利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

摘要

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的CD8αβ⁺单阳性T细胞的方法。

摘要

在体外生成和扩增功能性T细胞可带来广泛临床应用。其中一种用途是用于治疗晚期癌症患者。过继性T细胞转移（ACT）高度富集的肿瘤抗原特异性T细胞已被证明可在部分患者中引起转移性癌症的持久缓解。然而，在扩增过程中，这些细胞可能变得耗竭或衰老，从而限制其效应功能及在体内的持续存在。诱导性多能干细胞（iPSC）技术有望克服这些障碍，通过体外生成大量分化程度较低的肿瘤抗原特异性T细胞。人类iPSC（hiPSC）具有分化为任何类型体细胞的能力，包括淋巴细胞；当以T细胞作为起始细胞时，所生成的淋巴细胞可保留原始T细胞受体（TCR）的基因组重排。因此，将人类肿瘤抗原特异性T细胞重编程为hiPSC，再进一步重分化为T细胞谱系，有望产生“返老还童”的肿瘤抗原特异性T细胞。本文所述方法利用OP9/DLL1共培养系统，从hiPSC生成肿瘤抗原特异性的CD8αβ⁺单阳性（SP）T细胞。该方法是体外T细胞谱系生成的有力工具，将促进再生医学和细胞治疗中体外来源T细胞的开发与应用。

引言

除了具有生理学优势外，T细胞还具有多种潜在的治疗应用。体外生成和扩增T细胞可用于疾病建模和治疗验证，也可作为遗传性及获得性免疫缺陷状态（例如病毒性免疫缺陷以及由化疗或移植引起的继发性淋巴细胞耗竭）的治疗手段，还可用于根除癌症。后一特性推动了过继性T细胞转移（adoptive T cell transfer, ACT）技术的发展，用于治疗晚期癌症患者¹。 

过继性细胞疗法（ACT）包括切除患者的肿瘤组织，提取肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs），在体外扩增TILs，然后将扩增后的细胞重新输注回患者体内²。研究表明，该疗法对部分转移性癌症患者具有良好的治疗效果。 然而，并非所有患者对该疗法均有响应。既往研究显示，输注细胞的分化状态^{3,4,5,6,7,8,9}、使用大量高度富集的肿瘤抗原特异性T细胞¹⁰以及T细胞在输注后的持续存留能力^11,12均与更持久的治疗反应相关^13,14。因此，当ACT未能引发抗肿瘤反应时，其原因可能部分在于肿瘤抗原特异性T细胞产量较低、体外扩增效率低下导致反应性克隆耗竭或丢失，以及输注后细胞无法长期存留⁴。有研究推测，通过在体外生成大量低分化的肿瘤抗原特异性T细胞，可能克服上述障碍^15,16。 

造血干细胞/祖细胞（HSPCs）是体外生成T细胞的常规来源，但该方法受限于单个供体所能回收的细胞数量较少¹。胚胎干细胞（ESCs）也被证实能够产生T细胞，但产量较低¹⁷，导致其在临床应用中效率低下。此外，由于T细胞谱系在早期发育阶段会经历T细胞受体（TCRs）的随机基因重排，因此在不进行TCR基因转导等进一步基因组修饰的情况下，无法利用HSPCs或ESCs生成纯的抗原特异性T细胞群体。

克服这些局限性的一种方法是将肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重编程为人诱导性多能干细胞（hiPSCs），这可能为体外T细胞生成提供无限的细胞来源。已有研究表明，针对肿瘤抗原特异性的TILs可被重编程为hiPSCs，并可再次分化为T细胞谱系，且保留与原始T细胞相同的T细胞受体（TCR）基因重排^18,19。  这一点对于过继性细胞治疗（ACT）至关重要，因为每位患者的肿瘤具有独特的突变谱，而极少有肿瘤抗原被证实可在不同患者间共享²⁰。因此，利用针对肿瘤抗原特异性的TILs作为体外生成hiPSC来源T细胞的来源，可能为转移性癌症患者的个体化治疗提供一种新策略。

本文详细展示了一种利用OP9/DLL1共培养系统将hiPSC来源的T系细胞分化为功能性抗原特异性CD8αβ⁺单阳性（SP）T细胞的实验方案。该方法是一种强大的体外T细胞分化工具，适用于hiPSC、造血祖细胞和胚胎干细胞的T细胞诱导分化，并可进一步应用于再生医学和细胞治疗领域。

