免疫标记肾组织的光学透明化与成像

摘要

抗体标记、光学透明化与先进光学显微镜技术的结合，可实现对完整结构或器官的三维分析。本文介绍一种简便的方法，将厚肾组织切片的免疫标记、肉桂酸乙酯光学透明化处理以及共聚焦成像相结合，从而实现对肾脏三维结构的可视化观察与定量分析。

摘要

光学透明化技术通过平衡样品内部的折射率，使组织变得透明，从而实现后续的三维（3-D）成像。该技术因其能够分析跨越宏观距离的微观多细胞结构，在各个研究领域受到广泛关注。由于肾小管、血管系统、神经以及肾小球在多个方向上广泛延伸，而传统二维技术迄今仅能部分捕获这些结构，组织透明化技术因此开辟了肾脏研究的众多新领域。尽管光学透明化方法的种类正在迅速增加，但对于该领域的初学者而言，仍难以针对特定研究问题选择最合适的方法。本文提供了一种简便的方法，结合了对厚切小鼠肾脏组织切片进行抗体标记、使用廉价、无毒且即用型化学试剂肉桂酸乙酯进行光学透明化处理，以及共聚焦成像。本实验方案详细描述了如何对肾脏进行灌注，并采用抗原修复步骤以增强抗体结合能力，且无需特殊设备。本方法应用于肾脏内不同多细胞结构的成像，并探讨了如何解决抗体在组织中渗透不良的问题。我们还讨论了成像内源性荧光团以及获取极大样本时可能遇到的困难及其解决方案。这一简便的实验流程为组织三维结构研究提供了一种易于建立且全面有效的工具。

引言

对研究完整器官或大型多细胞结构日益增长的兴趣，推动了光学透明化技术的发展，这些技术可实现对透明组织进行三维成像。直到最近，估算整个结构的细胞数量、长度或体积的最佳方法仍是体视学或连续切片全切分析，这些方法基于对组织进行系统性取样，随后在二维层面进行分析^1,2,3。然而，这些方法耗时较长，且需要高水平的训练与专业技术⁴。光学透明化技术通过使样本内部的折射率达到均衡，从而使组织变为半透明，实现三维成像，克服了上述问题^5,6,7。

目前已开发出多种光学透明化方法，主要分为两大类：基于有机溶剂的方法和基于水相的方法。基于水相的方法可进一步细分为简单浸渍法^8,9、过度水合方法^10,11以及水凝胶包埋法^1....

方案

注意：本文所述所有实验程序均经美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及德国亚琛当地相关主管部门批准。

1. 小鼠肾脏的逆行腹主动脉灌注与固定

1. 在实验当天或前一天晚上配制溶液，并于冰箱中过夜保存。使用前将溶液恢复至室温（RT）。
2. 新鲜配制3%多聚甲醛（PFA）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。每只小鼠约需50–100 mL PFA溶液。
   1. 配制1 L的3% PFA溶液：在通风橱中称取30 g PFA，加入800 mL蒸馏水，搅拌并加热至50–60 °C。温度不得超过70 °C。
      注意：PFA具有毒性，必须在通风橱内配制。
   2. 缓慢加入数滴2N NaOH。等待数分钟直至PFA溶解，若未完全溶解可再添加几滴。部分小块可能无法溶解。
   3. 停止加热，加入50 mL 20×PBS，冰上冷却至室温。
   4. 用HCl调节pH至7.3–7.4，最后用蒸馏水定容至1 L。
   5. 使用0.22 µm滤膜过滤1×PBS和3% PFA溶液，去除未溶解颗粒。
3. 向1 L 1×PBS中加入1,000单位肝素。将含肝素的1×PBS和3% PFA分别转移至两个50 mL塑料注射器中。
   

结果

肾脏是由43种不同细胞类型组成的复杂器官³¹。这些细胞中的大多数形成诸如肾小球和小管等大型多细胞结构，其功能高度依赖于彼此之间的相互作用。传统的二维组织学技术只能部分呈现这些大型结构，可能遗漏完整结构内的局灶性变化³¹。因此，利用光学透明化技术进行三维分析有助于理解它们在健康和疾病状态下的功能。

大多数基于溶剂的光学透明化技术至少会部分淬灭内源性荧光报告蛋白信号。在使用 ECi 进行脱水和光学透明化处理时，观察到 YFP 标记的甲状旁腺素的荧光信号被淬灭（图 1）。然而，其他强荧光蛋白可能抵抗信号淬灭，且将 pH 调节至碱性水平（pH 8–11）可能有助于稳定内源性荧光蛋白^14,20,28,

讨论

光学透明化技术因其在多种器官微解剖结构的三维可视化与定量分析中的广泛应用而受到广泛关注。本文将基于溶剂的透明化方法（ECi）与免疫标记相结合，用于肾组织切片中完整肾小管的三维成像。该方法操作简便、成本低廉且耗时较短。然而，针对其他研究问题，可能采用其他透明化方案更为适宜。⁵还需注意的是，基于溶剂的方法会导致组织在不同程度上发生收缩，这主要归因于脱水步骤。^14,18. 大多数基于溶剂的方法（例如., ECi¹⁴也能至少部分淬灭 GFP 或 tdTomato 等报告分子的内源性荧光；因此，FDISCO³²，CLARITY¹²，或 CUBIC¹¹ 可作为替代方案。然而，ECi 的淬灭效果具有可变性，并取决于每种报告小鼠个体构建体的差异^28.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 滤膜	Fisher Scientific	09-761-112
15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	339650
21 G 蝶形针	Braun	Venofix
三通阀	Fisher Scientific	K420163-4503
3D 分析软件	Bitplane AG	IMARIS
3D 分析软件	Cellprofiler		免费开源软件
5-0 丝线缝合线	Fine Science Tools	18020-50
50 mL 塑料注射器	Fisher Scientific	14-817-57
抗 BrdU 单克隆抗体	Roche	11296736001
抗体稀释液	Dako	S0809
CD31-647	BioLegend	102516
柠檬酸盐抗原修复液	Vector Laboratories	H-3300
弯止血钳	Fisher Scientific	13-812-14
Dako 洗涤缓冲液	Agilent	S3006
解剖显微镜	Motic	DSK-500
包埋盒	Carl Roth	E478.1
乙醇	Merck	100983
肉桂酸乙酯	Sigma-Aldrich	112372
柔性封口膜/Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793
山羊抗 AQP2 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-9882
豚鼠抗 NKCC2 抗体	N/A	N/A	DOI: 10.1681/ASN.2012040404
HCl	Carl Roth	P074.1
肝素	Sagent Pharmaceuticals	401-02
止血钳	Agnthos	312-471-140
水平摇床	Labnet	S2035-E
成像培养皿	Ibidi	81218
氯胺酮	MWI Animal Health	501090
微型止血夹	Fine Science Tools	18052-03
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
手术剪	Merit	97-272
多聚甲醛	Thermo Fischer Scientific	O4042-500
兔抗 phosphoThr53-NCC 抗体	PhosphoSolutions	p1311-53
硅胶弹性体	World Precision Instruments Kwik-Sil	KWIK-SIL
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
组织切片器	Zivic Instruments	HSRA001-1
Triton X-100	Acros Organics	AC215682500
Vannas 剪刀	Fine Science Tools	15000-00
振动切片机	Lancer	Series 1000
赛拉嗪	MWI Animal Health	AnaSed Inj SA (Xylazine)