方法文章

适用于资源有限地区的现场尸体解剖后狂犬病快速免疫层析诊断检测及后续分子应用

DOI：

10.3791/60008

⸱

2020年6月29日

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1Unit Lyssavirus Epidemiology and Neuropathology, National Reference Center for Rabies and WHO Collaborating Center for Reference and Research on Rabies, Institut Pasteur, 2Environment and Sustainability Institute, University of Exeter, Penryn Campus, 3Institut de Recherche en Elevage pour le Développement, 4Laboratoire Central Vétérinaire, 5Direction des Services Vétérinaires, 6Ecole Inter Etats de Sciences et de Médecine Vétérinaires de Dakar, 7Laboratoire Central Vétérinaire de Bingerville, Laboratoire National d'Appui au Développement Agricole Bingerville, 8FAO Reference Centre for Rabies, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, 9Swiss Tropical and Public Health Institute, 10University of Basel, 11Institut National de Recherche Biomédicale

本文内容

摘要

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我们提供了一套完整的现场条件下动物狂犬病死后诊断方案，采用快速免疫层析诊断试验（RIDT），从脑组织活检取样到最终结果判读。我们还描述了该设备在分子分析和病毒基因分型中的进一步应用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

功能完善的狂犬病监测系统对于提供可靠数据并增强疾病控制所需的政治承诺至关重要。迄今为止，疑似狂犬病阳性的动物必须通过经典或分子实验室方法进行死后确诊。然而，大多数地方性流行地区位于中低收入国家，动物狂犬病诊断仅限于中央兽医实验室开展。监测基础设施的匮乏导致偏远地区狂犬病报告严重不足。近年来已开发出多种技术要求较低的诊断方案，为在分散式实验室建立狂犬病诊断提供了可能。本文介绍了一套完整的动物狂犬病现场死后诊断方案，采用快速免疫层析诊断试验（RIDT），涵盖从脑组织活检取样到最终结果判读的全过程。我们还进一步描述了该检测装置在分子分析和病毒基因分型中的附加用途。RIDT可简便地检测脑组织样本中的狂犬病病毒及其他丽沙病毒。该检测原理简单：将脑组织样本施加于试纸条上，金标抗体特异性结合狂犬病抗原；抗原-抗体复合物进一步与检测线上的固定抗体结合，形成清晰可见的紫色条带。病毒在试纸条上被灭活，但可随后提取病毒RNA。这使得试纸条本身可安全、便捷地寄送至具备条件的实验室，用于确认检测和分子分型。在制造商原方案基础上进行改良后，我们发现检测灵敏度提高，达到98%，相较于金标准参考方法——直接免疫荧光抗体试验，具有良好的一致性。该检测具有多项优势：快速、操作简便、成本低廉，且无需显微镜或冷链等实验室基础设施。RIDT为无法开展参考诊断方法的地区提供了一种有效的替代方案。

引言

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犬狂犬病是人类狂犬病的主要病因，全球每年约导致59,000例人类死亡，几乎全部发生在亚洲和非洲的低收入和中等收入国家（LMICs）1。主要的病原体是一种嗜神经性的与犬类相关的经典狂犬病病毒（RABV，弹状病毒科 Rhabdoviridae，丽沙病毒属 Lyssavirus，种名为狂犬病丽沙病毒 Rabies lyssavirus）。然而，其他与狂犬病相关的丽沙病毒，主要在蝙蝠物种中传播，也可引起疾病2,3。在受影响地区，疾病监测和控制常常因政治层面投入不足而受阻，这可能源于可靠数据的缺乏4,5,6。疾病漏报的原因之一是缺乏实验室诊断，部分原因是难以获得配备完善的实验室和经过培训的技术人员，以及样本运输困难。实验室诊断对于确诊狂犬病病例至关重要，同时还能对涉及的病毒株进行遗传学表征，从而深入了解病毒在区域范围内的传播情况4,5,7。

目前，世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）批准的狂犬病死后诊断金标准包括直接荧光抗体试验（DFAT）、直接快速免疫组织化学试验（DRIT）以及分子学方法（例如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR））4,8。然而，由于低收入和中等收入国家（LMICs）普遍存在实验室设施不足、电力供应不稳定、样本运输缺乏冷藏条件以及缺乏质量管理体系等问题，这些方法的规范应用仍受到限制。由于动物狂犬病诊断通常仅在LMICs的中央兽医实验室进行，现有的监测数据主要反映的是城市地区的狂犬病流行状况。

近年来开发的低技术诊断替代方法为在偏远地区和分散的狂犬病实验室建立狂犬病诊断提供了机会4,8,9。快速免疫层析诊断试验（RIDT）是一种基于免疫层析技术的侧向流动检测方法，利用金标检测抗体，是一种极具前景的狂犬病诊断工具10,11,12,13。其原理十分简单：将脑组织样本稀释后与提供的缓冲液混合，取数滴加样至试纸条上，金标单克隆抗体将特异性结合狂犬病抗原，主要是核蛋白（图1）。抗原-抗体复合物随后发生侧向流动，在检测线（T线）处与固定的抗狂犬病抗原抗体结合，形成一条清晰可见的紫色线条。未与狂犬病抗原结合的剩余金标抗体继续迁移，并通过额外的靶向抗体固定于膜上，形成一条清晰可见的紫色质控线（C线）。

