本方案描述了一种混合式微型驱动阵列的构建方法，该阵列可在自由活动的小鼠两个脑区中植入九根可独立调节的四极电极和一根可调节的光-硅探针。同时展示了一种安全回收并重复利用光-硅探针以用于多种用途的方法。
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本文内容
摘要
摘要
多脑区神经记录可为理解多个脑区之间精细时间尺度上的相互作用提供关键信息。然而，传统的微型驱动器设计通常仅允许使用一种类型的电极来记录单个或多个脑区的活动，限制了单神经元或深度谱图记录的获取效率，也常常限制了将电极记录与光遗传学工具相结合以靶向特定神经通路或细胞类型的活动。本文介绍了一种用于自由活动小鼠的混合式微型驱动器阵列，旨在提高记录效率，并详细描述了该阵列的制作方法及其重复使用方式。当前设计在自由活动的小鼠中同时将九根四极电极和一根光-硅探针植入两个不同的脑区。四极电极和光-硅探针可在脑的背腹轴方向上独立调节，以最大化获取神经元放电活动和振荡活动的效率。该微型驱动器阵列还集成了光源系统，可实现光遗传学操控，用于研究长距离神经环路的脑区特异性或细胞类型特异性反应与功能。此外，光-硅探针可在每次实验后安全回收并重复使用。由于该微型驱动器阵列包含3D打印部件，其设计可轻松修改以适应不同实验需求。本文首先描述微型驱动器阵列的设计，以及如何将光纤连接至硅探针以用于光遗传学实验，随后介绍四极电极束的制备及阵列在小鼠脑内的植入过程。结合光遗传学刺激，对局部场电位和单神经元放电活动的记录结果也验证了该微型驱动器阵列系统在自由活动小鼠中的可行性。
引言
通过研究不同脑区之间如何动态相互作用，了解神经元活动如何支持学习和记忆等认知过程至关重要。为了阐明认知任务中神经活动的动态特性，研究人员已利用微驱动阵列在自由活动的动物中开展了大规模的细胞外电生理记录1,2,3,4。在过去二十年中，已开发出多种类型的微驱动阵列，用于将电极植入大鼠5,6,7,8和小鼠9,10,11,12的多个脑区。然而，目前的微驱动设计通常不允许同时使用多种探针类型，迫使研究人员只能选择一种具有特定优势和局限性的电极类型。例如，四极电极阵列适用于神经元密集的脑区（如背侧海马CA1区）1,....
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方案
本文所述所有方法均已获得德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 微驱动阵列部件的准备
- 使用牙科模型树脂通过3D打印机打印微型驱动阵列部件（图1A,B）。确保3D打印的每一层厚度小于50 µm，以保持打印部件上小孔的通畅和可用性。
注意：微型驱动阵列由五个部分组成（图1C）：（1）微型驱动阵列的主体，包含九个用于四极电极的微型驱动螺钉和一个用于硅探针的螺钉（图1Ca-d）。底部四极电极束和光硅探针孔的位置取决于目标脑区的坐标（图1Cd）；（2）用于安装硅探针或光探针的滑块（图1Ce）；（3）探针电连接器支架，用于固定硅探针连接器（图1Cf）；（4）光纤套管固定器，夹在主体中心部分，用于在插拔光纤连接器时防止植入的光硅探针发生不期望的移动（图1Cg）；以及（5）屏蔽锥，为微型驱动阵列提供物理和电学屏蔽，以实现稳定记录（图1Ch）。微型驱动阵列的总重量为5.9 g（含屏蔽锥）（
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结果
微型驱动阵列在5天内构建完成。微型驱动装置制备的时间线见表2。使用该微型驱动装置，将九根四极电极和一根硅探针分别植入小鼠的海马CA1区和内侧内嗅皮层（MEC）[21周龄、体重29 g的雄性pOxr1-Cre转基因小鼠（C57BL/6背景）]。该转基因小鼠在MEC第三层锥体神经元中表达Cre。在电极植入前10周，向小鼠MEC区域注射200 nL的AAV5-DIO-ChR2-YFP病毒（滴度：7.7 × 1012 gc/mL）。局部场电位（LFP）通过低通滤波器（1–500 Hz）记录，动作电位单元则通过高通滤波器（0.8–5 kHz）检测。光刺激（λ = 450 nm）采用脉宽1 ms、光强10.6 mW（在光纤连接端测得）的参数进行。四极电极记录的参考电极通过专用的四极电极丝植入白质中。硅探针记录的参考电极设为探针的顶部通道。
四极电极调整后，在线性轨道（图5A）和开放场（图5B）中测试了动物的行为表现。在这.......
