胚胎、卵壳及真菌培养物的扫描电子显微镜制样

摘要

本文介绍了利用扫描电子显微镜（SEM）成像精细组织样本的详细处理方案。针对坚硬的蛋壳、早期发育阶段的胚胎以及真菌培养物，分别描述了三种不同的处理方法：六甲基二硅氮烷（HMDS）化学干燥法、简单的空气干燥法和临界点干燥法。

摘要

尽管扫描电子显微镜（SEM）已广泛用于各种生物和非生物样品的超微结构分析，但不同生物样品的处理方法涉及各自独特的操作流程。文献中描述的所有常规样品处理方法目前仍具有实用价值，但样品制备过程中的细微变化可能影响图像质量，并引入假象。因此，必须根据所分析组织类型的特性采用特定的样品制备技术，才能获得具有超微结构分辨率的高质量图像。本研究的重点是为利用SEM成像胚胎、坚硬的卵壳以及真菌培养物提供最优的样品制备方案。针对所研究的三种不同且敏感的生物样品，推荐以下优化措施：必须使用较温和的固定剂（如4%多聚甲醛或3%戊二醛），随后采用乙醇梯度进行脱水。通过载片培养法获得的琼脂块上的真菌菌丝体，其超微结构完整性优于直接从琼脂平板上取材的培养物。与临界点干燥相比，使用六甲基二硅胺烷（HMDS）对胚胎进行化学干燥可在无表面张力假象的情况下完成干燥过程；HMDS可防止样品在干燥过程中因收缩而开裂，因为其使样品在干燥时脆性降低。然而，对于真菌培养物，临界点干燥相较于化学干燥可提供可接受的图像质量。卵壳在成像前无需特殊制备步骤，仅需在安装前彻底清洗并空气干燥即可。各种制备方法的标准化依据是每次试验所获得的图像质量是否可接受。 

引言

扫描电子显微镜（SEM）超微结构分析和细胞内成像可补充光学显微镜技术，用于对原核生物、植物和动物进行三维形态学表征。SEM具有高空间分辨率，是目前可用于在纳米至微米尺度上研究样品微观结构特征的最通用且强大的技术之一。干燥后的样品可呈现出高度精细的成分与形貌结构，为建立功能关系的合理结论提供依据^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}。在解读生物样品的SEM图像时，一个重大挑战是区分天然结构与制样过程中产生的假象。SEM通常在极高真空条件下运行，以避免气体分子对样品发射的初级电子、次级电子或背散射电子束造成干扰^10,11。此外，由于生物材料导电性差或不导电，容易受到辐射损伤。为防止在高真空环境中发生放气现象，进入SEM的样品必须完全干燥且不含任何有机污染物^10,11。由于生物样品主要由水组成，因此需要采用额外的制备技术，以确保其天然结构得以保留。

所获得的分辨率取决于针对特定样本类型和所用仪器参数优化的制备方法。因此，必须避免对所有组织类型采用通用的处理步骤。某些生物样本需要较温和的处理以保持其结构，而对于较脆弱的样本类型，则可能需要更多时间和细致操作，以避免产生干燥伪影，例如收缩和塌陷。样品制备是扫描电镜（SEM）成像中的关键步骤，形态计量学研究的结果会显著受到样品制备流程的影响^12,13。许多生物样本常见的制备步骤包括固定、脱水以及用金、铂或钯等金属镀膜，以使样品表面具备导电性，适用于SEM分析。所采用步骤的种类和组合方式将根据组织类型及研究的具体目标而有所不同。在处理柔软且脆弱的生物样本时，电荷积聚、对真空环境的敏感性以及电子束损伤会带来挑战，因此需要额外的处理步骤以维持样品的天然结构。传统的处理方法，如四氧化锇固定和脱水，会导致脆弱组织发生收缩和塌陷^14,15,16,17。本研究的目标是通过整合前期研究的思想并加以改进，建立优雅而有效的技术方法，用于制备和成像柔软且脆弱的组织（例如爬行动物胚胎、彩龟蛋壳以及真菌培养物）。

