从人和小鼠心肌标本中分离巨噬细胞亚群和基质细胞

摘要

本文介绍了一种通过酶消化制备单细胞悬液，从人和小鼠心肌组织中分离巨噬细胞及其他非免疫细胞不同亚群的实验方案。同时提供了基于流式细胞术对分离得到的巨噬细胞进行鉴定与表征的设门策略。

摘要

巨噬细胞是心脏中异质性最强且数量最丰富的免疫细胞群体，在心脏损伤后驱动炎症反应和修复过程方面起着核心作用。不同亚群的巨噬细胞如何协调心脏损伤后的免疫反应，是当前研究的热点领域。本文介绍了一种本实验室常规使用的简单方案，用于从健康与疾病个体的小鼠及人心肌标本中提取巨噬细胞。简而言之，该方案包括对心肌组织进行酶消化以获得单细胞悬液，随后进行抗体染色和流式细胞术分析。该技术适用于对分选后的细胞进行功能检测，以及批量和单细胞RNA测序。此方案的主要优势在于操作简便、日间变异小、适用范围广，可用于研究多种小鼠模型及人类疾病状态下巨噬细胞的异质性。

引言

巨噬细胞是心脏中最丰富的免疫细胞类型，在心脏损伤后引发强烈的炎症反应和修复反应中发挥重要作用^1,2,3,4。此前，我们的研究团队鉴定了小鼠心脏中来源于不同发育起源的两大主要巨噬细胞亚群^5,6。总体而言，可根据细胞表面C-C趋化因子受体2（C-C motif chemokine receptor 2, CCR2）的表达情况，区分出不同的心脏组织驻留巨噬细胞亚群。CCR2^-巨噬细胞（细胞表面表型：CCR2^-MHCII^low 和 CCR2^-MHCII^high）起源于胚胎期（原始造血和红髓系谱系），具有自我更新能力，在稳态条件下占主导地位。而驻留型CCR2⁺巨噬细胞则来源于定型造血，通过循环单核细胞募集维持，在稳态条件下属于次要群体。功能上，CCR2^-巨噬细胞引发的炎症反应较弱，对冠状动脉发育和新生期心脏再生至关重要^5,

方案

本方案已获得圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会批准（编号：201305086）。所有受试者在样本采集前均签署知情同意书，实验均按照批准的研究方案进行。本方案的实施已获得华盛顿大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》中所述的指导原则。

1. 人源心脏组织样本的制备

1. 通过插管左、右冠状动脉开口，用200 mL冷盐水冲洗离体心脏。
2. 通过插管心外膜血管，用50 mL冷盐水冲洗左心室辅助装置（LVAD）心尖部芯样组织。
3. 使用无菌剪刀在冷盐水或HBSS中从左心室心尖壁或侧壁分离出组织标本。
4. 使用精细剪刀小心地从标本中分离出心外膜脂肪和腱索。
5. 借助无菌刀片或剪刀将组织切成约200 mg重的小块。

2. 小鼠心脏的制备

1. 通过 CO₂ 窒息或颈椎脱位法处死小鼠。
2. 使用锋利的剪刀打开胸腔。用钝头止血钳将心脏向上提起。使用连接在 5 mL 注射器上的 25 G 针头，以冷 PBS 灌注心脏。持续灌注直至心脏颜色变苍白。
3. 取出心脏并置于冰上的无菌培养皿中。

3. 单细胞悬液的制备

1. 将人的心脏组织块（约 ....

结果

本方案描述了从小鼠和人心肌中分离巨噬细胞的方法。采用相同的方案，但使用不同的染色和设门策略，也可从人心肌中获取基质细胞。此处展示的流式细胞术结果是在BD LSRII或BD FACS ARIA III平台上获得的。补偿对照由经染色的脾细胞单色对照样本生成。图1显示了未经处理和经处理的人左心室辅助装置（LVAD）核心组织。图2展示了对CCR2^-和CCR2⁺人巨噬细胞进行流式分选的设门策略。图3A展示了从人心肌中分选CD45^-基质细胞的设门方案，图3B展示了经Wright染色的流式分选CD45⁺和CD45^-细胞的图像。图4

讨论

该方案可用于从人心肌组织中分离出多种巨噬细胞亚群。该方案操作简便，制备适用于流式细胞术分析的单细胞悬液仅需3至4小时。尽管该方案相对简单，但仍需注意某些技术细节，以尽量减少实验变异。首先，处理人体组织时需及时操作，以确保细胞活性最佳。应将组织保存在冷的生理盐水或HBSS中，以减少细胞死亡。此外，必须从心肌标本中去除心外膜脂肪及其他结缔组织。保持一致的组织剪切程度和消化时间，有助于降低样本间的差异。

组织消化及后续的细胞得率存在批内和批间差异，这是从组织制备单细胞悬液的局限性之一。最大限度降低这种差异的最重要方法是确保所用酶类相对较新、分装得当，并保存在 -80 °C。酶分装后应仅使用一次，不得保存或再次冻存，因为所用酶对冻融循环敏感。另一个需考虑的因素是消化温度和振荡速度。使用温控振荡器可均匀传热，有助于减少消化过程的变异性并提高细胞活力。

需要强调的是，从人心肌组织中获得的巨噬细胞绝对产量通常并不高。一般每1,200-1,500 mg组织可获得约20,000至50,000个总巨噬细胞。当后续分析方法涉及细胞培养实验时，这一产.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥管	Thermo Fisher	14-959-53A
40 µm 细胞滤网	Thermo Fisher	50-828-736
50 mL 圆锥管	Thermo Fisher	352098
ACK 裂解缓冲液	Gibco	A10492-01
牛血清白蛋白	Sigma	A2058
胶原酶 1	Sigma	C0130-1G
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM 1x	Gibco	11965-084
脱氧核糖核酸酶 1	Sigma	D4527-20KU
DRAQ5	Thermo Fisher	62251
EDTA 0.5 M pH 8	Corning	46-034-CI
酶失活缓冲液			490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS 缓冲液			976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M)
胎牛血清	Gibco	A3840201
镊子	VWR	82027-406
HBSS 1x	Gibco	14175-079
止血钳	VWR	63042-052
透明质酸酶 1-s 型	Sigma	H3506-500MG
PBS 1x	Gibco	14190-136
培养皿	Thermo Fisher	172931
刀片	VWR	55411-050
剪刀	VWR	82027-578