本文介绍了一种通过酶消化制备单细胞悬液，从人和小鼠心肌组织中分离巨噬细胞及其他非免疫细胞不同亚群的实验方案。同时提供了基于流式细胞术对分离得到的巨噬细胞进行鉴定与表征的设门策略。
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摘要
摘要
巨噬细胞是心脏中异质性最强且数量最丰富的免疫细胞群体，在心脏损伤后驱动炎症反应和修复过程方面起着核心作用。不同亚群的巨噬细胞如何协调心脏损伤后的免疫反应，是当前研究的热点领域。本文介绍了一种本实验室常规使用的简单方案，用于从健康与疾病个体的小鼠及人心肌标本中提取巨噬细胞。简而言之，该方案包括对心肌组织进行酶消化以获得单细胞悬液，随后进行抗体染色和流式细胞术分析。该技术适用于对分选后的细胞进行功能检测，以及批量和单细胞RNA测序。此方案的主要优势在于操作简便、日间变异小、适用范围广，可用于研究多种小鼠模型及人类疾病状态下巨噬细胞的异质性。
引言
巨噬细胞是心脏中最丰富的免疫细胞类型，在心脏损伤后引发强烈的炎症反应和修复反应中发挥重要作用1,2,3,4。此前，我们的研究团队鉴定了小鼠心脏中来源于不同发育起源的两大主要巨噬细胞亚群5,6。总体而言，可根据细胞表面C-C趋化因子受体2（C-C motif chemokine receptor 2, CCR2）的表达情况，区分出不同的心脏组织驻留巨噬细胞亚群。CCR2-巨噬细胞（细胞表面表型：CCR2-MHCIIlow 和 CCR2-MHCIIhigh）起源于胚胎期（原始造血和红髓系谱系），具有自我更新能力，在稳态条件下占主导地位。而驻留型CCR2+巨噬细胞则来源于定型造血，通过循环单核细胞募集维持，在稳态条件下属于次要群体。功能上，CCR2-巨噬细胞引发的炎症反应较弱，对冠状动脉发育和新生期心脏再生至关重要5,7。相反，CCR2+巨噬细胞在心脏受到损伤后会启动强烈的炎症反应，导致继发性心肌细胞损伤、左心室不良重构以及心力衰竭的进展8,9。
最近，我们已证明人类心肌中也存在两种不同的巨噬细胞亚群，同样可鉴定为 CCR2- 或 CCR2+8。基因表达和功能分析表明，人类 CCR2- 和 CCR2+ 巨噬细胞代表功能上不同的亚群，其功能类似于小鼠心脏中发现的 CCR2- 和 CCR2+ 巨噬细胞。人类 CCR2- 巨噬细胞表达高水平的生长因子，包括 IGF1、PDGF、Cyr61 和 HB-EGF。CCR2+ 巨噬细胞则富集促进炎症的趋化因子和细胞因子，如 IL-1b、IL-6、CCL-2、CCL-7 和 TNF-a。在体外培养中，受刺激的 CCR2+ 巨噬细胞分泌的促炎性细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）水平显著升高。在心脏损伤背景下，这些亚群如何差异性地参与组织修复和左心室（LV）重塑，仍是当前活跃的研究领域。
基于流式细胞术分析小鼠和人心脏中巨噬细胞异质性，需先消化心脏组织并制备单细胞悬液，随后进行流式细胞术分析或细胞分选，以用于后续操作，如批量RNA测序、单细胞RNA测序或细胞功能实验培养。从鼠类心脏制备单细胞悬液的原始方案最初由Nahrendorf团队在Nahrendorf等（2007）中报道10。本实验室已对该方案进行适应性改进，用于从人心肌组织中提取巨噬细胞。通过相同方案并结合染色与设门策略的轻微调整，也可分离人心肌组织中的CD45-基质细胞。本文以文字和视频形式展示了一种常规用于从人心肌组织中提取巨噬细胞或基质细胞的实验方案。
心脏组织标本取自患有扩张型心肌病（DCM：特发性或家族性）或缺血性心肌病（ICM）并接受左心室辅助装置（LVAD）植入或心脏移植的成年患者。在开始消化程序之前，需通过血管灌注冷盐水处理取出的心脏或LVAD核心组织。需要注意的是，组织标本的"质量"（以瘢痕程度或脂肪组织浸润程度来判断）会显著影响巨噬细胞的收获量。瘢痕面积较大的心脏组织标本细胞收获率将明显降低，当后续所需的分析方法需要体外细胞培养时，可能带来严重的技术限制。
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方案
本方案已获得圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会批准（编号：201305086）。所有受试者在样本采集前均签署知情同意书，实验均按照批准的研究方案进行。本方案的实施已获得华盛顿大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》中所述的指导原则。