选择合适的固定方法是进行生物样本显微分析的第一步，也是最重要的一步。在从生物体分离后立即对组织进行固定，对于防止其因分解而导致形态学改变至关重要。一种有效的固定剂应能快速渗透细胞，不可逆地终止细胞内的生理过程，从而稳定样本结构，使其能够耐受后续处理步骤以及扫描电镜（SEM）下的观察^17,18。尽管已知有多种化学和物理固定方法，但化学固定在生物样本中更为常用，以避免自溶、腐败和干燥效应引起的细胞变化。文献中报道了多种化学固定剂配方^{17,19,20,21,22,23}，其中一些通过使生物大分子变性并凝固来实现固定，另一些则通过共价交联大分子实现固定。醇类作为变性固定剂，对超微结构的保存效果较差，主要用于光学显微镜观察，不推荐用于电子显微镜分析。甲醛、戊二醛和四氧化锇等交联型固定剂可在组织内大分子之间形成分子间和分子内交联，从而实现对超微结构的优良保存^11,24,25,26。生物样本对温度敏感。建议固定起始温度为4 °C，以降低膜蛋白的侧向流动性，减缓细胞内分子的扩散，并降低固定反应速率¹¹。组织固定的所需时间主要取决于样本大小以及固定剂向组织内部扩散和反应的速度。在4 °C条件下，使用4%多聚甲醛或3%戊二醛在磷酸盐缓冲液（PBS）中过夜固定，是本研究中用于扫描电镜分析样本的首选方法，因其具有良好的逐步渗透特性，适用于较小且精细的样本处理^{17,18,19,20,27}。本研究中未采用四氧化锇进行后固定，不仅因其具有毒性，而且发现其对所分析样本的图像质量提升并无额外优势。

生物样品含有会干扰扫描电镜（SEM）运行的液体，因此在将样品置入SEM样品室之前需要进行干燥处理。一旦完成脱水，必须在不因表面张力或干燥过程对样品造成假象的前提下，将组织中的溶剂去除。在用于SEM成像的组织处理过程中，通常采用三种不同的干燥方法：空气干燥、临界点干燥和冷冻干燥^28,29,30,31。一些研究报道，这三种干燥方法在动物组织样品上可产生相同的结果^28,29,30,31。对于较小的样品，常规做法是采用梯度浓度酒精结合六甲基二硅氮烷（HMDS）进行化学脱水；而对于较大的样品，则使用临界点干燥仪（CPD）进行干燥³²。在干燥过程中，液体/气体界面会在样品内部的小腔隙中产生显著的作用力，并将这些力传递至整个样品，甚至可能导致中空结构完全塌陷³³。任何因处理过程引起的形变都可能被误判为样品本身的固有结构特征。因此，应避免采用通用的处理流程，尤其在分析精细组织样品时，应针对每种类型的组织建立并标准化独特的干燥程序。

在采用上述各种方法组合进行的多次试验中，我们标准化了可用于三种精细组织的扫描电镜（SEM）分析的方法：爬行动物胚胎、彩龟蛋壳以及真菌培养物。发育生物学家和形态学家描述代表性脊椎动物胚胎发育过程中的正常与异常形态发生。基因信号通路的研究依赖于对新结构的形态学描述。为避免在SEM分析过程中脊椎动物胚胎结构发生突变，我们推荐在脱水后采用化学干燥法。使用六甲基二硅烷（HMDS）进行化学干燥是相对较新的干燥方法，其优点包括操作相对快速、简便、成本低，且对专业技术和设备要求有限⁹。临界点干燥（CPD）是一种常用的干燥技术，通过在特定温度和压力下使CO₂流经样品实现干燥。我们发现，HMDS适用于柔软精细组织的干燥，并可处理比临界点干燥更大的样品；后者会导致胚胎组织严重变形。已有多种方法用于制备真菌形态特征研究的SEM样品³⁴。真菌样本通常用四氧化锇固定，随后进行乙醇脱水和临界点干燥，尽管这种方法可能获得较满意的结果，但四氧化锇具有毒性^6,7,35，且在处理过程中更换溶液时易造成真菌材料丢失，是明显的缺点。也有采用不经固定直接空气干燥的样品制备方法³⁶，但会导致结构皱缩和塌陷，观察此类样本时容易在物种鉴定中产生误判。真菌菌丝在接触液体时会失去完整性，难以实现均匀干燥以恢复原有结构。由于这一影响，冷冻干燥通常被用于如真菌菌丝体等软组织的干燥。冷冻干燥对洁净材料效果良好，但若存在盐类或分泌物，则会遮蔽表面细节，这些问题往往直到SEM观察阶段才会被发现。我们将载片培养法与戊二醛固定结合临界点干燥，成功获得了完整真菌菌丝和孢子的结构细节。尽管临界点干燥会导致胚胎收缩，但与戊二醛固定联用时，能很好地保存菌丝结构。对于卵生动物的胚胎而言，蛋壳至关重要，不仅起到保护作用，还提供机械稳定性、气体和水分通透性，并为发育中的胚胎提供钙储备。根据其结构特征，淡水龟类的蛋壳被归类为"刚性"蛋壳，因其易于获取，已受到生物学家的广泛关注^{1,2,3,4,5,6,7,37,38}。

