通过异源表达对膜转运蛋白进行表征 E. coli 膜泡的制备与生产

摘要

我们描述了一种方法，用于表征通过在大肠杆菌（E. coli）中异源表达并利用法国压破碎细胞所制备的膜囊泡中的质子驱动型膜转运蛋白。

摘要

目前已开发出多种方法用于功能性表征新型膜转运蛋白。多胺在所有生物体中普遍存在，但植物中的多胺交换体尚未被鉴定。本文概述了一种利用从异源表达植物反向转运蛋白的大肠杆菌（Escherichia coli）细胞裂解后制备的膜囊泡来表征多胺反向转运蛋白的方法。首先，我们在缺乏多胺和精氨酸交换转运蛋白的 E. coli 菌株中异源表达了 AtBAT1。通过使用法国压（French press）裂解细胞制备囊泡，经超速离心纯化后，采用膜过滤法检测标记底物，以验证该转运蛋白的底物特异性。实验结果表明，AtBAT1 是一种介导精氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、腐胺和亚精胺跨膜转运的质子偶联转运蛋白。本研究中为 AtBAT1 功能检测所构建的突变菌株，可能也适用于其他植物和动物多胺交换体家族的功能分析。我们还推测，只要目标蛋白能够在细菌细胞膜中表达，该方法便可推广用于表征多种其他类型的反向转运蛋白。E. coli 是表征新型转运蛋白的理想系统，因为已有多种方法可用于对其内源性转运蛋白进行突变操作。

引言

参与代谢物转运的蛋白质构成了生理调控的一个重要层面，但绝大多数植物膜转运蛋白尚未得到功能表征。已有多种策略被用于表征新的转运蛋白。在模式生物中进行异源表达，例如大肠杆菌（E. coli）以及酵母、非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞等真核细胞系统，均已用于测定其转运活性¹。由于真核细胞的基本细胞组成、信号转导通路以及转录和翻译机制更接近天然环境，因此更适合表达真核蛋白。

酵母一直是用于表征植物中新型转运蛋白的重要模式生物。首个在酵母（Saccharomyces pombe）中成功表达的植物转运蛋白是来自小球藻（Chlorella）的己糖转运蛋白HUP1²。此后，许多植物转运蛋白已通过酵母表达系统实现了功能表征，其中包括植物糖转运蛋白（SUC1和SUC2³、VfSUT1和VfSTP1⁴）以及生长素转运蛋白（AUX1和PIN⁵）。利用酵母表达植物蛋白的缺点可能包括：由于酵母缺乏质体，导致定位于质体的蛋白活性受损；蛋白错误靶向⁶；以及由于膜蛋白过量表达而在酵母中形成错误折叠的聚集体并激活应激反应

方案

1. 的生成 E. coli 利用P1转导构建双基因敲除突变体

1. 获取 E. coli 单基因敲除突变株 ΔPotE 和 ΔCadB 从 E. coli 遗传资源中心 (http://cgsc.biology.yale.edu).
   注意： 该 ΔPotE 该菌株具有卡那霉素抗性²⁶ 以及 ΔCadB 该菌株具有四环素抗性²⁷.
2. 构建 PotE/CadB 使用 P1 转导方案构建双基因敲除（DKO）菌株²⁸.
   1. 裂解液制备
      1. 稀释过夜培养的菌液 ΔPotE 在添加了10-25 mM MgCl的LB培养基中（1:100稀释）₂，5 mM CaCl₂，以及0.1-0.2%葡萄糖。
      2. 37 °C 培养 1–2 小时。
      3. 加入40 µL P1噬菌体裂解液至培养物中，继续在37 °C下培养。观察1–3小时....