这种一步法、低成本的方法快速、极为简便，且无需昂贵的设备或特殊的储存条件。通过修改生产商的操作规程以省去稀释步骤后，进行检测所需的几乎所有设备和试剂均已包含在试剂盒中14。结果可在5至10分钟内读取，无需使用显微镜。这相较于DFAT检测具有显著优势，后者需要荧光显微镜和免疫荧光结合物，以及冷藏运输和样本储存条件。即使是可在光学显微镜下进行的DRIT检测，也需要持续的冷链来保存抗狂犬病抗体，而这些抗体目前尚未商业化供应。与DRIT相比，RIDT无需使用有毒化学物质，这一特点在废物处理监管不严的国家尤为有利。相较于金标准检测方法DFAT和DRIT，该快速检测耗时更短，结果判读更为简便，因而可由技术经验有限的人员在现场实施检测。

根据这些检测特性，可在偏远地区对疑似动物进行快速诊断，从而尽早为暴露者实施暴露后预防（PEP）。此外，无需远距离运送狂犬病样本，有助于在检测时保持更好的样本质量。然而，目前RIDT检测获得的结果应使用参考诊断方法（如DFAT或DRIT）进行确认。

已对用于检测狂犬病病毒（RABV）及其他丽沙病毒的RIDT技术进行了评估。其中最早的一项研究由韩国研究人员于2007年开展10。在51份动物样本和4份RABV分离株中，与DFAT方法相比，RIDT的敏感性和特异性分别为91.7%和100%。这些结果随后在来自韩国的110份动物脑组织样本中得到验证，与DFAT相比，其敏感性和特异性分别为95%和98.9%15。最近，其他研究进一步评估了该RIDT在不同地理来源的多种动物病毒分离株和/或感染性脑组织样本中的表现。一个包含非洲RABV及其他非洲丽沙病毒（杜文黑格病毒（DUVV）、拉各斯蝙蝠病毒（LBV）和莫科拉病毒（MOKV））在内的21份样本组被成功检测，与DFAT相比，敏感性达到100%16。在来自埃塞俄比亚的115份脑组织样本组中，也获得了相似的高敏感性（96.5%）和特异性（100%）17。另一项研究评估了欧洲RABV分离株、另外两种欧洲蝙蝠丽沙病毒（欧洲蝙蝠丽沙病毒1型（EBLV-1）和2型（EBLV-2））以及澳大利亚蝙蝠丽沙病毒（ABLV）18。基于对172份动物脑组织样本的分析，该RIDT试剂盒与DFAT相比，敏感性为88.3%，特异性为100%，且成功检出了三种与狂犬病相关的丽沙病毒。在该研究中，部分假阴性结果来源于保存在甘油缓冲液中的脑组织样本，提示甘油去除不当可能影响了毛细流动或抗体结合。最近对43份来自澳大利亚蝙蝠的临床样本的分析进一步证实了此前的检测结果，与DFAT完全一致19。在印度开展的两项研究使用RIDT检测了少量临床样本（分别为11份和34份），与DFAT相比，其敏感性介于85.7%至91.7%之间，特异性为100%20，21。另一项评估研究使用来自非洲、欧洲和中东地区的80份动物脑组织样本，发现该试剂盒在特异性方面与DFAT完全一致（100%），而敏感性（96.9%）高于以往研究22。最近一项在22个不同实验室间开展的RIDT比对研究，采用一组10份样本进行测试，总体一致性达到99.5%23。

最近仅有一项多中心研究显示，RIDT的整体性能不理想24。该研究检测了来自三个不同数据集的样本，与DFAT相比，其敏感性和特异性结果存在差异。例如，在实验室A检测的实验感染动物样本中，第一组（n=51）和第二组（n=31）的敏感性分别为16%和43%，而两组的特异性均为100%。相反，在实验室B分析的第三组野外临床样本（n=30）与DFAT结果完全一致，该结果在实验室A也得到了近乎完全的验证（敏感性为85%，特异性为100%）。研究认为，批间差异可能是导致RIDT敏感性相对波动且偏低的可能原因24。

与此同时，另一项研究对上述RIDT进行了类似的验证，但对生产商推荐的方案进行了修改14。在制备脑组织样本时，省略了PBS中1:10的预稀释步骤。根据这一简化的修改方案，作者在实验室条件下检测了73份动物脑组织样本（这些样本自然或实验性地感染了多种RABV毒株），获得的敏感性和特异性分别为95.3%和93.3%。该研究首次在实地环境（非洲乍得）中对该RIDT进行了评估。在48份临床脑组织样本中，其敏感性和特异性分别为94.4%和100%。DFAT与RIDT之间的差异源于DFAT出现的假阳性结果，经RT-PCR确认后得以识别。当剔除这些结果后，两者完全一致，表明在该实地条件下，RIDT比DFAT更可靠14。采用修改后的方案未观察到批间差异。当将该修改方案应用于Eggerbauer等人研究中部分DFAT与RIDT结果不一致的样本（n=8）时24，所有样本结果均达成一致（敏感性达100%）。

RIDT 的另一个主要优势在于，可对试纸条上固定的病毒RNA进行二次利用，通过分子技术（如RT-PCR）检测并进一步进行基因分型14,24。Léchenne 等人14在51份样本（包括18份在常温下检测并从乍得运送的样本）的研究中，经过提取步骤后，利用RT-PCR在Anigen检测装置的膜上检测到固定的病毒RNA，灵敏度达86.3%。在所检测的14份样本中，93%可成功进行后续基因分型。研究采用Sanger测序法对长度至少为500个核苷酸的PCR扩增产物进行测序。在一项完全一致的国际室间比对测试中，该检测不仅检出RABV分离株，还检测出另外四种丽沙病毒属物种：DUVV、EBLV-1、EBLV-2和博克洛蝙蝠丽沙病毒（BBLV）14。Eggerbauer 等人的研究基于实验室样本分析，其病毒RNA检测的灵敏度更高，达到100%24。该研究还证实，RIDT试剂盒中使用的缓冲液具有灭活病毒的作用。因此，这些检测装置可在常温下安全运输至参考实验室，无需采取特殊生物安全防护措施，即可进行分子学确认和基因分型。