方案

1. 在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上培养人诱导多能干细胞（hiPSCs）

注意：也可采用其他方法培养 hiPSCs，包括但不限于：将细胞接种至预先包被明胶、明胶蛋白混合物、重组层粘连蛋白 511 或任何其他用于 hiPSC 扩增的细胞外基质的 6 孔板中，并使用专为人类多能干细胞培养配制的定义培养基进行培养。

1. MEF 培养
   1. 用 4 mL 0.1% 明胶包被一个 10 cm 的细胞培养培养皿，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   2. 将一管 4 × 10⁶ 经辐照处理的 MEF 快速解冻至 10 mL 37 °C 的 MEF 培养基（DMEM + 10% FBS + 1× 青霉素-链霉素 + 1× L-谷氨酰胺补充剂）中，在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 9 mL MEF 培养基中。
   3. 从培养箱中取出明胶包被的培养皿，吸除明胶溶液，加入 7 mL MEF 培养基。将 3 mL MEF 悬液（来自步骤 1.1.2）接种至明胶包被的培养皿中。轻轻左右及前后摇晃培养皿，确保 MEF 在皿内均匀分布。在 37 °C 下孵育 8–36 小时。
2. 在 MEF 上传代 hiPSC
   注意：本实验数据使用的是来源于长期培养的黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的 MART-1 iPSC，该细胞特异性识别 HLA-A*02:01 限制性 MART-1 肽段，如先前所述¹⁸。 
   1. 当 hiPSC 克隆直径达到 0.8– 1.2 mm 时进行传代。传代前，在体视显微镜下检查 hiPSC 克隆，并使用 200 µL 吸头的塑料边缘去除培养物中已分化的区域。
   2. 吸除废弃培养基，加入 10 mL hiPSC 培养基（人胚胎干细胞培养基 [材料表] + 10 ng/mL 人碱性成纤维细胞生长因子 [hbFGF]），并补充 10 μM ROCK 抑制剂。
   3. 一手持培养皿，另一手持一次性细胞传代工具，沿一个方向在整个培养皿表面滚动。施加足够压力，使滚刀整个刃面均接触培养皿表面，并在滚动过程中保持压力均匀。
   4. 将培养皿旋转 90°，重复步骤 1.2.3。在显微镜下观察培养皿，确认克隆已被正确切割，呈现棋盘状。使用 200 μL 移液器轻柔吹打，使被切割的克隆脱落。 
      注意：切割后必须立即通过机械吹打使克隆脱落，因为切割 3 分钟后，克隆将开始重新贴附于培养皿表面，导致难以通过吹打获得大小均一的细胞团。
   5. 将 350– 600 个被切割的克隆团块转移至一个新的 10 cm MEF 培养皿（MEF 应在 hiPSC 传代前 8– 36 小时铺板），加入 10 mL 新鲜 hiPSC 培养基（含 10 μM ROCK 抑制剂）。在 37 °C 下孵育。
      注意：600 个克隆团块约相当于 1.0 × 10⁶ 个 MART-1 iPSC，在第 35 天可获得 0.5–1.0 × 10⁶ 个 DP 细胞。然而，实际数量会因起始细胞系的潜能及培养条件的不同而有所差异。
   6. 次日，吸除废弃培养基，加入 10 mL 新鲜 hiPSC 培养基。根据 hiPSC 的生长速度，每 1–2 天更换一次培养基。

2. 准备用于与hiPSCs共培养的OP9/DLL1细胞

1. 在37 °C下，使用OP9培养基[α-最低必需培养基（α-MEM）+ 20% 胎牛血清（FBS）+ 1×青霉素-链霉素]培养OP9/DLL1细胞。当OP9/DLL1细胞达到汇合状态时，吸除培养基，并用5 mL不含镁、钙和酚红的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。
2. 吸除PBS，加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。 在37 °C下孵育5分钟。然后加入4 mL OP9培养基，通过移液器吹打使细胞层机械解离，形成单细胞悬液。
3. 将细胞悬液经100 μm细胞滤网过滤后转移至50 mL锥形管中，以避免细胞团块。在4 °C下以300 x g离心5分钟。吸除上清液，用12 mL OP9培养基重悬细胞。 
4. 向六个新的10 cm细胞培养皿中各加入8 mL OP9培养基。将步骤2.3中制备的2 mL OP9/DLL1细胞悬液接种至每个新的10 cm培养皿中。轻轻左右摇晃培养皿，再前后摇晃，以确保OP9/DLL1细胞在培养皿内均匀分布。
5. 在37 °C下孵育。当细胞达到汇合状态时，每2– 3天进行一次传代。
   注意：重要的是要制备足够量的OP9/DLL1细胞冻存储备，并每隔4–6周解冻一次新储备。

