胚胎、卵壳及真菌培养物的扫描电子显微镜制样

摘要

本文介绍了利用扫描电子显微镜（SEM）成像精细组织样本的详细处理方案。针对坚硬的蛋壳、早期发育阶段的胚胎以及真菌培养物，分别描述了三种不同的处理方法：六甲基二硅氮烷（HMDS）化学干燥法、简单的空气干燥法和临界点干燥法。

摘要

尽管扫描电子显微镜（SEM）已广泛用于各种生物和非生物样品的超微结构分析，但不同生物样品的处理方法涉及各自独特的操作流程。文献中描述的所有常规样品处理方法目前仍具有实用价值，但样品制备过程中的细微变化可能影响图像质量，并引入假象。因此，必须根据所分析组织类型的特性采用特定的样品制备技术，才能获得具有超微结构分辨率的高质量图像。本研究的重点是为利用SEM成像胚胎、坚硬的卵壳以及真菌培养物提供最优的样品制备方案。针对所研究的三种不同且敏感的生物样品，推荐以下优化措施：必须使用较温和的固定剂（如4%多聚甲醛或3%戊二醛），随后采用乙醇梯度进行脱水。通过载片培养法获得的琼脂块上的真菌菌丝体，其超微结构完整性优于直接从琼脂平板上取材的培养物。与临界点干燥相比，使用六甲基二硅胺烷（HMDS）对胚胎进行化学干燥可在无表面张力假象的情况下完成干燥过程；HMDS可防止样品在干燥过程中因收缩而开裂，因为其使样品在干燥时脆性降低。然而，对于真菌培养物，临界点干燥相较于化学干燥可提供可接受的图像质量。卵壳在成像前无需特殊制备步骤，仅需在安装前彻底清洗并空气干燥即可。各种制备方法的标准化依据是每次试验所获得的图像质量是否可接受。 

引言

扫描电子显微镜（SEM）超微结构分析和细胞内成像可补充光学显微镜技术，用于对原核生物、植物和动物进行三维形态学表征。SEM具有高空间分辨率，是目前可用于在纳米至微米尺度上研究样品微观结构特征的最通用且强大的技术之一。干燥后的样品可呈现出高度精细的成分与形貌结构，为建立功能关系的合理结论提供依据^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}。在解读生物样品的SEM图像时，一个重大挑战是区分天然结构与制样过程中产生的假象。SEM通常在极高真空条件下运行，以避免气体分子对样品发射的初级电子、次级电子或背散射电子束造成干扰^10,11。此外，由于生物材料导电性差或不导电，容易受到辐射损伤。为防止在高真空环境中发生放气现象，进入SEM的样品必....

方案

注意：本研究中使用的彩龟（Chrysemys picta）卵是在2015至2016年5月至6月的产卵季节，经纽约州环境保护部（DEC）许可后，从纽约州奥斯威戈的赖斯溪田野站采集的。

1. 用于扫描电镜样品制备的胚胎化学干燥法

1. 在繁殖季节从野外采集龟卵。提前准备好由带盖塑料盒（长×宽×高）6.7 cm × 25.4 cm × 10.2 cm 制成的孵化容器，盒内填充由蛭石和泥炭藓（1:1 比例）混合并加水湿润的基质。在盒子侧面和盖子上打 4–6 个直径约 0.25 cm 的小孔，以保证通气。
2. 轻轻移除巢穴中的土壤以暴露龟卵。用稀释的碘酊（1:25,000）擦拭龟卵表面，以控制孵化期间的微生物污染。将每窝卵彼此分开放置，彩龟每窝产卵数量通常为 5–9 枚，每个盒子最多放置 8–9 枚卵。
   注意：在采集、擦拭、标记及放入盒子的过程中需小心操作卵。卵的方位和朝向必须保持其自然产出时的状态，任何移动都会抑制胚胎发育。
3. 手动将卵半埋入基质中，盖上盖子后将盒子置于设定为 30 °C 的培养箱中。分别孵化 10–17 天，以获得本研究中所用的胚胎发育阶段 12、13 和 18。每隔一天添加蒸馏水以部分润湿基质，防止脱水，并维持胚胎正常发育所需的湿度。
   注意：孵化与胚胎分期依据先前发表的完整发育表³⁹进行。
4. 使用尖头剪....