根据先前的评估，RIDT 工具在实地应用中具有多种优势，尤其是在无法获得参考诊断技术的情况下。然而，该检测也存在一些局限性，特别是抗原检测的灵敏度较低14,24。该检测适用于含有大量病毒抗原的样本，例如脑组织样本；但不适用于唾液或其他体液等其他类型的样本。另一个缺点是设备成本（在欧洲约为 5–10 欧元），尽管相较于进行 DFAT、RT-PCR 或 DRIT 的费用已较低，但对于中低收入国家（LMICs）而言仍属较高。然而，未来其他公司开发和验证类似的 RIDT 可能会促使价格下降。有研究报道了不同批次之间的差异。尽管其他研究未见类似报道，但在测试新批次时仍应执行严格的质量控制，如同在质量管理体系中使用任何试剂一样。使用不同批次时，改良后的操作流程并未发生改变14。除一项研究外，其余所有研究均表明，与 DFAT 相比，RDIT 的灵敏度较高（约为 90%–95%）。由于狂犬病一旦发病 invariably 致命，因此仍强烈建议使用参考诊断方法（如 DFAT、DRIT 或 RT-PCR）对 RIDT 检测出的任何阴性结果进行确认14。

本文提供了一套完整的动物狂犬病现场死后诊断实验方案，以一种已商业化的快速免疫层析诊断试纸（RIDT）为例，涵盖从脑组织样本采集、对生产商推荐方案（此前已验证14）进行优化后的操作流程，到后续分子检测分析的全过程。该方案已在西非和中非的实地条件下多次应用并验证，在这些地区，RIDT被常规用于与直接荧光抗体检测（DFAT）并行的狂犬病诊断。此外，我们还展示了该设备在实验室环境中的第二种应用方式，即利用该设备固定病毒RNA，并进行提取和RT-PCR检测。

方案

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1. 经枕骨大孔（枕骨入路）采集样本25

注意：该技术可在实验室条件或野外现场实施。样本应在疑似动物死亡后尽快处理，或保存在低温环境（如可能，冷藏或冷冻）中，以避免腐败，因为腐败可能影响检测结果。与其他基于狂犬病病毒抗原检测的参考技术（如 DFAT 和 DRIT）类似，不应检测已腐败的样本，因其可能影响结果（存在假阴性结果的风险）。

警告：所有样本均应被视为具有潜在传染性。即使在野外环境下，也必须严格遵守安全规定和操作程序4。特别是应穿戴适当的个人防护装备，包括口罩、护目镜、手套和实验服。使用适当的消毒剂对材料和样本进行去污处理（例如，按照制造商推荐稀释比例的次氯酸钠溶液、70%酒精（乙醇或异丙醇）、1%肥皂水溶液）。所有接触样本的人员均应接种狂犬病疫苗。

  1. 使用刀具在第一颈椎（寰椎）前方切除动物头部，以暴露枕骨大孔。
    注意：为尽量减少感染性气溶胶的产生，避免使用手动锯或其他类似工具。
  2. 使用一次性塑料移液管（图2A）、吸管（图2B）、钳子（图2C）或滴管（随快速免疫检测工具包RIDT提供）（图2D）采集脑干（延髓）样本。
    注意：采样过程需格外谨慎，因为这是确保检测结果可靠性的最关键步骤。除配套视频中以简明方式展示如何采集目标脑干区域外，强烈建议进行培训操作，以确保准确获取正确的解剖部位。
  3. 可选步骤：除脑干（延髓）外，还可通过相同的枕骨入路，将塑料移液管或吸管轻柔推进并旋转至眼眶方向，采集脑干其他区域或脑组织其他部分（小脑、海马、丘脑和大脑皮层）（图3）。
  4. 若使用吸管或移液管，应轻轻挤压以将脑组织样本（0.5–2 g）转移至试管中，用于后续分析和/或生物样本保存。
    注意：不建议将样本保存于甘油中，因其可能影响快速免疫检测（RIDT）中的毛细管流动或抗体结合步骤18。

