本文介绍一种机械解离方案，用于快速从背根神经节中分离巨噬细胞，以进行表型鉴定和功能分析。
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本文内容
摘要
摘要
随着周围神经损伤后背根神经节中免疫细胞与感觉神经元之间分子和细胞相互作用的研究日益受到关注，人们对这类相互作用的兴趣不断增长。已知外周单核细胞（包括巨噬细胞）会通过吞噬作用、抗原呈递和细胞因子释放等方式对组织损伤作出反应。越来越多的证据表明，在神经损伤背景下，背根神经节中的巨噬细胞参与了神经病理性疼痛的发生以及轴突修复过程。为了鉴定尚未明确的神经免疫因子，亟需快速表征（或“快速分离”）神经损伤情况下背根神经节巨噬细胞的反应状态。本文介绍了我们实验室如何采用无酶机械解离方法，快速高效地从背根神经节中分离巨噬细胞。整个操作过程中样品始终保持在冰上，以最大限度减少细胞应激。与传统的酶解法相比，该方法耗时显著缩短，且已被常规应用于我们的荧光激活细胞分选分析。
引言
现有大量证据表明，免疫细胞在周围神经损伤后引发的神经病理性疼痛中起重要作用1,2。外周单核细胞（包括成熟巨噬细胞）已知可通过吞噬作用、抗原呈递和细胞因子释放来响应组织损伤和系统性感染。与神经损伤诱导的脊髓背角小胶质细胞活化类似，背根神经节（DRG）中的巨噬细胞在神经损伤后也会显著扩增3,4。值得注意的是，目前越来越多的研究关注巨噬细胞是否通过与DRG中的感觉神经元相互作用，参与周围神经损伤后神经病理性疼痛的发生发展5,6,7,8,9,10,11。此外，最近的研究还提示DRG巨噬细胞在神经损伤后的轴突修复过程中亦发挥作用12,13
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方案
所有动物实验均经加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。
1. 采集实验小鼠的腰段背根神经节
- 实验开始前，通过将9体积的密度梯度介质（如Percoll）与1体积的Ca++/毫克++无10x HBSS。置于冰上。
- 用2.5%阿佛丁麻醉小鼠。通过轻捏后肢足垫无反应确认动物已完全麻醉。
注意使用6至8周龄的雄性和雌性小鼠。 - 通过心脏灌注，将10 mL预冷的1×PBS注入小鼠体内。
- 将小鼠仰卧位固定于通风橱内，用胶带固定四肢。用镊子提起肋骨下方的皮肤，用手术剪做一小切口，暴露肝脏和膈肌。
- 继续使用剪刀剪开膈肌和肋骨笼，打开胸膜腔以暴露跳动的心脏。
- 用虹膜剪迅速剪开右心耳。观察到出血后，将30 G针头插入左心室后端，缓慢注入10 mL预冷的1×PBS，以灌注动物。
- 进行背侧椎板切除术15 在俯卧位的小鼠上。
注意：如果计划进行细胞培养，应在切开前用70%乙醇喷洒小鼠，并使用预先灭菌的手术器械进行解剖。- 使用11号手术刀，从胸区开始沿侧方纵向做一深部切口，一直延伸至骶区。用....
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结果
为了验证分离得到的细胞，我们首先选用了表达巨噬细胞Fas诱导凋亡（Macrophage Fas-Induced Apoptosis, MAFIA）的转基因小鼠17。该品系小鼠在集落刺激因子1受体（CSF1R）启动子的调控下，特异性地在巨噬细胞和小胶质细胞中表达一种药物可诱导的FK506结合蛋白（FKBP）-Fas自杀融合基因以及增强型绿色荧光蛋白（eGFP）。通过全身注射FK结合蛋白二聚化诱导剂AP20187（AP），可诱导表达该转基因的细胞发生凋亡。eGFP的表达也使我们能够监测背根神经节（DRG）中的巨噬细胞。为了在MAFIA小鼠中耗竭巨噬细胞，我们进行了连续3天、每日一次的腹腔注射AP（1 mg/kg）。末次注射后，将DRG切片并进行GFP免疫荧光染色。与溶剂对照（VEH）处理的小鼠相比，AP处理小鼠的DRG中GFP+细胞数量显著减少（图1A-B）。在另一项独立实验中，我们采用该方案处理后对DRG巨噬细胞进行机械性分离。随后的流式细胞术分析显示，AP处理小鼠中GFP
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讨论
本文介绍了一种有效富集小鼠背根神经节（DRG）中分离巨噬细胞的新方法。传统分离DRG免疫细胞的方法需要进行酶消化15,18，而本方案采用机械匀浆替代酶消化，以减少非预期的细胞损伤并提高细胞得率。因此，新方案耗时显著缩短。更重要的是，酶消化可能激活巨噬细胞并改变其分子特征；相比之下，我们的机械法可极大程度地降低细胞应激反应。
通过FACS分析，我们进一步表征了分离的DRG细胞中的巨噬细胞，并证明了较高的细胞回收率。在本方案下，分离得到的DRG细胞中超过80%具有活性（图2D）。从小鼠L4/L5节段DRG中预期可获得至少50,000至100,000个细胞。因此，我们可以有把握地得出结论：DRG细胞可进一步分选为巨噬细胞亚群14，用于后续培养或RNA提取。然而，有几个关键步骤可能影响细胞得率。若发现细胞产量不理想，应怀疑步骤2.1中组织匀浆程度不足或过度。可通过碘化.......
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披露
作者声明本稿件不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由以下机构资助：麻醉教育与研究基金会（XY）；加州大学旧金山分校麻醉与围手术期护理系（XY）；以及1R01NS100801-01（GZ）。本研究部分由HDFCCC细胞分析实验室共享资源中心通过美国国立卫生研究院资助（P30CA082103）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-小鼠 CX3CR1-APC 抗体 | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| 细胞滤筛（70 mm 尼龙） | Falcon | 352350 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce 组织匀浆器 | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS 管（5ml） | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson 骨钳 | FST | 16121-14 | |
| HBSS（10 倍浓度，无 Ca++/Mg++） | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes 弹簧剪 | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4864-10ml |
参考文献
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature....
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重印与许可