我们详细介绍了便于检查彩龟蛋壳及壳膜的简单方法，这些方法可应用于任何硬壳蛋物种。制备方法的评估依据是所得图像的质量以及潜在伪影的减少程度。 

方案

注意：本研究中使用的彩龟（Chrysemys picta）卵是在2015至2016年5月至6月的产卵季节，经纽约州环境保护部（DEC）许可后，从纽约州奥斯威戈的赖斯溪田野站采集的。

1. 用于扫描电镜样品制备的胚胎化学干燥法

1. 在繁殖季节从野外采集龟卵。提前准备好由带盖塑料盒（长×宽×高）6.7 cm × 25.4 cm × 10.2 cm 制成的孵化容器，盒内填充由蛭石和泥炭藓（1:1 比例）混合并加水湿润的基质。在盒子侧面和盖子上打 4–6 个直径约 0.25 cm 的小孔，以保证通气。
2. 轻轻移除巢穴中的土壤以暴露龟卵。用稀释的碘酊（1:25,000）擦拭龟卵表面，以控制孵化期间的微生物污染。将每窝卵彼此分开放置，彩龟每窝产卵数量通常为 5–9 枚，每个盒子最多放置 8–9 枚卵。
   注意：在采集、擦拭、标记及放入盒子的过程中需小心操作卵。卵的方位和朝向必须保持其自然产出时的状态，任何移动都会抑制胚胎发育。
3. 手动将卵半埋入基质中，盖上盖子后将盒子置于设定为 30 °C 的培养箱中。分别孵化 10–17 天，以获得本研究中所用的胚胎发育阶段 12、13 和 18。每隔一天添加蒸馏水以部分润湿基质，防止脱水，并维持胚胎正常发育所需的湿度。
   注意：孵化与胚胎分期依据先前发表的完整发育表³⁹进行。
4. 使用尖头剪刀沿背侧蛋壳和卵黄膜的一侧做第一道切口，切口方向垂直于长轴。小心将剪刀插入卵黄，避免切断胚胎盘。接着沿长轴切开蛋的侧面，再沿短轴切开另一侧。
5. 用镊子将带有胚胎的一侧向上剥开。切开另一侧的蛋壳，将剥离的部分放入磷酸盐缓冲液（PBS ，pH 7.4）中。
   注意：龟卵内充满高度黏稠的卵黄，胚胎背侧附着于蛋壳膜上。随着孵化进行，靠近胚胎区域的蛋壳膜由半透明白色变为不透明的 chalky white（ chalky white 为专业描述性术语，保留原文）。这使得胚胎位于长轴中心的位置可通过外部观察到一个深色钙化斑点而被定位^40,41。
6. 使用体视显微镜，用镊子将胚胎连同卵黄膜从蛋壳上剥离以分离胚胎。用镊子和显微剪去除胚外膜。使用胚胎勺将胚胎转移至盛有新鲜 PBS 的培养皿中，清洗残留的血液或卵黄。
7. 将胚胎置于透明的 12 孔板中，在 PBS 中含 4% 多聚甲醛或 2–3% 戊二醛的固定液中于 4 °C 过夜固定。根据胚胎大小，每孔放置 1–3 个胚胎。对于较晚期的胚胎，需延长固定时间至 2–3 天，以确保完全渗透（样品呈现白色）。用新鲜 PBS 漂洗胚胎 3 次，每次 5 分钟。
   注意：为避免损伤胚胎表面，在将样本从一种溶剂转移至另一种时，建议使用底部为聚酯网的聚苯乙烯插件配合 12 孔板使用。
8. 使用一系列浓度的乙醇（以蒸馏水配制）进行脱水处理：30%、50%、70%、80%、95% 和 100%，每种脱水液处理 1 小时。用 100% 乙醇重复处理两次，以确保完全脱水。若不立即使用，可将样本长期保存于 -20 °C 的 70% 乙醇中。
9. 使用六甲基二硅氮烷（HMDS）与 100% 乙醇的梯度溶液进行干燥处理：1:2、2:1 和 100%。每种溶液中放置 20 分钟，过程中将培养皿部分覆盖。
   注意：所有涉及 HMDS 的操作均须在通风橱中进行，并佩戴必要的个人防护装备，因为 HMDS 具有高毒性。
10. 将胚胎留在最终的 100% HMDS 溶液中，完全或部分覆盖后置于通风橱中过夜，以促进 HMDS 蒸发，使样本达到可直接用于载台和溅射镀膜的状态。盖上培养皿以防止灰尘沉降。
    注意：完全干燥后的组织呈白色，部分干燥的组织呈黄色，此类组织应继续在通风橱中放置更长时间。
11. 根据所分析样本的大小选择合适尺寸的铝制载台和碳导电胶带。使用双面碳导电胶带（12 mm）将干燥样本小心地固定在标准铝制针式载台（12.7 mm × 8 mm）上。
12. 将已装载样本的载台放入溅射镀膜仪腔室中，镀上一层极薄的金膜以消除电荷效应。在 35 mA 溅射电流下镀金 60–120 秒。
13. 通过紧固螺钉将载台固定到相应的孔板上。使用样品交换工具将样品台移入或移出扫描电镜（SEM）的样品室。在高真空模式下，以 10 kV 加速电压和 10 µA 发射电流对样本进行成像。
    注意：在操作样本、样品台、载台及转移工具时，务必佩戴手套，以避免手部油脂污染 SEM 系统。
14. 测试以下替代技术，以比较由上述步骤获得样本的分辨率。
    1. 在步骤 1.7 之后增加一步后固定处理：室温下使用 1% 四氧化锇固定 1 小时。
    2. 在步骤 1.10 中部分或完全去除 HMDS，以加快 HMDS 的快速蒸发。
    3. 在完成步骤 1.8 后，采用临界点干燥（CPD）方法，继续执行步骤 3.3–3.4。

