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方法文章

免疫标记肾组织的光学透明化与成像

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DOI：

10.3791/60002

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2019年7月22日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

本文内容

摘要

抗体标记、光学透明化与先进光学显微镜技术的结合，可实现对完整结构或器官的三维分析。本文介绍一种简便的方法，将厚肾组织切片的免疫标记、肉桂酸乙酯光学透明化处理以及共聚焦成像相结合，从而实现对肾脏三维结构的可视化观察与定量分析。

摘要

光学透明化技术通过平衡样品内部的折射率，使组织变得透明，从而实现后续的三维（3-D）成像。该技术因其能够分析跨越宏观距离的微观多细胞结构，在各个研究领域受到广泛关注。由于肾小管、血管系统、神经以及肾小球在多个方向上广泛延伸，而传统二维技术迄今仅能部分捕获这些结构，组织透明化技术因此开辟了肾脏研究的众多新领域。尽管光学透明化方法的种类正在迅速增加，但对于该领域的初学者而言，仍难以针对特定研究问题选择最合适的方法。本文提供了一种简便的方法，结合了对厚切小鼠肾脏组织切片进行抗体标记、使用廉价、无毒且即用型化学试剂肉桂酸乙酯进行光学透明化处理，以及共聚焦成像。本实验方案详细描述了如何对肾脏进行灌注，并采用抗原修复步骤以增强抗体结合能力，且无需特殊设备。本方法应用于肾脏内不同多细胞结构的成像，并探讨了如何解决抗体在组织中渗透不良的问题。我们还讨论了成像内源性荧光团以及获取极大样本时可能遇到的困难及其解决方案。这一简便的实验流程为组织三维结构研究提供了一种易于建立且全面有效的工具。

引言

对研究完整器官或大型多细胞结构日益增长的兴趣，推动了光学透明化技术的发展，这些技术可实现对透明组织进行三维成像。直到最近，估算整个结构的细胞数量、长度或体积的最佳方法仍是体视学或连续切片全切分析，这些方法基于对组织进行系统性取样，随后在二维层面进行分析1,2,3。然而，这些方法耗时较长，且需要高水平的训练与专业技术4。光学透明化技术通过使样本内部的折射率达到均衡，从而使组织变为半透明，实现三维成像，克服了上述问题5,6,7。

目前已开发出多种光学透明化方法，主要分为两大类：基于有机溶剂的方法和基于水相的方法。基于水相的方法可进一步细分为简单浸渍法8,9、过度水合方法10,11以及水凝胶包埋法12,13。基于有机溶剂的方法通过使组织脱水、去除脂质，将折射率调整至约1.55。大多数基于有机溶剂方法的局限性包括：淬灭常用报告蛋白（如GFP）的内源性荧光、溶剂毒性、可能溶解某些成像腔室或物镜中所用胶水，以及在脱水过程中导致组织收缩14,15,16,17,18,19,20,21。然而，基于有机溶剂的方法操作简便、耗时较短，且适用于多种不同类型的组织。

基于水相的方法依赖于将组织浸入折射率为1.38–1.52的水溶液中8,11,12,22,23,24。这些方法的开发旨在保留内源性荧光报告蛋白的发射特性，并防止脱水引起的组织收缩；但大多数基于水相的透明化方法存在一些局限性，包括实验周期较长、组织膨胀以及蛋白质修饰（例如，在ScaleA2等过度水合方案中，尿素导致蛋白质部分变性）7,11,23,25。ScaleS通过将尿素与山梨醇结合，解决了组织膨胀问题——山梨醇引起的脱水作用可抵消尿素导致的组织膨胀，并通过电子显微镜评估证实其有效保持了组织的超微结构10。组织的收缩或膨胀会影响结构的绝对尺寸、物体之间的距离或单位体积内的细胞密度；因此，测量组织透明化过程中发生的尺寸变化有助于解释所获得的结果7,26。

通常情况下，光学透明化方案包含多个步骤，包括预处理、通透化、免疫标记（如需要）、折射率匹配以及利用先进的光学显微镜成像（例如双光子、共聚焦或光片荧光显微镜）。大多数透明化方法最初是为可视化神经组织而开发的，而近年来的研究已证实其在其他器官中的适用性5。该综合性技术此前已被证明可对肾脏结构进行可靠且高效的分析，包括肾小球27,28、免疫细胞浸润28、血管系统28以及肾小管节段29，是深入理解生理与病理状态下肾小球功能及肾小管重塑的理想方法。