2. 改良RIDT方案的实施14

注意：此修改省略了制造商方案（所有版本）中规定的在 PBS 中进行 1:10 稀释的步骤，可在实验室或现场条件下实施。

  1. 使用拭子或滴管采集相当于半颗花生或豌豆大小（0.1–0.5 g）的脑组织样本，并将其放入缓冲液样本管中。
    注意：在改良后的操作流程中，所有试剂和耗材均包含在试剂盒内（无需 PBS 或额外的试管）（图4）。请记录试剂盒的批号，并核对有效期是否有效。
  2. 在管内直接用拭子或滴管小心研磨脑组织约 30 秒，直至形成均匀的悬液。
    注意：根据制造商的操作说明，缓冲液反应可在该条件下灭活病毒的感染性24。
  3. 使用滴管将四滴（约 100 µL）悬液加入检测装置的加样孔中。
  4. 加样后等待样本完全迁移（1–5 分钟），再读取检测结果。样本加入后应迅速开始迁移（1–5 分钟内）。
  5. 若出现延迟（由于悬液黏度过高）或需加速迁移起始，可用滴管轻轻刮擦装置加样位点底部 1–5 次，必要时再添加 1–2 滴悬液。迁移应随即立即开始。
  6. 在样本迁移结束后 5–10 分钟内读取检测窗口的结果，最迟不得超过 20 分钟。
  7. 根据检测窗口中质控线（C线）和检测线（T线）（紫色线条）的有无来判读结果，参见 图5。当两条线均可见时判为阳性（图5A）；仅 C 线可见时为阴性（图5B）；仅 T 线可见或无任何线条可见时为无效结果（图5C）。
    注意：无效结果应至少重复一次检测。若结果仍无效，则需采用其他技术进行检测。RIDT 获得的阴性结果需通过金标准参考方法（如 DFAT、DRIT 或分子检测方法，包括聚合酶链式反应 PCR）进行后续确认。尽管本检测方法的灵敏度较高（见代表性结果），但并非达到 100%。
  8. 使用过的检测装置可于室温保存，或在条件允许时冷藏或冷冻，以备后续分子分析（见第 4 节）。剩余的样本悬液应连同缓冲液管一起在 -20 °C 或 -80 °C 冷冻保存，以便必要时重复检测或进行后续分子分析。

3. 从RIDT装置中提取RNA并通过RT-qPCR进行检测

注意：此步骤只能在具备适应性环境和适合分子诊断设备的实验室条件下进行。可在快速免疫层析检测（RIDT）完成后立即进行，或对存放在室温（15–30 °C）、冷藏或冷冻条件下的存档RIDT装置进行回顾性检测。

  1. RNA 提取
    注意：为了监测提取步骤，建议使用内参对照，该内参可以是内源性 mRNA（例如 ß-actin），也可以是外源性对照（例如在提取的最初步骤中直接加入样本的 eGFP 合成 RNA）26,27。
    1. 小心打开装置，取出滤纸。
    2. 剪下样本的沉积区域，并将其放入含有 1 mL Tri-Reagent LS 的离心管中。在室温下孵育 1 小时，期间轻柔地定期手动振荡。
    3. 按照制造商推荐的方法进行提取，如先前所述27。在此步骤中可加入外源性内参对照。
    4. 根据制造商建议，在过程中加入 2 µL 甘油原，以促进 RNA 沉淀。
    5. 用无核酸酶水重悬 RNA，最终体积通常为 50 µL。
      注意：在加入 200 µL 氯仿至 Tri-Reagent LS 后，进行离心分离水相和有机相的步骤结束时，装置中的膜片将位于管底，不会干扰上层水相的收集。此外，也可使用其他简便快速的提取方案，例如基于苯酚试剂和硅胶膜的方法28。
  2. 通过 RT-qPCR 检测26
    注意：可采用多种分子生物学技术检测提取样本中可能存在的病毒 RNA，例如逆转录 PCR、常规（终点）PCR 或实时定量 PCR（qPCR）。已有多种可用方法，如常规 RT-PCR27,29 或靶向病毒核蛋白或聚合酶基因的 RT-qPCR26,30。下文将介绍一种基于双重联合泛丽沙病毒 RT-qPCR 的示例方法，该方法靶向病毒聚合酶基因中的保守区域。该 RT-qPCR 技术结合了两种不同的 RT-qPCR：一种基于 TaqMan 探针技术（pan-RABV RT-qPCR），另一种使用 SyBR Green 检测（pan-lyssa RT-qPCR）。此外，通过特异性的 TaqMan 探针 RT-qPCR（eGFP RT-qPCR）检测在提取过程中直接添加的外源性内参对照（eGFP RNA）。对所选用于病毒 RNA 检测的分子技术进行现场严格验证非常重要，特别是需确认引物和实时 RT-PCR 的探针是否适用于目标区域流行毒株的检测4。
    1. 将 RNA 样本用无核酸酶水稀释至 1:10。每个 RNA 样本设两个复孔，在 96 孔反应板或其他格式中进行检测。每次实验均需设置阳性和阴性对照，且至少设两个重复。
    2. 根据 表 1 配制三种不同 RT-qPCR 检测的预混液，并使用 表 2 中列出的引物/探针。
    3. 向三种不同的检测体系中分别加入 5 µL 稀释后的 RNA 样本和 15 µL 预混液。pan-RABV RT-qPCR 检测和 eGFP RT-qPCR 检测可在同一块板上运行。
    4. 按照 表 3 所示的热循环条件运行各项检测。若仅有一台 PCR 仪，应先运行 pan-RABV RT-qPCR，并将 pan-lyssa RT-qPCR 的反应板置于 4 °C 保存，直至 pan-RABV RT-qPCR 结束。
    5. 根据 表 4 分析三种检测的结果。

