本文介绍一种机械解离方案，用于快速从背根神经节中分离巨噬细胞，以进行表型鉴定和功能分析。
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本文内容
摘要
摘要
随着周围神经损伤后背根神经节中免疫细胞与感觉神经元之间分子和细胞相互作用的研究日益受到关注，人们对这类相互作用的兴趣不断增长。已知外周单核细胞（包括巨噬细胞）会通过吞噬作用、抗原呈递和细胞因子释放等方式对组织损伤作出反应。越来越多的证据表明，在神经损伤背景下，背根神经节中的巨噬细胞参与了神经病理性疼痛的发生以及轴突修复过程。为了鉴定尚未明确的神经免疫因子，亟需快速表征（或“快速分离”）神经损伤情况下背根神经节巨噬细胞的反应状态。本文介绍了我们实验室如何采用无酶机械解离方法，快速高效地从背根神经节中分离巨噬细胞。整个操作过程中样品始终保持在冰上，以最大限度减少细胞应激。与传统的酶解法相比，该方法耗时显著缩短，且已被常规应用于我们的荧光激活细胞分选分析。
引言
现有大量证据表明，免疫细胞在周围神经损伤后引发的神经病理性疼痛中起重要作用1,2。外周单核细胞（包括成熟巨噬细胞）已知可通过吞噬作用、抗原呈递和细胞因子释放来响应组织损伤和系统性感染。与神经损伤诱导的脊髓背角小胶质细胞活化类似，背根神经节（DRG）中的巨噬细胞在神经损伤后也会显著扩增3,4。值得注意的是，目前越来越多的研究关注巨噬细胞是否通过与DRG中的感觉神经元相互作用，参与周围神经损伤后神经病理性疼痛的发生发展5,6,7,8,9,10,11。此外，最近的研究还提示DRG巨噬细胞在神经损伤后的轴突修复过程中亦发挥作用12,13。另一项研究进一步表明，巨噬细胞亚群（即CD11b+Ly6Chi和CD11b+Ly6Clow/-细胞）在机械性超敏反应中可能发挥不同作用14。因此，快速表征神经损伤背景下DRG巨噬细胞的反应，可能有助于我们识别参与神经病理性疼痛的神经免疫因子。
传统上，分离背根神经节（DRG）中巨噬细胞的方案包括酶消化等多个步骤15,16。该技术通常耗时较长，且在大规模实验中成本较高。尽管先前有研究建议使用胶原酶II型（4 mg/mL）和分散酶II型（4.7 mg/mL）进行20分钟的温和消化15，但可以预见的是，细胞在接触该酶后容易发生损伤或死亡，可能导致得率较低。此外，酶制剂在不同批次之间的质量差异可能进一步影响该过程的效率。更重要的是，经过酶消化处理的巨噬细胞可能被非预期地激活，从而与体内真实状态存在显著差异。这些变化可能使功能研究的结果变得复杂。
本文介绍一种无需酶解的快速分离背根神经节（DRG）巨噬细胞的方案，该方法在4 °C条件下通过机械解离完成。样品全程置于冰上以最大限度减少细胞应激。因此，该方法有助于保持分离过程的一致性，所获得的细胞可能更健康且活化程度更低。我们进一步提供了通过荧光激活细胞分选（FACS）分析验证分离细胞质量的证据。
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方案
所有动物实验均经加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。
1. 采集实验小鼠的腰段背根神经节
- 实验开始前，通过将9体积的密度梯度介质（如Percoll）与1体积的Ca++/毫克++无10x HBSS。置于冰上。
- 用2.5%阿佛丁麻醉小鼠。通过轻捏后肢足垫无反应确认动物已完全麻醉。
注意使用6至8周龄的雄性和雌性小鼠。 - 通过心脏灌注，将10 mL预冷的1×PBS注入小鼠体内。
- 将小鼠仰卧位固定于通风橱内，用胶带固定四肢。用镊子提起肋骨下方的皮肤，用手术剪做一小切口，暴露肝脏和膈肌。
- 继续使用剪刀剪开膈肌和肋骨笼，打开胸膜腔以暴露跳动的心脏。
- 用虹膜剪迅速剪开右心耳。观察到出血后，将30 G针头插入左心室后端，缓慢注入10 mL预冷的1×PBS，以灌注动物。
- 进行背侧椎板切除术15 在俯卧位的小鼠上。
注意：如果计划进行细胞培养，应在切开前用70%乙醇喷洒小鼠，并使用预先灭菌的手术器械进行解剖。- 使用11号手术刀，从胸区开始沿侧方纵向做一深部切口，一直延伸至骶区。用剪刀去除皮肤，以暴露背侧肌肉层。
- 使用Friedman-Pearson咬骨钳剥离结缔组织和肌肉，直至暴露腰骶椎棘突及双侧横突。
- 使用 Noyes 弹簧剪小心打开背部脊柱，然后换用 Friedman-Pearson 咬骨钳去除椎骨，以暴露带有完整附着脊神经的脊髓。
- 仔细分离同侧和对侧腰段背根神经节（本研究中为 L4/L5 背根神经节），并将其置于 1 mL 冰冷的 Ca++/毫克++在Dounce组织研磨器中用无钙镁1×HBSS悬浮组织。现在组织已准备好进行步骤2。
注意：如果可能，剪除与背根神经节相连的脊神经。
2. 从小鼠腰段背根神经节中分离单个细胞
- 使用Dounce匀浆器中的松散研杵匀浆DRG组织 20-25 次。
- 将无菌的70 μm尼龙细胞筛置于无菌的50 mL锥形管上，用800 μL预冷的1x HBSS润湿细胞筛，滤过液收集于锥形管中。
- 用移液器从匀浆器中吸取匀浆后的组织悬液，经湿润的70 μm尼龙细胞滤网过滤，收集至50 mL锥形管中。
- 用800 μL预冷的1x HBSS冲洗匀浆器两次，然后将冲洗液倒入同一支含有细胞筛的50 mL锥形管中，以提高得率。