本文总结了一种基于溶剂的方法，该方法结合了肾小管免疫染色、使用廉价、无毒且即用型化学试剂肉桂酸乙酯（ECi）进行光学透明化处理，以及共聚焦显微镜成像，从而实现对完整肾小管的可视化观察与定量分析。该方法操作简便，将肾组织切片的抗原修复与商品化抗体染色相结合，且无需特殊设备，因此大多数实验室均可开展。

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方案

注意：本文所述所有实验程序均经美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及德国亚琛当地相关主管部门批准。

1. 小鼠肾脏的逆行腹主动脉灌注与固定

  1. 在实验当天或前一天晚上配制溶液，并于冰箱中过夜保存。使用前将溶液恢复至室温（RT）。
  2. 新鲜配制3%多聚甲醛（PFA）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。每只小鼠约需50–100 mL PFA溶液。
    1. 配制1 L的3% PFA溶液：在通风橱中称取30 g PFA，加入800 mL蒸馏水，搅拌并加热至50–60 °C。温度不得超过70 °C。
      注意：PFA具有毒性，必须在通风橱内配制。
    2. 缓慢加入数滴2N NaOH。等待数分钟直至PFA溶解，若未完全溶解可再添加几滴。部分小块可能无法溶解。
    3. 停止加热，加入50 mL 20×PBS，冰上冷却至室温。
    4. 用HCl调节pH至7.3–7.4，最后用蒸馏水定容至1 L。
    5. 使用0.22 µm滤膜过滤1×PBS和3% PFA溶液，去除未溶解颗粒。
  3. 向1 L 1×PBS中加入1,000单位肝素。将含肝素的1×PBS和3% PFA分别转移至两个50 mL塑料注射器中。
    注意：如条件允许，可使用压力控制泵（设定为80–100 mmHg）或静水压（滴注法，灌注液高度位于动物上方160–200 cm）进行肾脏灌注。
  4. 将PBS、PFA和一支钝化处理的21 G蝶形针通过三通阀连接。确保整个系统中无气泡存在。
  5. 标记一个15 mL锥形管，并向其中加入10 mL PFA溶液。
  6. 使用120 mg/kg体重的氯胺酮和16 mg/kg体重的赛拉嗪对一只12–24周龄的雄性或雌性C57BL/6小鼠进行深度麻醉。在开始手术前，必须通过夹捏反射（如脚趾夹捏反射）确认动物完全无反应。
  7. 当动物达到外科麻醉水平后，将其仰卧置于解剖显微镜下。使用手术剪沿腹中线切开腹部，暴露腹主动脉。
  8. 用弯头止血钳夹闭髂动脉分叉上方的腹主动脉，再用微型动脉夹夹闭肾动脉下方的腹主动脉。用Vannas剪刀在两个夹子之间的腹主动脉上剪开一个小口（约1 mm），缓慢插入蝶形针，注意避免撕裂腹主动脉。
  9. 若仅需对一侧肾脏进行灌注和固定，可用5-0丝线结扎右侧肾动脉，并取出右侧肾脏用于其他分析。
  10. 移除微型动脉夹，用Vannas剪刀横断门静脉，立即以50 mL含肝素的PBS进行灌注，随后切换为50 mL 3% PFA继续灌注。
    注意：通过腹主动脉进行高压灌注有助于打开肾小管，从而促进抗体在组织中的扩散。经心脏灌注可能无法有效打开肾小管。
  11. 小心取出灌注后的肾脏，避免穿刺或挤压组织。
  12. 剥离肾包膜，将肾脏切成厚度为1 mm的冠状切片。建议使用切片模具（材料表）以标准化切片厚度。
    注意：也可考虑使用振动切片机。
  13. 将肾组织切片浸入已标记的15 mL锥形管中的PFA溶液中。
  14. 另取一个已标记的15 mL锥形管，加入10 mL PFA溶液。在处理下一只小鼠前，用PBS冲洗三通阀和蝶形针。
  15. 在室温下避光条件下进行过夜后固定。