4. 从RIDT装置中提取RNA后的基因分型

  1. 反转录 RT27,29
    1. 配制总反应体系为 10 µL 的主混合液，包含 6 µL RNA、2 µL pd(N)6 随机引物（200 µg/µL）和 2 µL 无核酸酶水。
    2. 在加热块中于 65 °C 孵育 10 分钟，随后置于冰上保存。
    3. 配制另一主混合液，每份样品终体积为 20 µL，包含 6 µL 5x 第一链缓冲液、2 µL 0.1 M 二硫苏糖醇（DTT）、1 µL（200 U）Superscript II 逆转录酶、2 µL（80 U）RNasin、2 µL dNTP 混合液（10 µM），并用无核酸酶水补足体积。
    4. 将主混合液（20 µL）加入样品（10 µL）中，终体积为 30 µL，在加热块中于 42 °C 孵育 90 分钟。
    5. 随后进行 PCR 扩增，或将 cDNA 储存于 -20 °C。
  2. 常规 PCR27,29,31
    注意：目前有多种常规 PCR 技术可用于基因分型。本文介绍两种方法，均为针对丽沙病毒核蛋白或病毒蛋白部分区域的半巢式 PCR。除引物和扩增条件外，两种检测的实验流程相同。每次 PCR 实验均应包含阳性对照（阳性 RNA）和阴性对照（阴性 cDNA 和/或无核酸酶水），且每轮扩增均需设置对照。
    1. 为每个样品在 0.2 mL 微量离心管中配制第一轮 PCR 反应的主混合液。该混合液包含 5 µL 10x NH4 反应缓冲液、2.5 µL MgCl2 溶液（50 mM）、1 µL dNTP 混合液（10 µM）、每种引物各 1 µL（10 µM）、0.2 µL（1 U）Biotaq DNA 聚合酶以及 37.3 µL 无核酸酶水，终体积为 48 µL。引物序列见表 5。
    2. 向每管中加入 2 µL cDNA，并根据表 6所示条件，在各自独立的常规 PCR 热循环仪中进行扩增。
    3. 使用相应的引物（见表 5），配制与前一步相同的第二轮主混合液，用于半巢式 PCR 反应。
    4. 加入 2 µL 第一轮 PCR 产物，并使用表 6中指定的循环参数，在常规 PCR 热循环仪中进行扩增。
    5. 将第一轮和第二轮 PCR 产物分别上样至含溴化乙锭（终浓度约 0.01%）的 1% 琼脂糖凝胶（100 mL 1x TAE 缓冲液），在 120 V 电压下电泳 30 分钟，观察结果。阳性 PCR 结果表现为预期大小的明亮条带（见表 5）。
  3. Sanger 测序
    1. 对使用泛丽沙病毒半巢式 PCR 获得的扩增子进行 Sanger 测序，完成基因分型分析。

结果

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与任何诊断方法一样，样本采集对于结果的可靠性至关重要，尤其是在现场环境中操作时。采集过程应尽可能简单，以确保获得高质量的样本。通过枕骨大孔途径采集脑组织活检样本（包括脑干和延髓），用于动物狂犬病的死后诊断，符合这一要求，如图2A-D25所示。

采集后，脑组织样本将采用改良的RIDT方案进行处理，该流程总结于图6。如“实验方案”部分所述，与试剂盒厂商提供的原始方案相比，主要改进之处在于省略了PBS稀释步骤，从而简化了操作流程以及所需的耗材和试剂，所有必需组分均已包含在试剂盒中（图4）。

该改良方案已在五家不同的实验室中实施并评估，其中包括一家世界卫生组织狂犬病合作中心（实验室1，法国）、一家联合国粮农组织狂犬病参考中心（实验室5，意大利），以及三家位于非洲地方性流行国家的参考实验室：乍得（实验室2）、科特迪瓦（实验室3）和马里（实验室4）。在乍得，该快速免疫诊断试验（RIDT）已在实验室和现场环境中均进行了评估。

与参考技术DFAT相比，所有实验室的RDIT检测灵敏度和特异性均较高，分别为96%至100%和93.7%至100%（表7）。在实验室验证阶段，实验室1（法国）获得的RDIT灵敏度和特异性最低。根据累计检测样本数量（n=162）（补充表1），RDIT相对于DFAT的总体灵敏度和特异性分别为98.2%和95.8%（表7）。然而，这些初步但具有前景的结果基于有限的样本数据集，需在更多阳性和阴性样本上进一步验证，特别是对来自地方性流行区域的样本，以避免因现有数据集异质性可能导致的低估或偏差。

RIDT 检测适用于检测感染动物脑组织活检样本中的丽沙病毒，前提是样本中丽沙病毒抗原含量较高。然而，在检测梯度稀释的病毒悬液时，该检测方法的最低检出限仍然较高（表8；图7）。

表9（引自Léchenne 201614）展示了通过靶向丽沙病毒（lyssavirus）病毒聚合酶的双重联合泛丽沙病毒RT-qPCR检测RNA后获得的结果示例。共检测了一组51份RIDT阳性样本，这些样本在实验室条件（实验室1，n=32）或在乍得（实验室2，n=19）完成检测后，于常温下运送至实验室1。实验室1、实验室2以及两者合并样本的阳性检出数分别为18份（94.7%）、26份（81.2%）和44份（86.3%）。此外，对其中14份样本（实验室1的10份和实验室2的4份）采用靶向部分核蛋白基因的半巢式PCR进行了基因分型，其中13份（93%）成功分型（引自Léchenne等，201614）。

侧向层析检测示意图；抗原检测；硝酸纤维素膜；抗体相互作用。
图1：用于狂犬病诊断的快速免疫诊断试纸条（RIDT）结构示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

牛蹄解剖学研究、解剖步骤、序列图像 A-D、教育教学研究。
图2：在野外条件下（马里）通过枕骨大孔快速采集动物（此处示例为犬）脑组织样本（延髓及脑干）的简易技术示例。（A）使用一次性塑料移液管采集；（B）使用塑料吸管采集；（C）使用钳子采集；（D）使用RIDT试剂盒中提供的废弃滴管采集。请点击此处查看该图的放大版本。