3. 将人诱导多能干细胞体外分化为CD8αβ⁺单阳性（SP）T细胞

1. 提前一周制备明胶化的OP9/DLL1培养皿，用于与hiPSCs共培养。制备0.1%明胶溶液时，将5 mL室温（RT）组织级明胶储备液加入500 mL PBS中。
   1. 向3个新的10 cm细胞培养培养皿中分别加入4 mL 0.1%明胶，进行包被。  37 °C 下孵育 30 分钟。 
   2. 吸除明胶，每皿加入8 mL OP9培养基。将一皿汇合的OP9/DLL1细胞（如上文第2节所述）传代至三皿预先包被明胶的培养皿中。
2. 4天后，向每块含明胶包被的OP9/DLL1细胞的10 cm培养皿中加入10 mL OP9培养基，使每皿培养基总体积达到20 mL。
3. 7 天后 8天后，开始将hiPSC与汇合的OP9/DLL1培养皿共培养（分化第0天）。
   1. 从接种在MEF上的汇合度为10 cm的hiPSC培养皿中吸除用过的培养基，加入10 mL OP9培养基。使用一次性细胞传代工具，按照步骤1.2.3和1.2.4的方法切割并分离hiPSC克隆。
   2. 转移 350 - 使用200 μL移液器将600团切割后的克隆均匀接种至含10 mL新鲜OP9培养基的10 cm预明胶包被的OP9/DLL1培养皿（步骤3.1）中。轻轻左右摇动培养皿，再前后摇动，以确保克隆分布均匀。
      注意：也可使用预先形成的 hiPSC 胚状体（EBs）或小团块悬浮液。  然而，建议使用一次性细胞传代工具或拟胚体形成系统来制备大小均一的hiPSC细胞团。
4. 第1天，吸除用过的培养基，更换为20 mL新鲜的OP9培养基。在OP9/DLL1上共培养1天后，hiPSC细胞团将呈现为小的圆形单层克隆（图1).
5. 第5天，吸除10 mL用过的培养基，加入10 mL新鲜OP9培养基。hiPSC集落将开始分化为原始中胚层，其特征是具有多层深色中心。
6. 第9天，吸除10 mL用过的培养基，加入10 mL新鲜OP9培养基。此时，多层中心结构将发育为圆顶状，周围开始出现网状的外围区域。
7. 第13天收获造血祖细胞（HPCs）（图1）。第13天的hiPSC来源结构特征为中央有一个深色类器官，周围环绕着穹顶样区域组成的网络，代表此前报道的造血区（HZs），这些区域曾被发现包裹人胚胎干细胞来源的造血祖细胞。²¹.
   注意： 穹窿样结构的存在表明该过程已成功，即使缺乏深色中心亦如此。无法生成HPCs可能是由于OP9/DLL1细胞质量不佳、FBS批次质量差、接种于OP9/DLL1上的iPSC细胞团汇合度不适宜（350–600个细胞团为最佳）和/或不同iPSC细胞系在生成造血前体细胞方面的潜能存在差异所致。
   1. 吸除废液，加入5 mL含钙镁的1×无酚红汉克斯平衡盐溶液（HBSS）洗涤1次。 
   2. 吸弃 HBSS，加入含 250 μL 5000 单位/毫升胶原酶 IV 的 10 毫升 HBSS。在 37 °C 下孵育 45 分钟。吸弃含胶原酶 IV 的 HBSS，用 5 毫升 PBS 洗涤一次。
   3. 吸去 PBS，加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。在 37 °C 下孵育 20 分钟。然后加入 4 mL OP9 培养基，通过移液吹打使细胞层解离，制成单细胞悬液。
   4. 将细胞悬液通过100 μm细胞滤筛转移至50 mL锥形管中。  300 x g 离心 g 4 °C下离心5分钟。吸除上清液，加入10 mL OP9培养基重悬细胞。 
   5. 将细胞悬液接种至新的明胶包被的10 cm细胞培养培养皿中（参见步骤3.1.1和3.1.2）。在37 °C孵育45分钟。随后，通过轻柔吹打收集非贴壁细胞。
   6. 将收集的细胞悬液通过100 μm细胞筛过滤，转移至50 mL锥形管中。  300 x g 离心 g 4 °C下离心5分钟。吸除上清液，加入10 mL分化培养基[OP9培养基，含5 ng/mL人干细胞因子（hSCF）、5 ng/mL人Flt3配体（hFLT3L）和5 ng/mL人白细胞介素7（hIL-7）]重悬细胞。
   7. 将细胞悬液接种至新的10 cm OP9/DLL1完全融合的培养皿中。 
8. 第16天，传代细胞。 
   1. 通过轻柔吹打机械性分离非贴壁细胞，并经100 μm细胞滤网过滤。300 × g离心 x g 4 °C 下离心 5 分钟。吸去上清液，加入 10 mL 分化培养基重悬。
   2. 将细胞悬液接种至新的10 cm OP9/DLL1完全融合的培养皿中。 
9. 此后每隔5-7天重复步骤3.8，对非贴壁细胞进行传代。
10. 第35天，富集CD4⁺CD8⁺ 双阳性（DP）细胞群并诱导产生CD8αβ⁺ SP T细胞（图2）。
    1. 通过轻柔吹打机械分离非贴壁细胞，并经100 μm细胞滤网过滤以去除细胞团块，富集CD4⁺ 根据制造商说明书，通过CD4磁珠分离法分离细胞群。
       注意：使用 CD4 磁珠的原理是去除 CD4^-CD8^- 培养物中的DN细胞，因为已证明其可直接杀伤CD4⁺CD8⁺ 刺激后的DP细胞²².
    2. 使用Neubauer血细胞计数板和台盼蓝染色计数活的CD4富集细胞。  在 OP9 培养基中重悬，总体浓度为 0.5 x 10⁶ 细胞/mL。取1 mL细胞悬液（0.5 × 10⁶ 将细胞接种至含融合OP9/DLL1细胞的组织培养平底24孔板的每个孔中。
    3. 加入100 IU人白细胞介素2（hIL-2）、5 ng/mL hIL-7、500 ng/mL抗人CD3抗体和2 μg/mL抗人CD28抗体，于37 °C培养。
    4. 第4天 - 刺激后7天，收集细胞用于分子分析（图3或与肽段致敏的抗原提呈细胞（APCs）共培养。

