本文介绍了一种可靠、微创且经济有效的方法，用于记录和解读活体麻醉成年斑马鱼的心电图。
本文内容
摘要
摘要
成年斑马鱼的心电图波形与人类的心电图波形极为相似。这种心电图上的相似性大大提升了斑马鱼作为人类心脏电生理学和心肌病研究模型的价值，同时也使其成为高通量药物筛选中评估潜在人类心脏毒性的替代模型，例如QT间期延长。因此，成年斑马鱼的活体心电图检测是一种必要的（甚至不可或缺的）电生理表型分析工具，适用于横断面或纵向的活体电生理特征刻画。然而，由于缺乏一种可靠、实用且成本效益高的记录方法，这一活体诊断工具的广泛应用仍面临重大挑战。本文介绍了一种实用且直接的成年斑马鱼活体心电图检测方法，采用一套低维护、成本效益高且全面的系统，可获得稳定可靠的心电记录。我们以12至18月龄的健康成年雄性斑马鱼为例，详细说明本实验方案。此外，我们还提出了一种快速的实时判读策略，用于在心电图记录早期进行质量验证，以确保数据的准确性和稳健性。
引言
斑马鱼（Danio rerio）的心脏位于胸腔前腹侧，介于鳃盖与胸鳍带之间。心脏被包裹在一个银白色的松散心包囊内。解剖学上，斑马鱼心脏与具有四个腔室的人类及其他哺乳动物心脏不同，其尺寸极小（约为人类心脏的1/100），且结构上仅有两个腔室，即一个心房和一个心室。然而，斑马鱼与人类的心电图（ECG）波形以及QT间期持续时间却极为相似（图1）。因此，斑马鱼已成为研究人类遗传性心律失常1,2,3 以及进行潜在人类心脏毒性药物高通量筛选的常用模型4,5，例如QT间期延长。
在人类心脏疾病的常规评估中，体表心电图自1903年由Einthoven发明以来，已成为应用最广泛的首选无创诊断工具。相比之下，尽管斑马鱼作为一种动物模型已被广泛使用，但自2006年首次将体表心电图记录方法应用于成年斑马鱼6并在此后经历多次改进7以来，该技术对许多研究人员而言仍难以获取。对于其他开展成年斑马鱼在体心电图检测的研究者而言，操作者之间的显著差异导致不同研究中心电图结果不一致。常见原因包括设备和软件复杂昂贵、信噪比较低，以及电极放置方式不明确，而对成年斑马鱼心电图特征及其潜在组织机制的理解不足进一步加剧了这些问题。鉴于在体心电图是唯一可用于对活体斑马鱼进行电生理表型分析的诊断工具，建立标准化方法以提高其灵敏度与特异性、可重复性和可及性显得尤为必要。
本文介绍了一种实用、可靠且经过验证的方法，用于记录和解读斑马鱼在体心电图（图2）。通过在额状面使用单一的双极导联，我们研究了活体麻醉状态下健康野生型AB成年斑马鱼心电图波形及间期持续时间的变化。
方案
本研究中的所有实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。本研究中的所有动物实验方案均经加州大学洛杉矶分校机构动物护理与使用委员会批准。
1. 实验装置的准备
- 在28 °C ± 0.5 °C条件下，将斑马鱼饲养于流水式水族系统中，光照周期为14小时光照、10小时黑暗。每日投喂薄片饲料和活体丰年虾（Artemia）卤虫无节幼体每天两次。本研究中的斑马鱼由加州大学洛杉矶分校斑马鱼核心设施（UCLA Zebrafish Core）饲养并喂食。
- 实验当天，将斑马鱼从水族箱转运至实验室。
- 通过连接必要的设备，并将三个颜色编码的不锈钢电极插入放大器上颜色匹配的三个接入端口，建立体内心电图记录系统图3开始心电图记录和/或分析会话时启动系统。
- 获取 必要的工具，例如计时器/秒表、带有切口以固定鱼体的湿海绵、镊子、剪刀、巴斯德吸管以及培养皿（100 mm × 20 mm）。
2. 麻醉诱导
- 准备浸入式麻醉以控制疼痛并使鱼类 immobilization，避免心电图数据采集过程中出现运动伪影。大多数实验室使用浸入式三卡因（ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate，MS-222）。
- 配制0.4%三卡因储备液：将以下成分加入带螺帽的棕色玻璃瓶中：400 mg三卡因粉末、98 mL双蒸水和2 mL 1 M Tris（pH 9）。根据需要使用1 N NaOH或1 N HCl调节pH至7.08。