大脑解剖示意图，标注了大脑皮层、小脑、海马体和脑干。
图3：犬头部的纵向解剖切面，显示通过旋转推进一次性塑料移液管经枕骨大孔通路时采集到的不同脑区（脑干、小脑、海马体、丘脑和大脑皮层）。 请点击此处查看此图的放大版本。

带有拭子、样本、检测试剂稀释液的快速检测试剂盒；现场设置中的诊断设备。
图4：RIDT试剂盒内容物说明，包括检测装置、一次性塑料滴管、一次性拭子以及检测试剂稀释液。 用于收集和储存样本的试管未提供。请点击此处查看该图的放大版本。

狂犬病抗原快速检测试纸条，显示诊断用途的阳性、阴性和无效结果。
图5：Anigen 快速免疫层析检测（RIDT）结果判读示意图。（A）阳性结果（可见两条线，即C线和T线）；（B）阴性结果（仅可见C线）；（C）无效结果（C线不可见）。请点击此处查看该图的高清大图。

脑组织检测制备方法；示意图、混合、取样、结果分析。
图6：RIDT检测流程的示意图，根据试剂盒说明书进行调整。（A）修改后的检测流程，删除了试剂盒说明书中推荐的稀释步骤；（B）试剂盒说明书中原始推荐的检测流程，包含脑组织样本在PBS中进行1:10预稀释的步骤。在修改版流程（如图6A所示）中被删除的步骤以红线标出。请点击此处查看该图的放大版本。

FFU中的狂犬病抗原检测结果；诊断试纸显示出不同的条带强度。
图7：RIDT检测下限测定示例14。 使用对9704ARG毒株的狂犬病病毒进行连续10:1稀释。每个检测装置上接种的病毒量以FFU（荧光灶形成单位）表示。请点击此处查看该图的放大版本。

泛狂犬病毒RT-qPCR检测
试剂μL/反应
2X反应混合液（含有0.4 mM每种dNTP和6 mM MgSO₄的缓冲液）10
无核酸酶水1.5
Taq3long（正向）[10 μM]1
Taq17revlong（反向引物）[10 μM]1
RABV4 [10 μM]0.3
RABV5 [10 μM]0.3
MgSO₄4 [50 mM]（试剂盒中提供）0.25
ROX参比染料（25 μM）（试剂盒提供）0.05
RNasin（40U/µL）（Promega）0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq 混合液0.4
每反应总量15
eGFP RT-qPCR 检测
试剂μL/反应
2X反应混合液（含有0.4 mM每种dNTP和6 mM MgSO4的缓冲液）10
无核酸酶水2.8
EGFP1F（正向引物）[10 μM]0.5
EGFP2R（反向）[10 μM]0.5
eGFP 探针 [10 μM]0.3
MgSO₄4 [50 mM]（试剂盒中提供）0.25
ROX参比染料（25 μM）（试剂盒中提供）0.05
RNasin（40U/µL）（Promega）0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq 混合液0.4
每反应总体积15
泛丽沙RT-qPCR检测
试剂μL/反应
2x SYBR Green 反应混合液10
无核酸酶水2.1
Taq5long（正向引物）[10 μM]1
Taq16revlong（反向引物）[10 μM]1
MgSO₄4 [50 mM]（试剂盒中提供）0.25
ROX 参比染料（25 μM）0.05
RNasin（40U/µL）（Promega）0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq 混合液0.4
每反应总量15

表1：三种不同RT-qPCR检测（pan-RABV RT-qPCR、pan-lyssa RT-qPCR和eGFP RT-qPCR）的主反应混合液成分说明。

pan-RABV RT-qPCR 检测名称类型长度序列 (5’-3’)链向位置
pan-RABV RT-qPCR 检测Taq3long引物22ATG AGA AGT GGA AYA AYC ATC AS7273-7294a
Taq17revlong引物25GAT CTG TCT GAA TAA TAG AYC CAR GAS7390-7414a
RABV4探针 (FAM/TAMRA)29AAC ACY TGA TCB AGK ACA GAR AAY ACA TCAS7314-7342a
RABV5探针 (FAM/TAMRA)32AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY GAG TTT TTY CAS7353-7384a
Pan-lyssa RT-qPCR 检测Taq5long引物23TAT GAG AAA TGG AAC AAY CAY CAS7272-7294a
Taq16revlong引物25GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY CAS7366-7390a
eGFP RT-qPCR 检测EGFP1F引物20GAC CAC TAC CAG CAG AAC ACS637-656b
EGFP2R引物19GAA CTC CAG CAG GAC CAT GAS768-750b
EGFP探针 (FAM/TAMRA)22AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC AS703-724b

表2：三种不同RT-qPCR检测方法（泛RABV RT-qPCR、泛丽沙病毒RT-qPCR和eGFP RT-qPCR）所用引物/探针的说明。 a依据巴斯德病毒（PV）RABV基因组序列（GenBank登录号M13215）。b依据克隆载体pEGFP-1序列（GenBank登录号U55761）。

泛RABV RT-qPCR和eGFP RT-qPCR检测
步骤循环数温度时间数据采集
反转录145 °C15 min
反转录酶失活/初始变性195 °C3 min
扩增4095 °C15 s
61 °C1 min终点采集
泛丽沙病毒RT-qPCR检测
步骤循环数温度时间数据采集
反转录145 °C15 min
反转录酶失活/初始变性195 °C3 min
扩增4095 °C15 s
55 °C1 min终点采集
解离曲线195 °C15 s以0.1 °C/s升温，55–95 °C
55 °C1 min
95 °C15 s
55 °C15 s