4. 测定由 hiPSC 分化而来的 CD8αβ⁺ SP T 细胞的抗原特异性

注意：本实验所使用的抗原呈递细胞（APC）类型取决于hiPSC来源T细胞的MHC限制性。此处使用T2细胞系，该细胞系是T细胞与B淋巴母细胞样细胞系的杂交细胞。T2细胞表达HLA-A*02:01²³，而MART1-iPSC来源的JKF6细胞可识别该分子¹⁸。该T2细胞系可在RPMI 1640 + 20% FBS + 1×青霉素-链霉素培养基中扩增，当细胞密度达到5 × 10⁵ 个细胞/mL时进行传代。

1. 使用血细胞计数板和台盼蓝染色法计数活的 HLA-A*02:01⁺ T-B 杂交淋巴母细胞样 T2 细胞。将抗原呈递细胞（APC）在 24 孔组织培养板中，加入 1 μg/mL MART-1 肽段，于 37 °C 培育 2 小时。 
   注意：最佳肽段浓度因细胞系和抗原特异性不同而有所变化。
2. 收集 APC 并用 10 mL PBS 洗涤两次，以去除多余的肽段。
3. 计数 APC，用含 100 IU IL-2 和 5 ng/mL IL-7 的 OP9 培养基重悬至 2 – 5 x 10⁵ 个细胞/mL。每孔取 100 μL 细胞悬液（2–5 x 10⁴ 个细胞），加入超低吸附 U 型底 96 孔板或预先包被的 ELISpot 板中。
4. 使用细胞分选仪分选诱导 1 周后（经抗人 CD3/CD28 抗体刺激）的 hiPSC 来源 CD8αβ⁺ 单阳性 T 细胞，并用含 100 IU IL-2 和 5 ng/mL IL-7 的 OP9 培养基重悬至 1 x 10⁶ 个细胞/mL。每孔取 100 μL 细胞悬液（1 x 10⁵ 个细胞），加入 APC 孔中，于 37 °C 共培养 16 - 20 小时。
5. 培养 16 - 20 小时后，按照制造商说明书通过 ELISpot 检测分析细胞因子分泌谱（图 4）。