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讨论
本方案展示了如何构建和植入一种混合式微型驱动阵列，可在自由活动的小鼠中利用独立可调的四极电极和硅探针同时记录两个脑区的神经活动。本方案还展示了光遗传学实验以及实验后硅探针的回收方法。尽管此前已有可调节硅探针33或光遗传-硅探针36在小鼠中植入的报道，但本方案在同时植入可调四极电极阵列与光遗传-硅探针方面具有明显优势，可灵活选择植入探针的类型。根据实验目的的不同，可更换不同类型的植入探针，例如多叉探针27,44或超高密度Neuropixels探针21,45。在3D物体设计阶段，可根据需要轻松修改植入的坐标和角度7。例如，在涉及记忆相关脑区的学习任务中，可实现双位点甚至三位点的同步记录，这些脑区包括海马体46、内嗅皮层<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了日本促进科学协会海外研究奖学金（HO）、捐赠学者项目（TK）、人类前沿科学计划（TK）、脑研究基金会（TK）以及理工学院科技人才引进与留任计划（TK）和脑 & 行为研究基金会（TK），以及住友基金会研究资助（JY）、NARSAD青年研究者研究资助（JY）。我们感谢W. Marks在稿件撰写过程中提供的宝贵意见和建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #00-90 螺钉 | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB 螺钉 |
| #0-80 螺母 | Small Parts | B00DGB7CT2 | 用于固定光纤插芯夹具的黄铜螺母 |
| #0-80 螺钉 | Small Parts | B000FMZ57G | 用于探针连接器安装座、光纤插芯夹具和屏蔽锥的黄铜机用螺钉 |
| 22 号聚醚醚酮管 | Small Parts | SLPT-22-24 | 用于连接至穿梭装置，内径为 0.025 英寸 |
| 23 号不锈钢管 | Small Parts | HTX-23R | 用于制作四极记录电极 |
| 23 号不锈钢丝 | Small Parts | HTX-23R-24-10 | 用于制作 L 形支撑丝 |
| 26 号不锈钢丝 | Small Parts | GWX-0200 | 用于制作导向柱 |
| 30 号不锈钢丝 | Small Parts | HTX-30R | 用于制作四极记录电极 |
| 3D CAD 软件包 | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
| 3D 打印机 | FormLab | Form2 | |
| 5.5 mil 聚酰亚胺绝缘管 | HPC Medical | 72113900001-012 | |
| 铝箔胶带 | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | 用于替代屏蔽锥 |
| 导电膏 | YSHIELD | HSF54 | 用于屏蔽锥 |
| 硅探针微型驱动器专用螺钉 | AMT | UNM1.25-HalfMoon | 半月形不锈钢螺钉，直径 1.5 mm，螺距 300 µm |
| 四极记录电极微型驱动器专用螺钉 | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | 开槽不锈钢螺钉，直径 0.5 mm，螺距 160 µm，按设计定制生产 |
| 牙科丙烯酸树脂 | Stoelting | 51459 | |
| 牙科模型树脂 | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
| Dremel 旋转工具 | Dremel | 型号 800 | 研磨机 |
| 钻头 | Fine Science Tool | 19007-05 | |
| 电接口板 | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
| 环氧树脂 | Devcon | GLU-735.90 | 5 分钟快干环氧胶 |
| 眼膏 | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | 用于防止小鼠在手术期间眼睛干涩 |
| 光纤抛光片 | Thorlabs | LFG5P | 用于抛光光纤 |
| 精细镊子 | Protech International | 15-368 | 用于装载/回收硅探针 |
| 金针 | Neuralynx | EIB Pins Small | |
| 接地导线 | A-M Systems | 781500 | 直径 0.010 英寸的裸银线 |
| 前置放大器头级 | Neuralynx | HS-36 | |
| 阻抗计 | BAK electronics | Model IMP-2 | 测试频率 1 kHz |
| 矿物油 | ZONA | 36-105 | 用于润滑螺钉和导线 |
| 光纤 | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
| 记录系统 | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
| 红宝石光纤刻划笔 | Thorlabs | S90R | 用于切割光纤 |
| 硅脂 | Fine Science Tool | 29051-45 | |
| 硅探针 | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | 图 3、4A、4B、5 |
| 硅探针 | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | 图 4C |
| 硅探针清洗液 | Alcon | AL10078844 | 隐形眼镜清洁剂 |
| 硅橡胶 | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | 用于制备微型驱动器模具 |
| 银漆 | GC electronic | 22-023 | 银漆 II 涂层，用于接地导线 |
| 颅骨螺钉 | Otto Frei | 2647-10AC | 直径 0.8 mm，螺距 0.200 mm |
| 标准手术剪刀 | ROBOZ | RS-5880 | |
| 立体定位仪 | Kopf | Model 942 | |
| 超级胶水 | Loctite | LOC230992 | 用于粘接导向柱 |
| 手术镊 | ROBOZ | RS-5135 | |
| 四极记录电极扭转器 | Jun Yamamoto | TT-01 | |
| 四极记录电极导线 | Sandvik | PX000004 |
参考文献
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple refere....
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