- 配制三卡因终末浸入液时，需根据斑马鱼的年龄9、体型、代谢状态、品系、疾病模型、科研目标及操作持续时间，确定合适的最低浓度。
- 必要时开展三卡因浓度-反应研究，从推荐浓度168 mg/L（或0.0168%）9开始上下滴定，以在3分钟内达到 麻醉第4级，同时尽可能减少心肺毒性。例如，在本研究中，将12-18月龄的野生型AB斑马鱼浸入0.02-0.04%三卡因溶液，可在3分钟内诱导达到麻醉第4级。
注意：在麻醉第4级，平衡能力与肌肉张力完全丧失，鳃盖运动频率降低8。 - 如有需要，可咨询机构动物护理与使用委员会（IACUC）的兽医，以获取有关麻醉剂选择及其给药途径适用性的进一步指导。
- 将成年斑马鱼浸入含有最低预设且经IACUC批准浓度三卡因溶液的培养皿中（例如本研究中为0.02-0.04%），以在3分钟内诱导达到麻醉第4级（图2）。
- 对于需存活的心电图实验方案，应尽可能缩短心电图记录时间（少于10分钟）。对于持续时间少于15分钟的短暂记录，无需维持麻醉状态。
- 对于持续数小时的长时间心电图记录，应使用长效肌内麻痹剂并配合口腔灌流系统，以充分提供水合与氧合6。
3. 心电图导联放置
- 当斑马鱼维持4级麻醉状态达3秒后，立即使用钝头镊子将鱼转移到湿润海绵的切口中，使其腹面朝上，以便放置心电图导联电极（图4）。
- 轻柔地将三个心电图导联电极插入鱼体肌肉组织，深度约为1 mm，以在额状面建立双极导联，该导联方向与心脏主轴的左尾侧-右头侧方向平行。
- 将正极（红色）电极置于动脉球水平的腹侧中线上，即位于连接两侧鳃盖下缘的假想线上方1–2 mm处（图4A）。
- 将负极（黑色）电极置于正极后方，并向左侧偏移0.5–1.0 mm，其距离应大于成年斑马鱼心室的最大心尖-心底长度（图4A）。
- 将参考电极（绿色）置于尾部靠近肛门区域。
注意：由于不同个体斑马鱼的心脏主轴存在一定差异，为最大化R波和T波的振幅，应通过反复试验进行小幅度、系统性的调整来优化导联位置。例如，每次仅调整一个电极（正极或负极），并在改变方向前沿某一特定方向逐步调节，避免在随机方向上进行无规律的调整。
4. 心电图记录
- 打开心电图数据采集程序。从下拉菜单中选择范围、低通和高通的所需设置。例如，本实验所用的活体心电图记录系统中，以下设置可为正常成年斑马鱼提供稳定且满意信噪比的信号：范围设为“2 mV”，低通设为“120 Hz”，高通设为“0.03 s”。
- 按压 开始 以1 kHz的采样率开始连续无间断的心电图记录。
- 为优化导联位置以获得最大信噪比，请按 停止 停止心电图记录，并在每次心脏首次记录尝试后立即查看心电图波形。 要诊断成年斑马鱼心电图是否正常，请确认以下几点： 同时满足以下全部四项验证标准（图1):
- 标准1：确保所有心电图波形（P波、QRS波群和T波）均清晰可辨且易于观察。
- 标准 2：确保 P 波为正向。
- 标准3：确保QRS波群的净值为正（即R波振幅大于Q波与S波振幅之和）。
- 标准 4：确保 T 波为正向。
- 如果预期为正常心电图，则在必要时重新放置电极（可先尝试调整负极），直至满足全部四项验证标准。
- 如果预期T波正常，但T波过小，应调整电极位置以最大化T波振幅。
- 优化导联位置后，恢复心电图记录。保存心电图扫描结果以供后续分析。
5. 麻醉复苏
- 心电图记录结束后，小心移除电极，避免损伤 鱼类。将鱼 转移至不含三卡因的新鲜充氧鱼水中。
- 为促进麻醉后的恢复，使用巴斯德移液管用力将水喷洒于鳃部，直至鱼恢复规律的鳃部运动或开始游动。
- 监测鱼从麻醉中完全恢复的情况（通常需1-2分钟），以鱼能够正常直立游动至少5秒为恢复指标。
6. 心电图解读
- 定义分析设置。
- 了解软件界面（材料表通过阅读心电图数据分析软件的操作手册。
注意：尽管下述说明针对本实验室所用的商业软件，但任何心电图分析软件包中需要完成的基本操作本质上均相同。 - 打开心电图数据分析程序。从 文件 菜单，选择 打开 打开感兴趣的 ECG 文件并显示完整的 ECG 走向。使用鼠标在 ECG 走向上框选待分析的感兴趣区域。
- 从 心电图分析 菜单，选择 心电图设置 打开一个对话框，以预定义软件自动分析的各种参数设置（图5A).