结果

经过13天与OP9/DLL1共培养后，hiPSCs中出现了CD34⁺CD43⁺造血祖细胞（图1）。在非明胶包被的OP9/DLL1上，加入hSCF、hFLT3L和hIL-7继续培养22天后，这些造血祖细胞进一步分化为CD3⁺CD7⁺CD4⁺CD8⁺双阳性（DP）T系细胞，其中大多数细胞表达针对MART-1表位（四聚体）的TCR（图2）。

先前的研究表明，通过激动性肽段或抗体介导的TCR刺激产生的TCR信号，可诱导CD4⁺CD8⁺双阳性（DP）T细胞分化为CD8⁺单阳性（SP）T细胞^24,25。因此，在培养的第35天，将hiPSC来源的CD4⁺CD8⁺双阳性T细胞在hIL-7和hIL-2存在条件下，用抗人CD3和抗人CD28抗体进行刺激。刺激后第4天，CD3⁺CD8αβ⁺单阳性细胞数量显著增加，并仍特异性识别MART-1表位，证实其遗传获得的抗原特异性得以保留（图3）。

为了确定由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的CD8αβ⁺ 单阳性（SP）T细胞的功能特性，分析了其抗原依赖性的活化及干扰素γ（IFN-γ）的分泌情况。在使用抗人CD3和抗人CD28抗体刺激1周后，通过细胞分选仪分离hiPSC来源的CD8αβ⁺ SP T细胞，并将其与表达HLA-A*02:01的T2细胞系共培养16–20小时，T2细胞系存在或不存在特异性MART1肽段。ELISpot实验结果显示，在存在MART-1肽段的情况下，hiPSC衍生的CD8αβ⁺ SP T细胞比CD8αα⁺ SP T细胞分泌更多的IFN-γ。单独的T细胞或抗原呈递细胞（APC）均未检测到IFN-γ表达，表明来源于人T-iPSC的T细胞具有抗原特异性和功能活性（图4）。

图1：由hiPSC诱导生成造血祖细胞。（A）通过OP9/DLL1共培养体系将hiPSC向造血谱系分化的示意图。（B）hiPSC来源的结构在第1天（左上）、第3天（右上）、第7天（左下）和第13天（右下）的形态表现。比例尺 = 100 µm。（C）第13天hiPSC来源的CD34⁺CD43⁺造血祖细胞的流式细胞术分析。数据来自六次独立实验，具有代表性（n = 1 至 2）。请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：hiPSC 分化为 Mart1⁺ CD4⁺CD8αβ⁺ 双阳性 T 细胞。（A）通过 OP9/DLL1 共培养体系将 hiPSC 来源的造血谱系分化为未成熟 T 细胞的示意图。（B）第 35 天时 hiPSC 来源 T 细胞的流式细胞术分析结果，显示 CD4 与 CD8α、CD3 与 CD8β 以及 MART-1 四聚体的表达情况。数据门控于淋巴细胞、单细胞及碘化丙啶（PI）阴性细胞。数据代表三次独立实验（n = 3 - 8）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：CD8αβ⁺ 单阳性T细胞表型的诱导。在人源抗CD3和抗CD28抗体刺激后第4天，对CD4^- hiPSC来源的T细胞进行流式细胞术分析。设门策略：淋巴细胞、单细胞、PI阴性（n = 4）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：hiPSC 分化来源的 CD8αβ⁺ SP T 细胞的抗原特异性。 hiPSC 分化来源的 CD8αβ⁺ SP、CD8αα⁺ SP 及总T细胞在与经或未经 MART-1 肽段致敏的 T2 细胞共培养 20 小时后，通过 ELISpot 检测其 IFN-γ 的分泌情况。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