2. 组织制备与免疫染色

  1. 固定后，将肾组织切片在室温下用 1× 洗涤缓冲液（材料表）于水平摇床上洗涤两次，每次 1 小时。
  2. 进行抗原修复。将 300 mL 的 1× 抗原修复液（材料表）加入 500 mL 烧杯中，加热至 92–98 °C。将组织切片放入可透过加热缓冲液的包埋盒中，于 92–98 °C 搅拌条件下孵育 1 小时。移去热源，静置冷却至室温。
    注意：某些供应商会针对免疫组织化学应用测试其抗体，并在产品说明书中提供推荐的抗原修复方法。因此，某些表位可能需要更偏碱性的缓冲液（例如 pH 9）。
  3. 将切片转移至含 0.1% Triton X-100 的 10 mL 1× 洗涤缓冲液中，室温下轻摇过夜。次日用 10 mL 新鲜的 1× 洗涤缓冲液洗涤切片两次，每次 1 小时。
  4. 将一抗用 500 µL 正常抗体稀释液（材料表）稀释，起始浓度建议为 1:50–1:100。将肾组织切片在稀释后的一抗溶液中，于 37 °C 轻柔摇动孵育 4 天。
    注意：由于每种抗体具有独特的性质，抗体孵育时的温度和稀释比例需根据具体探针进行优化。对于仅使用二抗的对照组，将肾组织切片在不含一抗的稀释液中孵育。除商用抗体稀释液外，也可使用含 0.1% Triton X-100 和 0.01% 叠氮化钠的 1× PBS 作为稀释液。
  5. 将肾组织切片在 10 mL 1× 洗涤缓冲液中室温下洗涤过夜，8 小时后更换一次洗涤缓冲液。
  6. 将二抗（例如 Alexa Fluor 标记的二抗，稀释比例为 1:100）用 500 µL 正常抗体稀释液稀释。将肾组织切片在稀释后的二抗溶液中于 37 °C 孵育 4 天。从本步骤开始，需避免组织切片暴露于光照下。
  7. 将肾组织切片在 10 mL 1× 洗涤缓冲液中室温下洗涤过夜，8 小时后更换一次洗涤缓冲液。

3. 组织透明化

  1. 将肾组织切片转移至5 mL高纯度100%乙醇（材料表）中，在室温下轻轻振荡孵育2小时（1小时后更换一次新鲜乙醇）。此步骤用于组织脱水。
    注意：为在下一步中获得较高的组织透明度，必须使用高纯度乙醇。甲醇或四氢呋喃可作为具有较强去脂能力的替代脱水试剂。
  2. 将肾组织切片浸入2 mL ECi（材料表）中，在室温下轻轻振荡孵育过夜（2小时后更换一次新鲜ECi）。
    注意：ECi的凝固/熔点为6–8 °C，因此请勿将样品存放在冰箱中。操作应在通风良好的通风橱中进行，并避免与衣物和皮肤直接接触（ECi为无毒、经美国食品药品监督管理局批准的化合物，但具有强烈气味）。请使用常规Eppendorf管或玻璃容器（不可使用聚苯乙烯容器）。
  3. 经ECi浸渍后可实现组织透明化，此时肾组织切片已准备好进行成像。

4. 共聚焦成像与图像分析

注意：对于成像，只要折射率匹配溶液与物镜兼容，也可使用其他显微镜技术。本方案采用倒置共聚焦显微镜。

  1. 向玻璃底培养皿中加入 600–1,000 μL ECi（材料表）。
    注意：避免使用常规细胞培养皿，因为 ECi 是一种有机溶剂，会溶解塑料培养皿。同样，ECi 可能会腐蚀物镜上的塑料部件或密封圈。有关兼容的成像培养皿的概述，请参阅相应报告30，以及自制的 3D 打印腔室28。
  2. 将半透明的肾脏切片转移至培养皿中。在肾脏切片上放置圆形盖玻片，使其对玻璃底施加轻微压力。用石蜡膜（材料表）密封培养皿，防止 ECi 泄漏。
    注意：完整器官或数毫米厚的组织切片可能需要在组织周围设置边界（牙科水泥或硅胶弹性体；见材料表），以形成容纳 ECi 的液池。
  3. 将培养皿放置于显微镜成像平台上。
  4. 采集多个 z 轴层扫图像并进行拼接。初始 z 轴步长设为 5 μm。
    注意：对于非常厚的组织切片或器官成像，建议使用长工作距离（>5 mm）和高数值孔径（>0.9）的物镜。成像完成后，将组织转移回乙醇中，并保存于含 0.02% 叠氮化钠的洗涤缓冲液或 PBS 中。
  5. 使用软件（材料表）进行三维图像重建分析。

