单细胞硬度趋性实验用于评估细胞运动及相关信号事件的力学调控

摘要

机械力在调控细胞迁移过程中起着重要作用。本实验方案展示了如何使用可变形的弹性水凝胶，通过玻璃微移液管和显微操作器施加局部刚度梯度，从而刺激细胞并诱导其结构和迁移行为的改变。

摘要

硬度趋向性（durotaxis）是指细胞感知并响应张力梯度的过程。为了在体外研究这一过程，必须调控细胞下方基底的刚度。尽管具有梯度刚度的水凝胶和长期迁移实验已被证明在硬度趋向性研究中具有应用价值，但细胞对基底张力局部变化的即时、急性反应，可实现对单个细胞运动及亚细胞信号事件的集中研究。为了可重复地检测细胞感知和响应其下方基底刚度的能力，现采用一种改良方法，即对培养在可变形水凝胶上的单个细胞施加急性增强的张力梯度，从而实现实时调控施加于目标细胞的刚度梯度的强度与方向。此外，通过精细调节实验的细节与参数，例如微移液管的形状与尺寸，或所施加梯度的相对位置、放置方式及方向，该实验方法可优化用于研究任何力学敏感型细胞类型及系统。这些参数的调整可可靠地改变所施加的刺激，从而扩展该实验的功能性与通用性。该方法既可用于研究长期的硬度趋向性运动，也可用于检测细胞在响应刚度变化时发生的即时细胞信号转导及形态动力学改变。

引言

在过去的几十年中，细胞所处环境的力学特性在细胞生物学中的重要性日益受到重视。不同的组织和细胞外基质具有不同的相对刚度，当细胞在体内迁移时，会感知并适应这些变化，并利用这些力学特性进行导向^{1,2,3,4,5,6,7}。细胞利用特定组织的刚度来调控其在发育、伤口愈合和癌症转移等过程中的运动行为。然而，介导细胞感知和响应这些力学信号的分子机制在很大程度上仍不清楚^{1,2,3,4,5,6,7}。

方案

1. 制备嵌入荧光微球的可变形聚丙烯酰胺水凝胶

注意：本说明描述了制备一个刚度为 25 kPa、直径为 22 μm、厚度约为 66 μm 的水凝胶的聚合过程。这些参数中的一项或全部均可进行调整，调整方法详见表 1及注释¹⁷。

1. 玻璃底培养皿或盖玻片的活化
   1. 制备用于活化玻璃底成像培养皿或适用于活细胞成像腔室的盖玻片的Bind Silane工作液。将950 μL的95%乙醇、50 μL冰醋酸和5 μL的Bind Silane（γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷）混合。
      注意：使用比上层盖玻片更大的底部盖玻片可在制备凝胶时提供更大的操作空间，并有助于在后续步骤中定位玻璃微电极。此外，若使用盖玻片而非玻璃底成像培养皿，请按照下一部分所述方法清洗盖玻片。
   2. 用等离子笔对玻璃表面进行20秒的电晕处理，随后立即覆盖50 μL的Bind Silane工作液。让溶液干燥10分钟。
   3. 用95%乙醇冲洗两次，再用异丙醇冲洗两次，然后让盖玻片在空气中干燥约20分钟。
      注意：活化后的玻璃可在干燥器中保存最多一周。

结果

通过制备微移液管（图1）并如上所述对牵拉力的产生进行归一化处理（图2 和 图3），已确定多种细胞系的最佳力学趋向性条件。利用如 图4 所示的技术，SKOV-3 卵巢癌细胞¹⁷ 和 Ref52 大鼠胚胎成纤维细胞（图5）均会朝向玻璃微移液管施加的刚度梯度较高区域移动。除力学趋向性研究外，该方法还可用于结合荧光生物传感器和标记物研究动态信号事件。例如，可在力学趋向性刺激下观察黏着斑结构及其内部的信号传导过程。Vinculin 张力传感器（VinTS）是一种基于 FRET 的生物传感器，可定位于黏着斑，从而实现对黏着斑动态变化的荧光观察，并测量其中张力的变化¹⁹。在 125 kPa 聚丙烯酰胺凝胶上瞬时表达 VinTS 的 Ref52 细胞，在 40 分.......