2. 采用空气干燥法准备用于扫描电镜的蛋壳样品

1. 收集并孵育彩龟（Chrysemys picta）的卵，按照步骤1.1–1.7中的要求固定胚胎。
2. 在步骤2.1完成胚胎固定后，将蛋壳保存于蒸馏水中。将蛋壳浸泡在蒸馏水中至少1小时，彻底清洗，以去除卵黄和蛋清污染。
3. 清洗后的蛋壳置于通风橱内，用精密防静电擦拭纸过夜自然晾干。将干燥的蛋壳存放于洁净的标本瓶中，并按编号和发育阶段标记。
4. 按照步骤1.11–1.13中的规定，对样品进行安装、溅射镀膜和成像。

3. 用于扫描电镜样品制备的真菌培养物临界点干燥法

1. 建立载片培养
   1. 制备真菌培养用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：在锥形瓶中将39 g PDA粉末加入1 L蒸馏水中，通过旋转摇动充分混匀，于121 °C高压灭菌30 min。待培养基冷却后，使用无菌微量移液器加入抗生素氯霉素（25 µg/mL）。
      注意：灭菌后琼脂溶液应保持高温，不会立即凝固。需适当冷却至不会使抗生素失活的温度。
   2. 轻轻旋转混匀，倾注平板（每个10 cm培养皿约加入10–12 mL培养基），小心叠放并使其凝固。
   3. 使用无菌解剖刀片切取约½至¾英寸见方的小块琼脂，取出后置于洁净的玻璃载玻片上。
   4. 将载玻片放入洁净的培养皿中，以防止污染并在培养期间保持湿度。
   5. 用无菌牙签将载玻片垫高，使其脱离培养皿底部，从而在培养皿与载玻片之间形成表面张力，以便在培养后取出载玻片时不破坏脆弱的菌体生长结构。
   6. 使用无菌接种环或接种针，从待测样品接种物中取少量真菌，分别接种到载玻片上琼脂块的四个侧面。
   7. 接种后，在琼脂块表面覆盖一片洁净的盖玻片。在培养皿内载玻片周围滴加数滴无菌蒸馏水，以保证真菌生长所需的湿度。
   8. 用封口膜部分密封培养皿，并在30 ˚C下培养适当时间（如Fusarium属真菌培养36至48小时）。
   9. 从培养皿中取出载玻片，用无菌镊子小心分离紧贴在琼脂块上的盖玻片。将琼脂块在含3%戊二醛的PBS溶液中4 ˚C固定过夜。
2. 通过乙醇梯度系列进行样品脱水：依次使用10%、25%、50%、75%和90%乙醇，每次更换浓度后处理15分钟。最后用100%乙醇更换两次，每次30分钟，以确保完全脱水饱和。
3. 临界点干燥：将脱水后的样品放入临界点干燥仪（CPD）样品室中。打开阀门，通入液态CO₂并排出乙醇，使液态CO₂完全充满样品室，同时密封并冷却样品室。
   1. 密封样品室后缓慢加热，当压力超过1000 psi且温度超过31 °C时，达到临界点，此时CO₂的液相与气相处于平衡状态。随后缓慢释放样品室中的CO₂，使其以气体形式排出，避免表面张力对样品造成影响。
4. 按照步骤1.11–1.13所述方法进行样品制片、镀金及成像操作。
5. 采用六甲基二硅胺烷（HMDS）对步骤3.2中的样品进行化学干燥，并按照步骤1.9–1.13进行后续处理，完成对比分析。