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结果

肾脏是由43种不同细胞类型组成的复杂器官31。这些细胞中的大多数形成诸如肾小球和小管等大型多细胞结构，其功能高度依赖于彼此之间的相互作用。传统的二维组织学技术只能部分呈现这些大型结构，可能遗漏完整结构内的局灶性变化31。因此，利用光学透明化技术进行三维分析有助于理解它们在健康和疾病状态下的功能。

大多数基于溶剂的光学透明化技术至少会部分淬灭内源性荧光报告蛋白信号。在使用 ECi 进行脱水和光学透明化处理时，观察到 YFP 标记的甲状旁腺素的荧光信号被淬灭（图 1）。然而，其他强荧光蛋白可能抵抗信号淬灭，且将 pH 调节至碱性水平（pH 8–11）可能有助于稳定内源性荧光蛋白14,20,28,

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讨论

光学透明化技术因其在多种器官微解剖结构的三维可视化与定量分析中的广泛应用而受到广泛关注。本文将基于溶剂的透明化方法（ECi）与免疫标记相结合，用于肾组织切片中完整肾小管的三维成像。该方法操作简便、成本低廉且耗时较短。然而，针对其他研究问题，可能采用其他透明化方案更为适宜。5还需注意的是，基于溶剂的方法会导致组织在不同程度上发生收缩，这主要归因于脱水步骤。14,18. 大多数基于溶剂的方法（例如., ECi14也能至少部分淬灭 GFP 或 tdTomato 等报告分子的内源性荧光；因此，FDISCO32，CLARITY12，或 CUBIC11 可作为替代方案。然而，ECi 的淬灭效果具有可变性，并取决于每种报告小鼠个体构建体的差异28...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

T. S. 获得德国研究基金会（DFG，资助号：332853055）、Else Kröner-Fresenius 基金会（2015_A197）以及亚琛工业大学医学院（RWTH 回归学者计划）的资助。V. G. P. 获得德国肾病学会研究奖学金、亚历山大·冯·洪堡基金会以及澳大利亚国家健康与医学研究理事会的资助。D. H. E. 获得LeDucq基金会的资助。R. K. 获得德国研究基金会（DFG，项目编号：KR-4073/3-1、SCHN1188/5-1、SFB/TRR57、SFB/TRR219）、北莱茵-威斯特法伦州（MIWF-NRW）以及亚琛工业大学跨学科临床研究中心（O3-11）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 滤膜Fisher Scientific09-761-112
15 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific339650
21 G 蝶形针BraunVenofix
三通阀Fisher ScientificK420163-4503
3D 分析软件Bitplane AGIMARIS
3D 分析软件Cellprofiler免费开源软件
5-0 丝线缝合线Fine Science Tools18020-50
50 mL 塑料注射器Fisher Scientific14-817-57
抗 BrdU 单克隆抗体Roche11296736001
抗体稀释液DakoS0809
CD31-647BioLegend102516
柠檬酸盐抗原修复液Vector LaboratoriesH-3300
弯止血钳Fisher Scientific13-812-14
Dako 洗涤缓冲液AgilentS3006
解剖显微镜MoticDSK-500
包埋盒Carl RothE478.1
乙醇Merck100983
肉桂酸乙酯Sigma-Aldrich112372
柔性封口膜/Parafilm MSigma-AldrichP7793
山羊抗 AQP2 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-9882
豚鼠抗 NKCC2 抗体N/AN/ADOI: 10.1681/ASN.2012040404
HClCarl RothP074.1
肝素Sagent Pharmaceuticals401-02
止血钳Agnthos312-471-140
水平摇床LabnetS2035-E
成像培养皿Ibidi81218
氯胺酮MWI Animal Health501090
微型止血夹Fine Science Tools18052-03
NaOHFisher ScientificS318-500
手术剪Merit97-272
多聚甲醛Thermo Fischer ScientificO4042-500
兔抗 phosphoThr53-NCC 抗体PhosphoSolutionsp1311-53
硅胶弹性体World Precision Instruments Kwik-SilKWIK-SIL
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002
组织切片器Zivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Acros OrganicsAC215682500
Vannas 剪刀Fine Science Tools15000-00
振动切片机LancerSeries 1000
赛拉嗪MWI Animal HealthAnaSed Inj SA (Xylazine)

参考文献

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916(2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355(2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039(2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).

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