讨论

本文展示了一种可重复的单细胞刚度趋向性（durotaxis）检测方法，可用于评估细胞在急性力学信号刺激下改变其迁移行为的能力。该技术还可与荧光显微镜以及适当的融合蛋白或生物传感器联用，以在力学刺激发生后的数秒内，或在刚度趋向性运动的较长时间过程中，检测亚细胞水平的信号传导和细胞骨架事件。理解细胞与其所处环境之间的关系，需要研究环境的化学和力学因素对细胞的影响。尽管该刚度趋向性检测方法可能较难掌握，但其应用广泛，有助于深入理解细胞对其力学微环境变化的响应机制。

相对于现有方法的意义

如前所述，这种基于微量移液器的力学趋性刺激方法具有高度可操控性，能够对机械刺激实现高度的时空控制，这是相较于其他技术（如预先形成的线性或阶跃式刚度梯度）的一大优势。通过追踪嵌入水凝胶中、靠近细胞培养表面的荧光微球的位移，可以可视化所施加应变梯度的大小和方向。

将这些标记点限制在培养表面下方的单一层中，可提高追踪的准确性。如果微球位于偏转平面以下（该偏转由微移液管.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺	National Diagnostic	EC-810
过硫酸铵	Fisher	BP179-25
BD20A 高频发生器	Electro Technic Products	12011A	115 V - 手持式电晕探头
硅烷偶联剂（γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷）(	Sigma Aldrich	M6514
2% 双丙烯酰胺	National Diagnostic	EC-820
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100-4
Branson 2510 超声波清洗仪	Bransonic		40 kHz 频率
粗调操纵器	Narshige	MC35A
DMEM	Corning	10-013-CV
不含酚红的 DMEM	Sigma Aldrich	D5030
双级玻璃微电极拉制仪	Narshige	PC-10
表皮生长因子	Peprotech	AF-100-15
乙醇	Pharmco-aaper	111000200
胎牛血清（合格一次性装）	Gibco	A31606-02
纤连蛋白	EMD Millipore	FC010
Fluospheres 羧基荧光微球 0.2 μm	Invitrogen	F8810, F8807, F8811
Fugene 6	Roche	1815091	每 35 mm 培养皿使用 1.5 μg DNA / 6 μL Fugene 6
冰醋酸	Fisher Chemical	A38SI-212
玻璃底培养皿	CellVis	D60-60-1.5-N
玻璃盖玻片	Electron Microscopy Sciences	72224-01	22 mm，#1.5
HCl	JT Baker	9535-03
Hellmanex III 专用清洗浓缩液	Sigma Aldrich	Z805939	以 2% 浓度溶于 ddH2O 中用于清洗盖玻片
HEPES 粉末	Sigma Aldrich	H3375	配制 50 mM HEPES 缓冲液，pH 8.5
Intelli-Ray 400 快门式紫外泛光灯	Uviton International	UV0338
异丙醇	Fisher Chemical	A417-4
微电极成型仪	Narshige	MF900
显微操作器	Narshige	MHW3
矿物油	Sigma Aldrich	M5904
Nanopure 生命科学 UV/UF 系统	Barnstead	D11931	ddH2O
Nikon Eclipse Ti	Nikon
OptiMEM	Invitrogen	31985062
Parafilm M	Bemis Company, Inc	PM-992
PBS			139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4
血小板源性生长因子-BB (PDGF-BB)	Sigma Aldrich	P4056
Ref52			大鼠胚胎成纤维细胞系；在 DMEM + 10% FBS 中培养
Ringer 缓冲液			134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-葡萄糖, pH 7.4
SKOV-3	美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection）		在 DMEM + 10% FBS 中培养
Sulfo-SANPAH	Covachem	12414-1
台式等离子清洗仪	Harrick Plasma	PDC-32G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-50