1. 人源心脏组织样本的制备
- 通过插管左、右冠状动脉开口，用200 mL冷盐水冲洗离体心脏。
- 通过插管心外膜血管，用50 mL冷盐水冲洗左心室辅助装置（LVAD）心尖部芯样组织。
- 使用无菌剪刀在冷盐水或HBSS中从左心室心尖壁或侧壁分离出组织标本。
- 使用精细剪刀小心地从标本中分离出心外膜脂肪和腱索。
- 借助无菌刀片或剪刀将组织切成约200 mg重的小块。
2. 小鼠心脏的制备
- 通过 CO2 窒息或颈椎脱位法处死小鼠。
- 使用锋利的剪刀打开胸腔。用钝头止血钳将心脏向上提起。使用连接在 5 mL 注射器上的 25 G 针头，以冷 PBS 灌注心脏。持续灌注直至心脏颜色变苍白。
- 取出心脏并置于冰上的无菌培养皿中。
3. 单细胞悬液的制备
- 将人的心脏组织块（约 200 mg）或小鼠心脏置于无菌培养皿中，使用无菌刀片或剪刀将组织充分剪碎。
- 设置消化反应：
- 每份人的心脏组织块（200 mg）或每只小鼠心脏使用终体积为 3 mL 的消化液。最终酶浓度如下：胶原酶1（450 U/mL）、DNase1（60 U/mL）、透明质酸酶（60 U/mL）。
- 将 DMEM 和所有酶加入 15 mL 圆锥形离心管中，用于每份消化反应。用洁净的镊子将剪碎的组织放入各反应管中，轻轻涡旋混匀。
- 在 37 °C 摇床培养箱中以低至中等振荡速度消化 1 小时。
- 消化 1 小时后，将离心管从培养箱中取出并置于冰上。准备 50 mL 圆锥形离心管，并在管口放置 40 µm 细胞滤网。用 2 mL 酶失活缓冲液（ED 缓冲液）润湿滤膜。
- 向每根消化管中加入 8 mL ED 缓冲液以终止消化酶活性。然后将总共 13 mL 的混合液通过 40 µm 细胞滤网过滤至 50 mL 圆锥形离心管中。将样品转移回新的 15 mL 圆锥形离心管中。此步骤有助于实现最佳细胞沉淀，并减少离心过程中的细胞损失。
- 在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 6 分钟。弃去上清液，保留 0.5 mL 培养基。轻轻吹打重悬细胞沉淀，加入 1 mL ACK 裂解缓冲液。轻轻摇动离心管，在室温下孵育 5 分钟，以裂解红细胞（RBC）。
- 在 ACK 缓冲液中孵育 5 分钟后，向样品中加入 9 mL DMEM。盖紧管盖，轻轻颠倒混匀，并通过 40 µm 细胞滤网过滤。将滤液收集至 15 mL 圆锥形离心管中。
- 以 400 × g 离心 6 分钟，弃去上清液。
- 加入 1 mL FACS 缓冲液重悬细胞沉淀，然后将含细胞的 FACS 缓冲液转移至 1.5 mL 微量离心管中。再次以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 100 µL FACS 缓冲液中。此时已获得单细胞悬液，可用于抗体染色。
4. 抗体染色
- 典型的人源抗体组合包括以下抗体：CD45-PercpCy5.5、CD14-PE、CD64-FITC、HLA-DR-APC/Cy7、CCR2-APC。请参见表1。将所有抗体以1:50稀释比例加入心脏样本中，于4 °C避光孵育约30–40分钟。随后进行下文的步骤4.4。
- 对于基质细胞（内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞），加入DRAQ5（终浓度1 µM）和CD45-percpCy5.5。请参见表1。于4 °C避光孵育30分钟。随后进行下文的步骤4.4。
- 对于小鼠心脏巨噬细胞，加入以下抗体：CD45-PercpCy5.5、CD64-APC、MHCII-APC/Cy7、CCR2-BV421 和 Ly6G-FITC。请参见表2。将所有抗体以1:100稀释比例加入心脏样本中，于4 °C避光孵育约30–40分钟。随后进行下文的步骤4.4。
- 用FACS缓冲液洗涤样本两次。每次洗涤加入1 mL FACS缓冲液，轻轻涡旋混匀，于400 x g 离心5分钟，重悬于350 µL FACS缓冲液中，并加入DAPI（终浓度1 µM）。样本现可用于FACS分析/分选。
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结果
本方案描述了从小鼠和人心肌中分离巨噬细胞的方法。采用相同的方案，但使用不同的染色和设门策略，也可从人心肌中获取基质细胞。此处展示的流式细胞术结果是在BD LSRII或BD FACS ARIA III平台上获得的。补偿对照由经染色的脾细胞单色对照样本生成。图1显示了未经处理和经处理的人左心室辅助装置（LVAD）核心组织。图2展示了对CCR2-和CCR2+人巨噬细胞进行流式分选的设门策略。图3A展示了从人心肌中分选CD45-基质细胞的设门方案，图3B展示了经Wright染色的流式分选CD45+和CD45-细胞的图像。图4