表3：三种不同RT-qPCR检测（泛RABV RT-qPCR、泛丽沙病毒RT-qPCR和eGFP RT-qPCR）的热循环条件说明。

检测分析结果解释
eGFP RT-qPCRCq 在可接受区间内提取物有效可进行其他检测的分析
Cq 超出可接受区间提取物无效重新检测样本（重复运行和/或重新提取），必要时申请新样本
pan-RABV RT-qPCRCq <38阳性病毒RNA检测阳性
Cq ≥38阴性进行pan-lyssa RT-qPCR检测分析
pan-lyssa RT-qPCR熔解曲线判定为阳性阳性病毒RNA检测阳性
熔解曲线判定为阴性阴性未检测到病毒RNA

表4：双重联合广谱狂犬病病毒属RT-qPCR检测的总体解读。

半巢式常规 PCR 检测PCR 轮次名称长度序列 (5’-3’)链向位置a扩增子大小 (bp)
靶向聚合酶基因的半巢式 PCR第一轮PVO5m20ATG ACA GAC AAY YTG AAC AAS7170-7189320
PVO919TGA CCA TTC CAR CAR GTN GAS7471-7489
第二轮PVO5m20ATGA CAG ACA AYY TGA ACA AS7170-7189250
PVO822GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT AAS7398-7419
靶向核蛋白基因的半巢式 PCR第一轮N12720ATG TAA CAC CTC TAC AAT GGS55-741532
N8m19CAG TCT CYT CNG CCA TCT CAS1568-1586
第二轮N12720ATG TAA CAC CTC TAC AAT GGS55-74845
N82919GCC CTG GTT CGA ACA TTC TAS881-899

表5：常规半巢式PCR所用引物的描述。

靶向聚合酶基因的半巢式 PCR
步骤循环数温度时间
第一轮和第二轮初始变性194 °C3 min
变性3594 °C30 s
退火56 °C45 s
延伸72 °C40 s
最终延伸172 °C3 min
靶向核蛋白基因的半巢式 PCR
步骤循环数温度时间
第一轮初始变性194 °C3 min
变性3594 °C30 s
退火56 °C30 s
延伸72 °C45 s
最终延伸172 °C3 min
第二轮初始变性194 °C3 min
变性3594 °C30 s
退火58 °C30 s
延伸72 °C30 s
最终延伸172 °C3 min

表6：常规半巢式PCR的热循环条件说明。

实验室国家评估时间段样本数量DFAT 检测结果RIDT 检测结果灵敏度特异性
阳性阴性阳性阴性
实验室 1法国2015825032503296%93.7%
实验室 2乍得2012-20154433113311100%100%
实验室 3科特迪瓦2017108282100%100%
实验室 4马里201718153153100%100%
实验室 6意大利201688080100%-
总计2015-2017162114481144898.2%95.8%

表7：基于对总共162个样本的分析以及5个不同实验室的参与，比较参考方法DFAT，确定RIDT检测的固有参数（灵敏度、特异性）。

病毒株a原始宿主地点初始浓度 (FFU/mL)b检测下限 (FFU/mL)c
9147FRA赤狐法国3.1 x 107106
CVS实验室分离株-1.6 x 107106
8743THA人泰国8.1 x 107> 8.1 x 106
9508CZK (SAD)实验室分离株-5.4 x 108107
PV实验室分离株-4.3 x 107106
9001FRA犬法属圭亚那2.4 x 106> 2.4 x 105
9704ARG蝙蝠阿根廷9.5 x 107105
04030PHI人菲律宾2.5 x 107105

表8：使用8种不同滴定的狂犬病病毒悬液进行RIDT检测的检测限（源自Léchenne等，201614）。 aCVS：攻击病毒株，SAD：Street Alabama Dufferin，PV：Pasteur病毒。b每毫升荧光灶形成单位（FFU）的数量。c沉积在试纸条上的荧光灶形成单位（FFU）数量。

执行 RIDT 的实验室
实验室 1实验室 2合并结果
阳性阴性总计阳性阴性总计阳性阴性总计
病毒 RNA 检测阳性181192603244751
阴性000003033
总计1811926035441054

表9：在实验室条件（实验室1）、野外条件以及室温运输后（实验室2）使用Anigen试纸条通过RT-qPCR检测病毒RNA的结果（数据来自Léchenne等，201614）。

补充表1：用于测定表7中内在参数的162个样本的描述，这些样本均使用RIDT检测法进行测试。 请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RIDT 是一种简单、快速且低成本的狂犬病死后诊断方法，有望成为实验室检测的一种现场替代方案。在中低收入国家的分散化地区应用此类检测，将有助于深入了解狂犬病病毒在地方乃至全国范围内的流行与传播情况。当该方法与快速脑组织样本采集技术（无需完整尸检）结合使用时，其显著优势在于整个检测过程均可在远离实验室设施的野外环境中完成。通过枕骨大孔采集的脑组织样本即可用于检测，因此无需完全打开动物颅骨。该检测操作和判读简便，特别适用于野外监测工作14。与 DFAT 或 DRIT 相比，RIDT 的其他优势还包括无需设置阳性和阴性对照，试剂盒可在室温下保存。此外，在改良后的操作流程中省去了磷酸盐缓冲液（PBS）1:10 稀释步骤，无需额外试剂，进一步简化了野外条件下的操作流程。