结果

图1 展示红耳龟（painted turtle）的扫描电镜分析彩龟（Chrysemys picta） 胚胎。采集并置于铺垫介质上孵化的彩龟卵，经化学干燥后固定于铝 stub 上，用于扫描电镜成像（图1A-E）。12期胚胎的侧面观显示颅面部结构；上颌突延伸超过下颌突，并在内侧围成明显的鼻凹；同时还可观察到五个咽弓。图1F）。与已分节的体节相比，胚胎尾部后端新形成的体节更容易计数。前肢芽比后肢芽更长，且朝向尾侧而非腹侧突出。在15期胚胎的整个四肢之间的侧腹区域，可见明显发育的甲壳脊突起。图1G在18期，彩龟具有一个短而微弱突出的吻部。下喙位于上颌内，略向上翘，末端具钩状结构，恰好嵌入上喙中央的切迹中图1H

讨论

在本研究中，我们测试了不同的固定剂、脱水和干燥方法，以制备三种用于扫描电镜（SEM）成像的精细生物样品：胚胎、蛋壳和真菌培养物。SEM通常用于表面分析，因此固定剂的渗透性相对不那么关键，但必须认识到，固定不良的内部结构会导致向内收缩和/或表面结构塌陷。对于较大的组织样品，应考虑延长固定时间，并根据固定时长多次更换固定液。由于固定剂与组织之间存在活跃的相互作用，细胞的渗透特性会发生显著变化。组织液会稀释固定剂，因此就对细胞体积的影响而言，醛类对整体渗透压的贡献可以忽略不计。此外，甲醛比戊二醛更易快速渗透入组织，且作为交联剂更为有效。已有文献报道，使用缓冲的甲醛-戊二醛混合液可固定多种类型的组织，但对于单层细胞和细胞悬液，稀释后的溶液更适用于固定^15,16。然而，这些稀释溶液也是高渗的，因此醛类本身并不具有渗透活性。对于本研究中使用的精细样品，采用pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）作为固定剂的溶剂，因为磷酸盐缓冲液被认为更接近大多数生物样品的细胞质环境。此外，PBS作为固定剂的载体时，其渗透压处于样品所需的生理范围内。尽管.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Fischer Scientific	S25127A	用于载片培养
铝制针座	Tedpella	16111	12.7 mm x 8 mm
BD Difco 脱水培养基：马铃薯葡萄糖琼脂	BD 213400	DF0013-17-6	用于真菌、酵母和霉菌的分离与培养
氯霉素	Fischer BioReagents	BP904-100	培养基用抗生素
粗蛭石	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	垫料基质
透明12孔板	Corning	07-201-589	用于固定胚胎
盖玻片	Fischer Scientific	S17525B	用于载片培养
临界点干燥仪	Quorum CPD	EMS850	临界点干燥
培养皿	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
乙醇	Fischer Scientific	A406P 4	脱水剂
镊子 - Aquarius 镊子	Tedpella	5804	4号型，长度108 mm，宽度×厚度 0.017 × 0.17 mm
戊二醛	Fischer Scientific	G151-1	固定剂
溅射镀膜用金靶材	DENTON VACUUM	TAR001-0158	金靶，2.375″ D X .002″
六甲基二硅氮烷	Fischer Scientific	C19479-5000	化学干燥剂
Kim擦拭纸	Kimtech	S-8115	清洁用途
显微镜载玻片	Thermo Scientific	67-762-16	用于载片培养
显微解剖剪	Tedpella	1327	双头，不锈钢，100 mm 长（3-5/8"）
显微剪刀	Tedpella	1346	Vannas型，直头，80 mm 长
Moria穿孔胚胎勺	Fine Science Tools	10370-17	长度14.5 cm，勺头直径20 mm，勺深5 mm
Netwell嵌插装置	Corning	0330B09	15 mm嵌插件，带74 µm孔径的聚酯膜，可在样品处理过程中转移至不同溶剂时作为便捷载体
多聚甲醛	Fischer Scientific	T353 500	固定剂
泥炭藓	Walmart- Miracle Gro	551705263	垫料基质
PELCO双面导电碳胶带	Tedpella	5000	外径12 mm
溅射镀膜仪	DENTON VACUUM	DESK V	用于制备薄金属涂层
扫描电镜（SEM）	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	电子显微镜技术