OP9 小鼠基质细胞共培养体系是一种成熟的体外诱导造血干细胞（HSPC）和多能干细胞分化为淋巴细胞（如 NK 细胞、B 细胞和 T 细胞）的系统。T 系分化需要 Notch 信号通路的激活，可通过异位表达 Notch 配体 DLL1 或 DLL4 实现，这两种配体在诱导 T 细胞生成方面具有相当的效率¹。因此，OP9/DLL1 共培养体系已成为体外生成 T 细胞的常用方法。  此外，该方法适用于多种来源的人类细胞，包括脐带血、骨髓 HSPC 以及胚胎干细胞（ESC）。  然而，从这些来源生成 T 细胞仍受限于起始细胞获取不足或向 T 细胞分化效率低下¹。此外，这些具有开放型 TCR 库的细胞来源无法产生具有单一 TCR 重排的 T 细胞产物。通过再生医学技术，特别是诱导性多能干细胞（iPSC）技术，有望大量生成抗原特异性的 T 细胞，用于细胞治疗药物的开发¹⁵。 

hiPSCs 在自我更新能力、无限扩增潜力以及分化为体内任何类型体细胞的潜能方面，与多能性胚胎干细胞（ESCs）相似；然而，它们避免了在临床应用中使用胚胎来源产品所涉及的伦理问题。此外，hiPSCs 可以从任何体细胞产生，从而为个性化医学的细胞产品开发提供了可能。在以往的研究中，已利用外周血单个核细胞、CD3⁺ 细胞或分离的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）作为来源，从人类T细胞成功生成 hiPSCs^18,19,22,26。当 hiPSCs 来源于T细胞（T-iPSCs）时，会继承原始的TCR基因重排。因此，由患者来源的 T-iPSCs 分化而来的T细胞可能为个性化过继性细胞治疗（ACT）提供模型，以靶向患者特异性的肿瘤抗原。

将人多能干细胞分化为T系细胞分为两个步骤：首先生成造血祖细胞（HPCs）²⁷，然后进一步将其分化为T系细胞²¹。这两个步骤均可通过OP9/DLL1共培养系统完成。重要的是，OP9/DLL1饲养细胞的质量对T细胞分化的成功至关重要。由于OP9/DLL1细胞并非永生化的均质细胞系，因此胎牛血清（FBS）的质量和培养条件对于维持其扩增能力并保持支持hiPSC分化的能力至关重要。因此，建议在传代前对FBS批次进行预评估，并在细胞间出现胞质连接时及时传代，以防止细胞分化和衰老。需要注意的一点是，细胞间的接触在不同相差显微镜设置和放大倍数下可能与背景难以区分。根据我们的经验，大多数OP9/DLL1培养皿在准备传代时看起来约为80%汇合度。

已有研究表明，通过OP9/DLL1共培养由T-iPSCs再分化产生的T系细胞在受到刺激后能够生成CD8⁺单阳性（SP）T细胞^18,19。然而，这些再生的CD8⁺ SP T细胞会获得类固有免疫的CD8αα同源二聚体^22,28，而该分子作为TCR信号传导的共受体效果较差²⁹。 此外，这些再生的CD8⁺ SP T细胞表现出强烈的TCR非依赖性细胞毒性，因而不适合临床应用³⁰。本方案描述了一种最新方法，即通过刺激纯化的CD4⁺CD8⁺双阳性（DP）细胞，以生成表型更接近常规T细胞、且抗原特异性细胞毒性增强的CD8αβ⁺ SP T细胞²²。尽管在长期培养后，DP阶段会发生继发性TCRα等位基因重排，导致抗原特异性丧失，但这一问题可通过在T-iPSCs中进行基因组编辑加以克服³¹。 根据我们的经验，hiPSC来源的DP细胞通常在培养第30至35天开始出现，而这些新生成的DP细胞尚未经历继发性TCRα重排。 因此，第35天的大多数DP细胞仍保留抗原特异性，可用于生成具有抗原特异性的CD8αβ⁺ SP T细胞。 

在第35天进行人源抗CD3和抗CD28刺激之前，必须从培养物中去除CD4^-CD8^- 双阴性（DN）细胞，因为已有研究表明，这些细胞在刺激后会直接杀伤CD4⁺CD8⁺ 双阳性（DP）细胞²²。使用CD4磁珠富集法（步骤3.10）可富集DP细胞以及CD4⁺CD8^- 中间单阳性（ISP）细胞¹，这些细胞已被证明不会产生负面影响²²。或者，也可通过流式细胞术进行荧光激活细胞分选以分离DP细胞。然而，更推荐使用磁珠分离法，因其可避免流式细胞术带来的机械应力。