关键在于脑组织样本的质量。应在疑似动物死亡后尽快采集并检测样本，或在检测前将样本保存在低温环境中，以避免降解。不应对已分解的样本进行检测，因为这可能影响检测结果（存在假阴性结果的风险）。尽管目前尚无关于脑组织样本在不同时间下快速免疫检测法（RIDT）敏感性下降的数据，但我们推测其情况与直接荧光抗体检测法（DFAT）相似32。然而，由于该检测可在现场快速直接完成，动物死亡至实施检测之间的时间可显著缩短，因此总体而言，样本发生分解的风险较低。

该方案中的另一个关键步骤是样品悬液的迁移。迁移应在样品加入后立即开始（1-5 分钟内）。因此，悬液黏度过高可能会对迁移产生不利影响。通常用滴管轻轻刮擦装置加样位置的底部，并再添加 1-2 滴液体即可解决此问题，迁移会在操作后立即开始。

非洲实验室（乍得、科特迪瓦和马里）进行的大多数RIDT检测均在环境温度超过30 °C的条件下完成，而制造商推荐的储存和使用温度范围为15 °C至30 °C。尽管我们尚未发现高温对RIDT检测性能产生明显影响，但仍需对其进行更深入的评估。同样，在检测后用于病毒RNA检测和基因分型的设备在储存和运输过程中经历高温的影响，也需要进一步评估。通过RT-qPCR从RIDT试纸条中检测病毒RNA的灵敏度，可能受到最初用于检测的脑组织样本质量的影响，也可能受到检测后RIDT试纸条储存条件的影响。例如，使用过的RIDT试纸条在受控的实验室条件下储存时，RNA检测的灵敏度更高（94.7%），而在实地条件（如乍得）下储存时则较低（81.2%）14。这些条件还可能影响固定在试纸条上的RNA的完整性（尤其是长度），这或许可以解释基于较长PCR扩增子（例如>500个核苷酸）进行基因分型时灵敏度中等的原因14。在试纸条上进行的RT-qPCR检测灵敏度低于使用FTA Whatman卡片所获得的结果（80.6%）14。与其他分子检测技术类似，病毒载量也可能影响基于RIDT试纸条进行基因分型的成功率，病毒载量较低的样本可能出现阴性结果14。

目前，世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）均未推荐将该检测用于常规诊断和疾病监测，检测结果不能单独用于指导暴露后预防（PEP）的决策。仍需进一步开展检测方法的验证工作。然而，准确快速的狂犬病诊断是高效持续狂犬病监测系统的关键组成部分，有助于提升政府层面的重视程度，这对于成功实现狂犬病的可持续控制至关重要33。在此背景下，RIDT检测为狂犬病诊断提供了新的机遇，是在低收入或中等收入的疫区现场扩大动物狂犬病监测的有用工具。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了全球疫苗与免疫联盟（GAVI）、Wolfermann Nägeli基金会、瑞士非洲研究合作组织（SARECO）、SWF科学研究基金会、巴塞尔志愿学术协会（FAG）、瑞士与亚洲双边科学技术合作计划以及诺华生物医学研究基金会的支持。

我们特别感谢犬只主人、兽医人员以及实验室工作人员的大力支持与投入。同时，我们感谢 Lisa Crump 在语言编辑方面所做的工作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗狂犬病核衣壳结合物（冻干，吸附）Bio-Rad, France3572112与狂犬病毒核衣壳反应的异硫氰酸荧光素（FITC）标记多克隆抗体。用于DFAT参考技术。
Applied Biosystems 7500 实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems, France4351104从RIDT装置中提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA。
一次性塑料移液管、吸管、夹子、滴管--用于经枕骨大孔（枕骨通路）采集脑干（延髓）的设备。
伊文思蓝溶液 1%Bio-Rad, France3574911DFAT中使用的复染剂，便于在紫外显微镜下观察。
引物 eGFPF1Eurofins Genomics, Germany-用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增内参eGFP的正向引物，序列：5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'。
引物 eGFPR2Eurofins Genomics, Germany-用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增内参eGFP的反向引物，序列：5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'。
引物 Taq17 revlongEurofins Genomics, Germany-用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的反向引物，序列：5'-ATGAGAAGTGG
AAYAAYCATCA-3'。
引物 Taq3 longEurofins Genomics, Germany-用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的正向引物，序列：5'-GATCTGTCTGAA
TAATAGAYCCARG-3'。
探针 eGFP FAM/TAMRAEurofins Genomics, Germany-用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增内参的正向探针，序列：5'-AGCACCCAGT
CCGCCCTGAGCA-3'。
探针 RABV4 FAM/TAMRAEurofins Genomics, Germany-用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的探针，序列：5'-AACACYTGATCBA
GKACAGARAAYACATC-3'。
探针 RABV5 FAM/TAMRAEurofins Genomics, Germany-用于在从RIDT装置提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的探针，序列：5'-AGRGTGTTTTCYAG
RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'。
快速狂犬病抗原检测试剂盒BioNote Inc., Republic of KoreaRG18-01DD用于狂犬病死后诊断的快速免疫层析诊断试验（RIDT，也称侧向流动装置或LFD）。
重组RNasin核糖核酸酶抑制剂Promega, USAN2515与试剂盒配合使用，用于在从RIDT装置中提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的酶。
SuperScript III Platinum 一步法qRT-PCR试剂盒Invitrogen, France11732-020用于在从RIDT装置中提取RNA后，通过RT-qPCR扩增病毒RNA的试剂盒。
TRIzol试剂Invitrogen, France15596026基于苯酚/氯仿法，利用RIDT中的纤维素膜进行总RNA提取。

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