- 了解软件界面（材料表通过阅读心电图数据分析软件的操作手册。
- 分析心律和心率。
注意：心率受多种因素影响，包括斑马鱼的年龄和品系、麻醉剂（如三卡因、异氟烷等）及其浓度、麻醉剂的使用方式（单一试剂）5,7 与联合用药相比5）和曝光时间5例如，在本研究中，将12-18月龄的野生型AB斑马鱼浸入0.02-0.04%三卡因溶液中3-5分钟后，其心率为116 ± 17次/分钟（n = 9），与文献报道的该年龄组在麻醉状态下的心率一致5,7.- 确定心律是否为窦性，以及是否规则或不规则。
注意：窦性心律的存在（或缺失）依据每个 QRS 波群之前是否存在一个直立的 P 波，并伴有正常的 PR 间期（例如，Liu 等人研究中 10–12 月龄小鼠为 60–65 ms）7 本研究中使用了12至18月龄的野生型AB斑马鱼。心房和心室节律的规整性（或不规整性）分别基于连续的PP间期或RR间期的规整性（或不规整性）。 - 为确定心率，需确保软件正确识别所有P波和R波。根据P波和R波的这些自动识别结果（或手动校正），软件将自动测量所选心电图片段中的所有PP间期和RR间期，计算间期的平均值，从而得出心房率和心室率。
注意：心房率是平均PP间期，而心室率是平均RR间期。确定心率时，准确识别P波和R波至关重要。 - 通过将错位的光标移动到相应的P波和R波来纠正自动识别错误（图5B).
注意：如果心脏处于窦性心律，由于窦性P波与QRS波群之间存在一对一的对应关系，心房率与心室率相同。然而，在房室分离的情况下（例如室性心动过速或三度房室传导阻滞），P波与QRS波群之间的一对一对应关系消失；因此会出现两个心率，因为心房率与心室率不同。 - 若心律规整，根据至少五个连续完整的 cardiac 周期确定心率；若心律不规整，则根据至少六秒长的心电图记录确定心率。
- 确定心律是否为窦性，以及是否规则或不规则。
- 计算 间期和波持续时间。
- 前往 心电图分析 > 平均视图 连接 n （例如，5个）连续的心动周期合并为一个平均信号（图5C).
