降低移液器，直到它接触液体表面。
3. 使用相对比度或明场，将显微镜聚焦在凝胶顶部的珠层上。这将是参考平面。
4. 确保目标没有击中样品或阶段的危险，将焦点放在凝胶上方以找到微移液器的尖端，使用 X 和 Y 方向上的粗操纵器进行小调整，在焦平面上投射阴影。只有在确定移液器的尖端位于视场时，才降低微移液器。
5. 通过旋转护套中的移液器或旋转微操作器中的护套，确保微移液器的钝尖指向下，直到尖端垂直于焦平面。根据需要重复步骤 4.4 和 4.5。聚焦移液头。
6. 向下聚焦到凝胶的顶部珠层，以测量移液器离凝胶表面有多远。聚焦回到凝胶和移液头之间的部分平面。缓慢降低移液管以到达中间焦平面。
7. 重复步骤4.6，直到聚焦在水凝胶上时，可以欣赏微移液器尖端的微弱阴影。增加到下一个最高放大倍率。
8. 降低微操作器，直到微移液器尖端的阴影和折射在珠层焦平面内得到欣赏。
9. 将放大倍数增加到实验中使用的放大倍数。降低移液器，直到其悬停在水凝胶表面正上方。

5. 校准微操作器和力生成

1. 在相位或亮场中，降低悬停微移液器以接触水凝胶表面。观察移液器与水凝胶接触时的外观。继续降低 Z 中的微移液，直到 X 和 Y 的调整导致水凝胶在这些方向上的拉扯和偏转。使用微球或附近的细胞作为受托标记。
   注:如果微操作器连接到相电容臂或工作台，而不是样品级本身，在移动阶段之前务必分离凝胶，以避免破坏移液器或干扰细胞。如果移液中断，则返回步骤 3 和步骤 4。
2. 找到一个没有细胞的区域来啮合凝胶。向各个方向拉动，并熟悉微操作转化为凝胶变形的方式。
3. 拍摄珠场的荧光图像，无需操作，移液者与凝胶接触，并接合移液拉凝胶。重复几次，对微操作器上的刻度线、移液器尖端在拉取的每个阶段的相位或亮场中的外观以及尖端使用该操作移动的距离进行很好的笔记。
4. 使用前所述的ImageJ，通过将空珠场与无移液啮合的珠场、珠场与凝胶啮合的珠子场进行比较，计算应用于珠子的相对珠位和力。拉凝胶。
5. 要微调张力刺激，请使用不同的微移液尖尺寸、与细胞的距离或微操作器从初始接触点拉来的距离来比较力的应用。微移液器尖端尺寸对力应用的影响为用户提供了极大的灵活性，但也表明需要为新的微移液器生成力图，即使尺寸和形状与先前校准的吸头非常相似。

6. 进行杜罗塔斯测定

1. 在进行实验之前，练习将凝胶放在细胞附近，并在重新定位微操作器时观察细胞的变形。
2. 监测一组具有明显极性且看起来移动30分钟的细胞，以识别以定向方式移动的细胞。
3. 选择以单个清晰方向移动的单元格，然后以所需的帧速率再监视 30 分钟。
4. 如果需要确定对细胞施加的力或细胞施加的张力，则每次采集时捕获珠场图像。如果细胞在监测过程中改变其方向，请选择另一个细胞进行监测，因为这将使得很难确定刺激的效果。
5. 将水凝胶与水凝胶在离细胞约 50 μm 的地方接合。将移液器置于前缘近侧前面，并移动微操作器，使凝胶正交到细胞的移动方向。观察细胞随时间而对刚度的急性局部梯度的反应。
   注:此处提供的时间在监测SKOV3或Ref52成纤维细胞时是有效的，但是，间隔和整体时间过程应进行调整，以适应所观察到的细胞类型和生物事件。如果与荧光显微镜配对，在步骤 6.5. 之前暂停荧光采集，使用相对比度或明场定位微移液器和拉取器，并在之后立即重新启动荧光采集。
6. 如果移液移移器滑动，或者渐变被其他放松或释放，则通过重复步骤 6.2 和 6.3 找到新单元格。

7. 确定杜罗战术迁移响应

1. 使用 ImageJ¹⁹或其他图像分析程序，通过在 0 分钟和 30 分钟后监视器（反映单元格的原始轨迹）和中间的单元格中间线之间绘制一条线来计算转角。前缘和刺激后80分钟，测量这两条线之间的角度。