结果

本方案的主要步骤如图1所示。简而言之，培养缺乏所有多胺交换蛋白并表达AtBAT1的E. coli细胞，经离心、缓冲液洗涤后，使用French press进行细胞裂解。裂解过程通常会产生多数为内翻外（inside-out）的囊泡，并将细胞外缓冲液包裹在内。通过离心去除细胞碎片后，再经第二次超速离心以收集膜沉淀。将膜沉淀重悬于pH 5.2的Tris-Maleate缓冲液中，并在-80 °C下保存。转运实验在12 °C下进行，该温度被确定为维持膜稳定性的最佳条件。实验通过加入放射性标记底物并将囊泡悬浮缓冲液的pH值调至8.0来启动反应。1分钟后，加入冰冻的未标记底物缓冲液以终止放射性标记物进入囊泡的摄取过程。通过硝酸纤维素膜过滤截留带有放射性标记的囊泡。将滤膜转移至闪烁瓶中，利用液体闪烁计数法测定滤膜上的放射性信号。

通过蛋白质印迹实验验证 AtBAT1 是否被转.......

讨论

在本研究中，我们概述了一种通过首先在大肠杆菌（E. coli）中表达蛋白，然后制备膜囊泡，以对一种反向转运蛋白进行表征的方法，从而使异源表达的蛋白可在无细胞系统中进行检测。除大多数分子生物学实验室常见的设备外，该策略还需要使用法国压菌器、超速离心机，以及具备开展放射性同位素检测条件的实验设施。

该技术的一个基本要求是异源蛋白被正确靶向至细胞质膜 E. coli该策略也可能适用于细胞器转运蛋白的功能分析，因为质体ADP-葡萄糖转运蛋白已成功定位于 E. coli 细胞膜及其功能表征³⁵所用载体（pBAD-DEST49）包含一个N端硫氧还蛋白，以提高翻译产物的溶解度。N端融合了一个小的 B. subtilus 蛋白mystic被发现能够更高效地将膜转运蛋白靶向至细胞质膜³⁶然而，蛋白质的错误折叠以及无法正确整合到细胞质膜中等问题，限制了许多类型转运蛋白在细菌表达系统中的应用。¹

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
3H-腐胺	PerkinElmer	NET185001MC
3H-亚精胺	PerkinElmer	NET522001MC
4-氯-1-萘酚	Sigma-Aldrich	C8890
14C 精氨酸	Moravek Inc.	MC137
精氨酸	Sigma-Aldrich	A-5006
抗His（C端）-HRP抗体	ThermoFisher	R931-25	检测C端多聚组氨酸（6xHis）标签，检测需要游离羧基 基团
阿拉伯糖	Sigma-Aldrich	A3256
BCA蛋白检测试剂盒	ThermoFisher	23227	Pierce BCA蛋白检测试剂盒
溴酚蓝	Bio-Rad	161-0404
羧肽酶B	Sigma-Aldrich	C9584-1mg
离心机	Sorvall		SS-34固定角转子和GA-6固定角转子
Dounce组织研磨器	LabGenome	7777-7	Corning 7777-7高硼硅玻璃匀浆器，带倾倒口
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	闪烁液
EDTA	Sigma-Aldrich
过滤装置	Hoefer	FH225V
French高压细胞破碎仪	Glen Mills	FA-080A120
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
谷氨酸	Sigma-Aldrich	G6904
甘油
GraphPad Prism软件			http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
过氧化氢	KROGER
氯化钾	J.T. Baker	3040-01
液体闪烁计数器	Beckman	LS-6500
马来酸盐	Sigma-Aldrich	M0375
Nanodrop	ThermoFisher
硝酸纤维素膜滤器	Merck Millipore	hawp02500	0.45 µm
PCR纯化试剂盒	Genscript		QuickClean II
磷酸氢二钾	ThermoFisher	P290-500
腐胺	fluka	32810
磷酸二氢钾	J.T.Baker	4008
亚精胺	Sigma-aldrich	S2501
菌株：E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10	本手稿	可应要求提供	该菌株缺乏PotE和CadB多胺交换蛋白
Tris碱	Research Products	T60040-1000
超速离心机	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT固定角转子
超速离心管	ThermoFisher	45237	S150-AT转子专用离心管
载体：pBAD-DEST49	ThermoFisher		用于E. coli的Gateway表达载体