注意：如果某个心动周期的ECG波形与平均信号存在显著差异，则应单独分析该心动周期，不进行拼接。 - 确保软件正确识别平均图窗口中显示的P波、QRS波群和T波的起始与终止位置图5C根据这些波形和间期的自动识别结果（或人工校正），软件会按照常规定义自动测量其持续时间。
注意：PR 间期从 P 波起点延伸至 QRS 波群（或当 Q 波不可见时为 RS 波群）的起点。QRS 时限从 Q 波起点（或当 Q 波不可见时为 R 波起点）延伸至 S 波终点（即 J 点）； 图1QT 间期从 Q 波起点（若 Q 波不可见，则从 R 波起点）延伸至 T 波终点。因此，要计算间期和持续时间，准确识别 P 波、QRS 波群和 T 波的起点与终点至关重要。 - 通过将错位的光标移动到正确位置，修正任何自动识别错误。
- 选择S波的负向波峰作为QRS波群的终点7 因为斑马鱼J点（标志着S波结束）往往难以准确定位，这会导致对真实QRS波持续时间的轻微低估。
注意：心电图分析软件会使用用户在步骤 6.1.3 中预选的方法（例如 Bazett 法），自动根据心室率（或 RR 间期）对 QT 间期进行校正，从而得到校正后的 QT 间期（QTc）。图 5A）。Bazett公式（1920） QTc = QT / √RR 是校正人心率QT间期最常用且最早提出的方法之一。由于Bazett公式的准确性受到质疑，建议参考其他针对人类提出的方法。10,11 和斑马鱼6 (图 5D).
- 前往 心电图分析 > 平均视图 连接 n （例如，5个）连续的心动周期合并为一个平均信号（图5C).
- 通过识别第4.3步中四项验证标准的例外情况，解读心电图异常。
- 识别标准1的例外情况。当不存在任何P波时（提示缺乏窦性心律），应依据RR间期和QRS波群时限来诊断心律。例如，若RR间期呈不规则且不等（绝对不齐），应诊断为心房颤动；若RR间期规则且QRS波群时限正常窄小，应诊断为交界性逸搏心律；反之，若RR间期规则且QRS波群时限异常延长，应诊断为室性逸搏心律。
- 识别标准2的例外情况。当P波为负向（或倒置）时，诊断为异位起搏点引起的逆行心房激动（如窦房结下游的心房部位、房室结或心室）。
- 识别标准3的例外情况。当出现高而窄的Q波，同时伴有负向P波和负向T波时，应诊断为导联接反，原因是正负电极位置错误互换，导致原本的高而窄的R波被误录为Q波。图 6D相比之下，当出现宽大Q波且伴有正向P波，并在显著心脏损伤后存在时，应诊断为心肌梗死，因为这些宽大Q波属于真正的病理性Q波。
- 识别第4条标准的例外情况。当T波倒置时，应检查心室激动，以确定心室复极异常是原发性还是继发性。结合临床情况，从原发性心室复极异常的鉴别诊断列表中（如药物作用或心肌缺血所致）缩小范围，明确正确诊断。 图6C) 与继发性心室复极异常（由预激、室性异位搏动或心室起搏引起的心室激动异常所致）的鉴别。
- 导出心电图结果。
- 选择 表格视图 复查所有心电图测量结果。选择感兴趣的测量数据，复制并粘贴至目标文档（如 Excel 电子表格）中。
- 要导出心电图波形，请使用放大镜图标在心电图扫描中选中感兴趣的区域，然后复制并粘贴到目标文档中（例如 Word 或 PowerPoint）。
结果
图1 说明了本文所介绍方法的临床相关性。尽管斑马鱼与人类在解剖结构上存在显著差异，但由于斑马鱼与人类心电图（ECG）之间具有高度相似性，成年斑马鱼的活体体表心电图记录已成为一种重要的电生理表型分析工具。斑马鱼心脏仅有一个心房和一个心室，而人类心脏则有两个心房和两个心室（上排；分别为右和左）。然而，尽管斑马鱼心脏在解剖结构上较为简单，其心电图特征却与人类心脏具有多项相似之处（下排；分别为右和左）。因此，斑马鱼心脏已逐渐成为研究人类心脏电生理学的替代模型5,12,13。图1 展示了一条来自一只存活、健康的14月龄斑马鱼的微小但清晰可辨的Q波。然而，在斑马鱼心电图记录中，电极位置通常未经过优化以显示Q波，因此Q波通常不可见，斑马鱼心电图中更常见的是RS波群，而非完整QRS波群。
图2总结了对成年斑马鱼进行微创活体心电图记录的四个关键操作步骤。在实施麻醉（步骤1）和放置电极（步骤2）后，我们从12至18月龄的健康野生型AB斑马鱼中记录了基础心电图信号（步骤3）（n = 9）。我们的电极插入技术仅为微创，因为无需剥离鱼鳞或进行心包切开。在完成数据采集后，我们手动审查并确认每一份心电图记录（步骤4），以避免软件自动分析可能导致的误判。