结果

通过制备微移液器（图1）和如上所述的拉力生成（图2和图3）标准化，为多个细胞系确定了最佳的二维战术条件。使用这种技术，如图4所述，SKOV-3卵巢癌细胞17和Ref52大鼠胚胎纤维细胞（图5）都朝着玻璃微移液器应用的梯度增加的刚度方向发展。除了杜罗塔，这种方法还可用于使用荧光生物传感器和标记来研究动态信号事件。例如，在焦力粘附结构内的结构和信号可以在杜罗战术刺激时观察到。Vinculin张力传感器（VinTS）是一种基于FRET的生物传感器，可对焦附着力进行局部化，允许荧光观察焦附着力动态，并测量这些结构内张力^{的变化19。}Ref52细胞在125 kPa聚丙烯酰胺凝胶上瞬时表达VinTS，显示在40分钟的拉伸方向上形成焦粘附（

讨论

这里演示的是一个可重复的单细胞durotaxis测定，允许评估细胞在响应急性机械提示时改变其迁移行为的能力。该技术还可用于荧光显微镜和适当的融合蛋白或生物传感器，以检查亚细胞信号和细胞骨骼事件在机械刺激的几秒钟内或超过较长的时间刻度杜罗法运动。了解细胞与其环境的关系涉及研究该环境的化学和机械方面的影响。虽然可能难以掌握，但这种杜罗塔斯测定可以广泛用于理解细胞对其机械微环境变化的反应。

相对于现有方法的重要性

如前所述，这种基于微移液的二维式刺激方法具有很强的可操作性，允许对机械刺激进行高度的时空控制，这是与其他技术（如预成型的线性或刚性的步进梯度。通过跟踪嵌入在水凝胶中的荧光珠位，在细胞培养表面附近，可以直观地显示传递应变梯度的大小和方向。

将这些基准标记限制在区域性表面正下方的单个图层可提高此跟踪的准确性。位于偏转平面下方的微球（由微移液器或牵引力显微镜，通过细胞收缩性进行），如在水凝胶中均匀混合微球时，其移动量将小于平面内微球，这可能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酰胺 40 %	国家诊断	EC-810
过硫酸铵	Fisher	BP179-25
BD20A 高频发生器	Electro Technic Products	12011A	115 V - 手持式Corona Wand
Bind硅烷（y-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷）（	Sigma Aldrich	M6514
Bis-acrylamide 2%）	国家诊断	EC-820
硼硅酸盐玻璃毛细管	世界精密仪器	1B100-4
Branson 2510 超声波清洗机	Bransonic		40 kHz 频率
粗调机械手	Narshige	MC35A
DMEM	康宁	10-013-CV
不含酚红的 DMEM	Sigma Aldrich	D5030
双级玻璃微量移液器拉拔器	Narshige	PC-10
表皮生长因子	Peprotech	AF-100-15
乙醇	Pharmco-aaper	111000200
胎牛血清（合格的一次性注射）	Gibco	A31606-02
纤连蛋白	EMD Millipore	FC010
荧光球羧酸盐 0.2 um	Invitrogen	F8810， F8807， F8811
Fugene 6	罗氏	1815091	1.5 μg DNA / 6 μL fugene 每 35 mm 培养皿 6
冰醋酸	Fisher Chemical	A38SI-212
玻璃底培养皿	CellVis	D60-60-1.5-N
玻璃盖玻片	电子显微镜科学	72224-01	22 mm， #1.5
HCl	JT Baker	9535-03
Hellmanex III 特殊清洁浓缩液	Sigma Aldrich	Z805939	在 ddH2O 中以 2% 使用，用于清洁盖玻片
HEPES 粉末	Sigma Aldrich	H3375	制作 50mM HEPES 缓冲液，pH 值 8.5
Intelli-Ray 400 遮蔽紫外线泛光灯	Uviton International	UV0338
异丙醇	Fisher Chemical	A417-4
Microforge	Narshige	MF900
显微作器	Narshige	MHW3
矿物油	Sigma Aldrich	M5904
纳米纯生命科学 UV/UF 系统	Barnstead	D11931	ddH2O
尼康 Eclipse Ti	尼康
OptiMEM	Invitrogen	31985062
Parafilm M	Bemis Company， Inc	PM-992
PBS			139 mM NaCl、2.5 mM KCl、28.6 mM Na2HPO<>4、1.6 mM KH2PO4，pH 7.4
血小板衍生生长因子-BB （PDGF-BB）	Sigma Aldrich	P4056
Ref52			大鼠胚胎成纤维细胞系;在 DMEM + 10% FBS
林格缓冲液			134 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgSO4、2.4 mM CaCl2、20 mM HEPES、5 mM D-葡萄糖，pH 7.4
SKOV-3	美国型培养物收藏		在 DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH 中培养	科瓦赫姆	12414-1
台式等离子清洁器	Harrick Plasma	PDC-32G
TEMED	西格玛奥德里奇	T9281-50