- 向无菌的5 mL聚苯乙烯FACS管中加入1.5 mL已平衡的冰冻等渗密度梯度介质（按步骤1.1制备）。
- 将步骤2.4中的50 mL锥形管内的细胞匀浆转移至FACS管中，通过吹打充分与密度梯度介质混合。再加入500 μL 1×HBSS以封闭上层。
- 通过800 × g离心沉淀细胞 x g 4 °C 下孵育 20 分钟。
- 小心吸去FACS管底部细胞沉淀上方含有髓鞘的上清液，避免扰动管底的细胞沉淀。
- 用含5%胎牛血清（FBS）的PBS或FACS缓冲液重悬细胞，用于FACS分析。
注：从小鼠L4/L5背根神经节预计可获得至少50,000至100,000个细胞。- 将机械分离的DRG细胞（L4/L5）重悬于100 μL含5%胎牛血清的PBS中，然后加入α-小鼠CX3CR1-APC抗体（1:2,000），4 °C避光孵育1小时。
- 用 5 mL PBS 洗涤细胞一次；以 360 x g 离心细胞 g 4 °C下离心8分钟。
- 吸弃上清液，然后将细胞沉淀重悬于300 μL PBS中用于FCAS分析。若计划进行细胞分选，则将细胞重悬于FACS缓冲液中。
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结果
为了验证分离得到的细胞，我们首先选用了表达巨噬细胞Fas诱导凋亡（Macrophage Fas-Induced Apoptosis, MAFIA）的转基因小鼠17。该品系小鼠在集落刺激因子1受体（CSF1R）启动子的调控下，特异性地在巨噬细胞和小胶质细胞中表达一种药物可诱导的FK506结合蛋白（FKBP）-Fas自杀融合基因以及增强型绿色荧光蛋白（eGFP）。通过全身注射FK结合蛋白二聚化诱导剂AP20187（AP），可诱导表达该转基因的细胞发生凋亡。eGFP的表达也使我们能够监测背根神经节（DRG）中的巨噬细胞。为了在MAFIA小鼠中耗竭巨噬细胞，我们进行了连续3天、每日一次的腹腔注射AP（1 mg/kg）。末次注射后，将DRG切片并进行GFP免疫荧光染色。与溶剂对照（VEH）处理的小鼠相比，AP处理小鼠的DRG中GFP+细胞数量显著减少（图1A-B）。在另一项独立实验中，我们采用该方案处理后对DRG巨噬细胞进行机械性分离。随后的流式细胞术分析显示，AP处理小鼠中GFP
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讨论
本文介绍了一种有效富集小鼠背根神经节（DRG）中分离巨噬细胞的新方法。传统分离DRG免疫细胞的方法需要进行酶消化15,18，而本方案采用机械匀浆替代酶消化，以减少非预期的细胞损伤并提高细胞得率。因此，新方案耗时显著缩短。更重要的是，酶消化可能激活巨噬细胞并改变其分子特征；相比之下，我们的机械法可极大程度地降低细胞应激反应。
通过FACS分析，我们进一步表征了分离的DRG细胞中的巨噬细胞，并证明了较高的细胞回收率。在本方案下，分离得到的DRG细胞中超过80%具有活性（图2D）。从小鼠L4/L5节段DRG中预期可获得至少50,000至100,000个细胞。因此，我们可以有把握地得出结论：DRG细胞可进一步分选为巨噬细胞亚群14，用于后续培养或RNA提取。然而，有几个关键步骤可能影响细胞得率。若发现细胞产量不理想，应怀疑步骤2.1中组织匀浆程度不足或过度。可通过碘化...
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披露
作者声明本稿件不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由以下机构资助：麻醉教育与研究基金会（XY）；加州大学旧金山分校麻醉与围手术期护理系（XY）；以及1R01NS100801-01（GZ）。本研究部分由HDFCCC细胞分析实验室共享资源中心通过美国国立卫生研究院资助（P30CA082103）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-小鼠 CX3CR1-APC 抗体 | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| 细胞滤筛（70 mm 尼龙） | Falcon | 352350 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce 组织匀浆器 | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS 管（5ml） | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson 骨钳 | FST | 16121-14 | |
| HBSS（10 倍浓度，无 Ca++/Mg++） | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes 弹簧剪 | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4864-10ml |
参考文献
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