随后通过使用3D小鼠基质细胞培养，已证明可在无需活化介导的激动剂选择的情况下，由人多能干细胞生成CD8αβ⁺单阳性T细胞³²。然而，生理性阳性选择依赖于T细胞受体（TCR）与自身肽-MHC复合物的相互作用，而这些复合物由胸腺皮质上皮细胞特异性加工并呈递³³。此外，TCR对选择性肽段的亲和力已被证明可决定成熟CD8αβ⁺单阳性T细胞后续的功能能力³⁴。  目前尚无证据表明，基于Notch信号通路的基质细胞共培养系统能够提供生理性阳性选择所必需的特定选择性肽段和MHC复合物。

先前在小鼠模型中已有报道，仅使用OP9/DLL1系统由肿瘤抗原特异性T细胞衍生的hiPSCs所产生的T系细胞无法经历常规成熟过程。然而，通过OP9/DLL1系统产生的iPSC来源的未成熟T细胞，可在三维培养系统中经进一步的生理性胸腺教育成熟为类似初始T细胞的细胞^28,35。因此，本文所述利用OP9/DLL1系统生成iPSC来源未成熟T细胞的方案，对于后续尝试产生真正的人源肿瘤抗原特异性胸腺后T细胞至关重要，这类T细胞具备在体内长期存续的能力，并可有效治疗已形成的血管化肿瘤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 培养皿	Corning, Inc.	353003
抗人 CD3 抗体	BD Biosciences	Cat# 561812, RRID:AB_1089628
抗人 CD34 抗体	BD Biosciences	Cat# 348791, RRID:AB_400381
抗人 CD4 抗体	Biolegend	Cat# 344612, RRID:AB_2028479
抗人 CD43 抗体	BD Biosciences	Cat# 560198, RRID:AB_1645460
抗人 CD7 抗体	BD Biosciences	Cat# 555361, RRID:AB_395764
抗人 CD8a 抗体	BD Biosciences	Cat# 555369, RRID:AB_398595
抗人 CD8b 抗体	BD Biosciences	Cat# 641057, RRID:AB_1645747
抗人 TCRb 抗体	BD Biosciences	Cat# 555548, RRID:AB_395932
人源 CD28 单克隆抗体（15E8），纯化功能级	Miltenyl Biotec	130-093-375
人源 CD3 单克隆抗体（OKT3），纯化功能级	Miltenyl Biotec	130-093-387
人源 CD4 微珠	Miltenyl Biotec	130-045-101
100 µm 细胞筛	Fisher Scientific	22-363-549
胎牛血清（FBS）	Gemini	100-500
Flt-3 配体	R&D Systems	427-FL
2% 明胶溶液	SIGMA-Aldritch	G1393-100ML
GlutaMAX（100X）	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-谷氨酰胺补充剂
无酚红 HBSS（含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺）	Gibco	14025-092
白细胞介素-2	R&D Systems	202-IL
白细胞介素-7	R&D Systems	407-ML
iTAG MHC 四聚体 HLA-A*0201 Mart1 四聚体 -ELAGIGILTV	MBL	Cat#TB-0009-2
Mart1-hiPSC	Vizcardo 等，Cell Stem Cell 2013	RIKEN-IMS
Melan-A, MART 1（26-35）	InnoPep	3146-0100
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140050
αMEM 粉末	Gibco	61100061
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）	Thermo Fisher Scientific	C57BL/6 MEF MITC 处理 4M 每份；A34962
OP9/N-DLL1	RIKEN 生物资源中心	Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220	OP9/DLL1
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140-122
磷酸盐缓冲液 pH 7.4（1x）	Thermo Fisher Scientific	10010-023
灵长类动物 ES 细胞培养基	Reprocell	RCHEMD001	人 ESC 培养基
Rhok 抑制剂（Y-27632 二盐酸盐）	Tocris	1254
RPMI 1640	Gibco	11875093
干细胞因子（SCF）	R&D Systems	455-MC
StemPro	EZPassage	23181-010
T2 肿瘤细胞	ATCC	T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™)
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	Thermo Fisher Scientific	25300-062
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Thermo Fisher Scientific	25200-072
U 型底 96 孔板	Corning, Inc.	3799