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讨论
该方案可用于从人心肌组织中分离出多种巨噬细胞亚群。该方案操作简便，制备适用于流式细胞术分析的单细胞悬液仅需3至4小时。尽管该方案相对简单，但仍需注意某些技术细节，以尽量减少实验变异。首先，处理人体组织时需及时操作，以确保细胞活性最佳。应将组织保存在冷的生理盐水或HBSS中，以减少细胞死亡。此外，必须从心肌标本中去除心外膜脂肪及其他结缔组织。保持一致的组织剪切程度和消化时间，有助于降低样本间的差异。
组织消化及后续的细胞得率存在批内和批间差异，这是从组织制备单细胞悬液的局限性之一。最大限度降低这种差异的最重要方法是确保所用酶类相对较新、分装得当，并保存在 -80 °C。酶分装后应仅使用一次，不得保存或再次冻存，因为所用酶对冻融循环敏感。另一个需考虑的因素是消化温度和振荡速度。使用温控振荡器可均匀传热，有助于减少消化过程的变异性并提高细胞活力。
需要强调的是，从人心肌组织中获得的巨噬细胞绝对产量通常并不高。一般每1,200-1,500 mg组织可获得约20,000至50,000个总巨噬细胞。当后续分析方法涉及细胞培养实验时，这一产...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目得到了华盛顿大学和圣路易斯儿童医院儿童发现研究所（CH-II-2015-462，CH-II-2017-628）、巴恩斯-犹太医院基金会（8038-88）以及美国国家心肺血液研究所（NHLBI）（R01 HL138466，R01 HL139714）的资助。K.J.L. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）K08 HL123519 项目和伯勒斯威康基金（Burroughs Welcome Fund，1014782）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 圆锥管 | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm 细胞滤网 | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL 圆锥管 | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK 裂解缓冲液 | Gibco | A10492-01 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2058 | |
| 胶原酶 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| 脱氧核糖核酸酶 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| 酶失活缓冲液 | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS 缓冲液 | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| 胎牛血清 | Gibco | A3840201 | |
| 镊子 | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| 止血钳 | VWR | 63042-052 | |
| 透明质酸酶 1-s 型 | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| 培养皿 | Thermo Fisher | 172931 | |
| 刀片 | VWR | 55411-050 | |
| 剪刀 | VWR | 82027-578 |
参考文献
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814(2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
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重印与许可