图3展示了典型心电图（ECG）数据采集与处理系统的三个必不可少的组成部分：高性能数据采集硬件、高增益差分放大器，以及安装有ECG数据采集与分析软件的计算机。在我们的实验室中，我们将一种现有的商用体内心电图记录系统进行了改造，该系统最初是为小型哺乳动物模型（如小鼠、大鼠和兔子）设计的，现已被适配用于成年斑马鱼模型。
图4 表明正确的导联放置需要将导联与假定的心脏主轴对齐。在斑马鱼中 体内 心电图记录由于仅使用单个导联，因此正确放置导联电极以同时最大化R波和T波振幅至关重要。为了最大化R波和T波的振幅，我们将正极和负极电极与心脏长轴对齐，推测其方向为左尾侧至右头侧。在开胸并行心包切开术以打开心包囊并暴露心脏后，心脏长轴变得清晰可见。图4B 白色虚线）。事实上，通过心包切开术暴露心脏是一种常用的策略，可提高信噪比7 以将心电图记录从微创操作转变为高度侵入性操作为代价。
图5展示了心电图分析中的关键步骤。首先，我们通过心电图设置对话框预先定义了软件自动分析的各种参数设置（图5A）。由于我们重新利用了原本为哺乳动物模型设计的心电图记录设备来适应成年斑马鱼，因此该软件中没有针对斑马鱼的检测与分析预设选项。鉴于斑马鱼心电图与人类心电图具有显著的相似性，我们选择了“人类预设”模式（图5A）。其次，在命令软件重新计算平均心室率之前，我们手动核验了软件自动识别的心电图R波峰值（黑色标记），并对任何R波自动识别错误进行校正（红色标记）。例如，在图5B中，相对于R波较大的P波导致软件错误地识别了R波，从而引起后续RR间期或心室率的自动计算错误。因此，在心电图分析中，人工核验及必要时进行适当校正至关重要。第三，我们使用平均视图（图5C）快速评估心律规律性，并计算各波形和间期的平均持续时间，该功能可将多个连续的心动周期（绿色）合并为一个单一的平均信号（黑色）。在图5C中，九个心动周期各自与平均信号之间的偏差极小，表明该斑马鱼心脏具有极佳的心律规律性。最后，我们启用软件采用Bazett法（七种可用方法之一）对QT间期进行心率校正（图5D）。
图6A-C 展示了电极植入深度对心电图信号幅度的影响。当我们将电极错误地植入真皮层过浅的位置时（图6A），导联呈现“间接”特征（距离心脏超过两个心脏直径，类似于标准人体心电图的肢体导联I、II和III），电压信号较小。当我们将电极适当地向胸肌层内再植入1 mm深度时（图6B），导联变为“半直接”（靠近心脏但未与心脏直接接触），电压信号增强，心电图波形变得清晰可见。然而，当我们将电极错误地植入更深的位置，进入心室内部时（图6C），导联变为“直接”（与心脏直接接触），电压信号进一步增大。图6C 中R波的振幅相比 图6A 增加了八倍，相比 图6B 增加了四倍。然而，图6C 中的心电图轨迹显示出新的心室心肌损伤征象，例如新的ST段压低和新的T波倒置。
图6D 展示了所有心电图波形（P、Q、R、S 和 T）出现异常倒置时，应提示导联接反错误，即正极和负极电极位置互换。需注意，根据定义，Q 波和 S 波始终为负向，而 R 波始终为正向。
图 6E- F 显示不适当的麻醉深度会如何损害实验质量 体内 心电图记录。在 图6E，麻醉不充分（0.017% 三卡因）导致斑马鱼未能完全 immobilize。由此产生的运动伪影通过污染信号（星号）和增加噪声（箭头）两种方式降低了信噪比。相比之下，在 图6F，过量麻醉（0.08% 三卡因）引起严重窦性心动过缓以及ST段和T波的改变。
图1：人类与斑马鱼心脏的解剖结构与心电图对比。 与具有两个心房和两个心室的人类心脏不同，斑马鱼心脏仅有一个心房和一个心室（上排）。缩写：RA，右心房；LA，左心房；RV，右心室；LV，左心室。斑马鱼心脏在心电图特征上与人类心脏存在多项共同点（下排）。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：微创体内心电图记录方案。 该示意图展示了进行体内心电图检测的四个关键操作步骤：诱导麻醉、放置心电图导联电极、记录心电图，以及分析心电图记录结果。请点击此处查看该图的放大版本。