结果

图1 显示了彩龟（Chrysemys picta）胚胎的扫描电镜分析结果。采集彩龟卵后，在培养基上孵化，经化学干燥处理后固定于铝 stub 上用于 SEM 成像（图1A-E）。12期胚胎的侧面观展示了颅面部结构；上颌突延伸超过下颌突，并在内侧限定出明显的鼻窝；还可观察到五个咽弓（图1F）。胚胎尾部后端新形成的体节相较于躯干部已分节的体节更易于计数。前肢芽比后肢芽更长，且朝向尾侧而非腹侧延伸。在15期胚胎的整个肢间侧区可见明确发育的背甲脊突起（图1G）。至18期，彩龟具有短而微弱突出的吻部。下喙位于上颌内，略向上翘，末端具钩状结构，恰好嵌入上喙中央的凹槽中（图1H）。彩龟的上颌呈现凹陷外形，远...

讨论

在本研究中，我们测试了不同的固定剂、脱水和干燥方法，以制备三种用于扫描电镜（SEM）成像的精细生物样品：胚胎、蛋壳和真菌培养物。SEM通常用于表面分析，因此固定剂的渗透性相对不那么关键，但必须认识到，固定不良的内部结构会导致向内收缩和/或表面结构塌陷。对于较大的组织样品，应考虑延长固定时间，并根据固定时长多次更换固定液。由于固定剂与组织之间存在活跃的相互作用，细胞的渗透特性会发生显著变化。组织液会稀释固定剂，因此就对细胞体积的影响而言，醛类对整体渗透压的贡献可以忽略不计。此外，甲醛比戊二醛更易快速渗透入组织，且作为交联剂更为有效。已有文献报道，使用缓冲的甲醛-戊二醛混合液可固定多种类型的组织，但对于单层细胞和细胞悬液，稀释后的溶液更适用于固定^15,16。然而，这些稀释溶液也是高渗的，因此醛类本身并不具有渗透活性。对于本研究中使用的精细样品，采用pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）作为固定剂的溶剂，因为磷酸盐缓冲液被认为更接近大多数生物样品的细胞质环境。此外，PBS作为固定剂的载体时，其渗透压处于样品所需的生理范围内。尽管...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Fischer Scientific	S25127A	用于载片培养
铝制针座	Tedpella	16111	12.7 mm x 8 mm
BD Difco 脱水培养基：马铃薯葡萄糖琼脂	BD 213400	DF0013-17-6	用于真菌、酵母和霉菌的分离与培养
氯霉素	Fischer BioReagents	BP904-100	培养基用抗生素
粗蛭石	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	垫料基质
透明12孔板	Corning	07-201-589	用于固定胚胎
盖玻片	Fischer Scientific	S17525B	用于载片培养
临界点干燥仪	Quorum CPD	EMS850	临界点干燥
培养皿	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
乙醇	Fischer Scientific	A406P 4	脱水剂
镊子 - Aquarius 镊子	Tedpella	5804	4号型，长度108 mm，宽度×厚度 0.017 × 0.17 mm
戊二醛	Fischer Scientific	G151-1	固定剂
溅射镀膜用金靶材	DENTON VACUUM	TAR001-0158	金靶，2.375″ D X .002″
六甲基二硅氮烷	Fischer Scientific	C19479-5000	化学干燥剂
Kim擦拭纸	Kimtech	S-8115	清洁用途
显微镜载玻片	Thermo Scientific	67-762-16	用于载片培养
显微解剖剪	Tedpella	1327	双头，不锈钢，100 mm 长（3-5/8"）
显微剪刀	Tedpella	1346	Vannas型，直头，80 mm 长
Moria穿孔胚胎勺	Fine Science Tools	10370-17	长度14.5 cm，勺头直径20 mm，勺深5 mm
Netwell嵌插装置	Corning	0330B09	15 mm嵌插件，带74 µm孔径的聚酯膜，可在样品处理过程中转移至不同溶剂时作为便捷载体
多聚甲醛	Fischer Scientific	T353 500	固定剂
泥炭藓	Walmart- Miracle Gro	551705263	垫料基质
PELCO双面导电碳胶带	Tedpella	5000	外径12 mm
溅射镀膜仪	DENTON VACUUM	DESK V	用于制备薄金属涂层
扫描电镜（SEM）	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	电子显微镜技术