图3: 心电图数据采集与处理系统。 一套集成的在体心电图记录系统包含三个关键组成部分：用于数据采集的硬件设备、放大器，以及用于数据采集和分析的计算机软件。该放大器配备三根可直接使用的29号不锈钢微电极。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4： 心电图导联放置。 将三个29号彩色编码的不锈钢电极牢固地插入鱼体肌肉，深度约为1 mm。负极（黑色）电极与正极（红色）电极的放置位置在额状面上形成一个双极导联，方向为左后至右前。缩写：ref，参考电极 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：ECG分析中的关键步骤。（A）预先设定软件自动分析的各项参数设置。（B）手动校正（红色）软件对P波和R波的两处自动误识别（黑色），以纠正软件对心房和心室率的计算错误。（C）将九个连续的心动周期（绿色）合并为一个平均信号（黑色），以快速评估心律的规律性/不规律性，并计算波形和间期的平均持续时间。（D）使用多种方法（如Bazett法）对QT间期进行心率校正。请点击此处查看本图的放大版本。
图6：导联放置位置与麻醉深度对ECG信号的影响。决定活体ECG记录成功与否的两个最关键步骤是导联放置位置（A-D）和麻醉深度（E-F）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
在本研究中，我们采用单导联方法记录成年斑马鱼的活体心电图（ECG），但在此过程中存在若干影响心电图记录质量与有效性的注意事项。首先，在选择合适的麻醉剂以及确定所需最低麻醉浓度、深度和持续时间时，需权衡麻醉剂的心脏毒性与抑制运动伪迹的必要性，同时应根据实验设计是生存性实验还是终末性实验进行预先判断。通常采用的策略包括：利用来自不同药物类别麻醉剂的协同效应5,14以及与肌松剂联用1,6，以降低单个药物的剂量5；或在较高诱导剂量后给予较低的维持剂量。然而，尽管三卡因（tricaine）存在已知的心肺毒性风险，甚至可能导致死亡8，它仍是目前应用最广泛、效果最佳且唯一被美国食品药品监督管理局（FDA） 批准用于斑马鱼麻醉的药物。三卡因在成年斑马鱼心电图记录中被广泛使用，既可单独使用，也可与其他麻醉剂或肌松剂联合使用。
其次，通过采用我们提出的成年斑马鱼心电图正常性的四项验证标准，至少可以确保健康正常斑马鱼的电极放置准确性。在本文提出的四项验证标准中，后两项标准共同确认了正常心电图中R波与T波极性之间的一致性5,7,15。R波与T波极性的一致性是斑马鱼与人类正常心电图之间一种偶然但关键的相似特征16,17，这增强了斑马鱼心脏模型作为人类心脏电生理学替代模型的临床相关性。然而，多种良性或恶性病理状态可能导致其中任意一项验证标准失效。例如，在心肌缺血情况下，R波与T波的一致性会消失7,15。心肌缺血中R波与T波一致性丧失的现象，是斑马鱼与人类心电图之间的另一显著相似之处，这也进一步提升了斑马鱼心肌梗死模型的临床相关性。
最后，我们建议遵循心电图分析中的标准操作规范。随着技术的发展，心电图分析软件能够自动生成心电图解读结果。然而，我们强烈建议，应由经过培训的专业人员结合心电图记录时的具体临床情况，对所有心电图进行重新判读和核实。常规情况下，仅依赖心电图分析软件的自动解读是不可取的，尤其是在存在常见的心电图正常变异、心脏疾病或导联放置不理想的情况下。
本研究聚焦于进行短暂心电图记录的微创方法。然而，若需要进行长达数小时的终末期心电图记录，则必须进行改进，通过持续灌注以提供充足的氧气供应、水合作用和麻醉6。
此外，可通过至少三种方法之一来增强信噪比。选择更强大的放大器通常是一种昂贵甚至不切实际的方案。打开心包膜以减少容积导体是一种合理但具有侵入性的方法，已被采用7。通过战略性地放置导联，使导联轴方向与心脏主轴方向平行（图4B），可最大化心电图电压信号，但可能需要反复尝试，尤其是在未进行心包切开的情况下。
本文介绍的成年斑马鱼活体心电图检测方法具有四个主要优势。首先，我们的微创方法仅需插入电极，无需去除鱼鳞或进行胸腔-心包切开术。因此，通过尽量减少对鱼类造成的疼痛，该方法可在纵向存活研究中实现多次重复的心电图检测。其次，当麻醉剂充分抑制鱼类运动时，本研究中的活体心电图记录系统能够持续获得令人满意的信噪比，并得到无噪声的原始信号。第三，我们提出的四条标准质量验证体系可在心电图数据采集早期确保数据的准确性和稳健性，并最大限度地减少操作者依赖性差异。最后，特别是我们的第四条验证标准（正常T波直立）体现了R波与T波的一致性，这是斑马鱼正常心电图中一种重要的人类相似特征（图1）。
然而，目前我们研究团队及其他团队在成年斑马鱼体内心电图（ECG）研究方法上仍存在四个主要局限性。
首先，由于缺乏受试对象的配合，必须使用麻醉，而这会带来限制性的 cardiorespiratory 毒性后果。对于活体 ECG 检测，人类患者从不需要镇静，而斑马鱼则始终需要麻醉剂或麻痹剂，这些药物均会引起不同程度的 cardiorespiratory 毒性。
其次，固定连接的 ECG 导联略微增加了原本为非侵入性操作的侵入程度。在人类体表 ECG 记录中，导联放置完全是非侵入性的，因为电极仅附着于人体表皮；而在斑马鱼活体 ECG 记录中，导联放置更具侵入性，因为至少需要使用钢制电极刺穿鱼体皮肤，以牢固插入鱼体肌肉组织中。
最后两个局限性源于斑马鱼胸腔和心脏的解剖学限制。第三，成年斑马鱼心脏体积微小，要求心电图导联数量必须大幅减少。人类标准心电图记录可轻松容纳十二个导联，而成年斑马鱼通常仅能容纳一个单极或双极导联。单一心电图导联带来的问题是难以同时优化P波、R波和T波这三个波形的振幅。因此，成年斑马鱼心电图检测中导联位置的优化与精确放置至关重要。在斑马鱼中，T波的检测尤为困难，因为它通常是这三个波形中最小的。因此，在优化过程中，应优先考虑斑马鱼T波振幅，而非通常更大的P波和R波。
第四，确定斑马鱼主要心脏轴线以最大化R波振幅可能具有挑战性。原因是斑马鱼心脏在其宽松的心包囊内具有比人类心脏在其贴合紧密的手套样心包内更大的活动自由度。
总体而言，这些局限性将推动未来方法学的创新。随着3D打印和可变形电子技术的发展18，有望在未来实现对清醒、活跃游动的斑马鱼直接植入导联，使用无线电极传感器构成的“心脏套”进行监测。
披露
本视频文章的开放获取由 AD Instruments 赞助。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01 HL141452 项目对 TPN 的资助。ADInstruments 公司提供了慷慨资助，用于抵消开放获取出版费用，但该公司在本研究的实验设计、数据采集、数据分析以及论文发表前的任何环节均未参与，亦未获取论文的访问权限。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养皿 | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
| 杜蒙镊子 | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
| FE136 动物生物放大器 | AD Instruments | FE231 | |
| 虹膜镊 | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
| LabChart 8 Pro | AD Instruments | 含心电图模块的软件 | |
| 用于动物生物放大器的针状电极 | AD Instruments | MLA1213 | 29 号 |
| 塑料一次性移液管 | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 英寸，1.2 mL |
| PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
| 剪刀 | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
| 三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐） | Sigma | E10521-10G | MS-222 |
参考文献
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