Method Article

使用多路复用共免疫沉淀对蛋白质相互作用网络动力学进行量化

DOI:

10.3791/60029

⸱

August 21st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

定量多路复用免疫沉淀 （QMI） 使用流式细胞测定技术，灵敏地检测两个样本之间靶向蛋白-蛋白质相互作用的丰度差异。QMI可以使用少量的生物材料进行，不需要基因工程标签，并可以适应任何先前定义的蛋白质相互作用网络。

Abstract

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动态蛋白-蛋白质相互作用控制细胞行为，从运动到DNA复制到信号转导。然而，监测蛋白质相互作用网络中多种蛋白质之间的动态相互作用在技术上是困难的。在这里，我们提出了定量多路复用免疫沉淀 （QMI） 的协议，它允许根据暴露检测到的共享复合物中蛋白质的相对荧光测量，定量评估蛋白质相互作用的褶皱变化表面表位（PiSCES）。在QMI中，来自细胞解物的蛋白质复合物被免疫沉淀到微球上，然后用标记的抗体探测不同的蛋白质，以量化PiSCES的丰度。免疫沉淀抗体与不同的 MagBead 光谱区域结合，使流式细胞仪能够区分多个平行免疫沉淀，同时量化与每个光谱抗体相关的量。与其他免疫沉淀方法相比，QMI不需要遗传标记，可以使用最少的生物材料进行。QMI可以适应任何定义的相互作用蛋白组，到目前为止已经用于描述T细胞和神经元谷氨酸突触中的信号网络。研究结果产生了新的假说，具有潜在的诊断和治疗应用。该协议包括执行 QMI 的指令，从初始抗体面板选择到运行检测和分析数据。QMI测定的初始组装涉及筛选抗体以生成面板，并实证确定适当的莱沙缓冲液。随后的试剂制备包括共价耦合免疫沉淀抗体与MagBeads，以及生物仿菌探针抗体，以便它们可以被链球菌-结合荧光剂标记。为了运行测定，裂解物与MagBeads在一夜之间混合，然后用不同的探针抗体分珠和孵育，然后贴上荧光度标签，然后通过流式细胞仪读取。执行两个统计测试，以识别在实验条件之间差异很大的 PiSCES，并使用热图或节点边缘图对结果进行可视化。

Introduction

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动态蛋白质-蛋白质相互作用构成分子信号级联和移动结构，是大多数细胞生理学的功能基础。这些过程通常被描述为线性信号通路，在基于单个输入的稳定状态之间切换，但实验和建模数据清楚地显示它们作为集成网络2、3、 4.就G蛋白而言，不同的受体通常具有激活同一G蛋白的能力，而单个受体也可以激活多种类型的G蛋白5，6。为了使相对较少的G蛋白类专门调节大量的细胞功能，如突触传输，激素调节和细胞迁移，细胞必须集成和区分这些信号4,5.有证据表明，对于G蛋白和其他蛋白质来说，这种信号特异性主要是基于精细调整的蛋白质-蛋白质相互作用及其时间动力学1，3。4,5,6

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Protocol

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1. 测试设计

  1. 候选抗体制备
    1. 对于每个感兴趣的蛋白质，选择3到5个抗体进行筛选。如果可能，使用识别不同表位的单克隆抗体。还包括一种非特异性控制抗体。
    2. 要去除Tris，请通过将抗体添加到30 kDa自旋过滤器中，向下旋转至最小体积，加入500μL的磷酸盐缓冲盐水（PBS），并重复3次，从而进行缓冲液交换。要去除载体蛋白，请根据制造商的协议执行抗体纯化（有关特定纯化建议，请参阅材料表）。
      注:这是因为携带蛋白和带游向胺群的缓冲液（如Tris）会与COOH组发生反应，并淬火随后的珠子耦合和生物异化反应。确保所有抗体均被纯化（无载体蛋白），并在无原胺的缓冲液中（即无Tris）。
    3. 像戴维斯和施鲁姆20所描述的，将每个抗体与Carboxylate改性乳胶（CML）珠子耦合。为了保存抗体，将珠耦合反应缩减至1/5（即3.6 x 106个珠子，10μL为0.2-1 mg/mL抗体）。
    4. 使用流量计（通常为 ±108/mL）估计珠数，并储存在 4°C。珠子已经储存了一年多，并在QMI检测中成功使用，但保质期或保质期尚未正式确定。B/S缓冲液中的NaN3可防止细菌生长。
    5. 对每种抗体的一部分进行生物浸酯（见下文第2.2节）。储存在4°C。
    6. 通过染色 1 x 1....

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Results

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抗体筛查
图 2B显示蛋白质 Connexin36 的屏幕结果。大多数 IP-probe 组合在 IgG 控制装置上不产生信号。与 IgG 对照组相比，具有单克隆抗体 1E5 和 1E5 或多克隆抗体 6200 的探针的 IP 在珠子分布中产生右移。在这里，选择 IP 1E5 和探针 6200poly 是为了避免使用与 IP 和探针相同的抗体，同时降低非特异性蛋白质被两个独立抗体识别的可能性，并增加使用不同的缩影。与 IgG 控件相比，最好选择至少具有 1-2 个日志更高的 MFI 的 IP_probe 组合，但偶尔，如果未识别任何替代项，则可能会使用产生与控件一致区分的较弱 MFI 的对。图 2C显示了 1E5-6200poly 组合的特异性验证实验。使用Connexin36质粒转染的293个细胞的Lysate在珠子分布中产生±1.5对原的右移，而未转染的细胞与IgG对照重叠。在确认一对的特异性时，来自没有靶蛋.......

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Discussion

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QMI 测定需要在抗体面板开发、设备和试剂方面投入大量资金，但一旦建立了检测，就可以收集高维数据来观察蛋白质相互作用网络，因为它们对实验控制的反应刺激。从技术上讲，QMI 需要仔细移液和跟踪样品和抗体井位置。仔细标记化片是有用的，就像在纸上制作井位的详细模板一样，然后保存该模板进行数据分析。在任何时候保持珠子和流源性冷的重要性，包括在流式细胞仪微孔板载体中（有关定制制冷说明，见图 S1）的重要性怎么强调也不为过。蛋白质相互作用在室温下会迅速分离，早期使用未经修饰的室温流细胞仪的尝试以识别许多温度-实验室相互作用而告终，而不是那些与预期变化的相互作用刺激。

QMI是一种基于抗体的测定，因此抗体的初始选择至关重要。应尽可能使用单克隆或重组抗体，以减少结果的变异性。多克隆体显示批次到批次的变化，但肽基多克隆到短表位似乎相对稳定随着时间的推移。通过购买大批量抗体可以最大限度地减少漂移;这还允许定制无载体抗体，从而排除使用甜胶和旋转柱净化抗体的需要，以及相关的抗体损失。

还必须注意，由于检测信号依赖于可.......

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Disclosures

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提交人没有利益冲突可披露。

Acknowledgements

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作者希望感谢 Tessa Davis 对 QMI 测定开发做出的重要贡献，以及史密斯和施鲁姆实验室的现任和前任成员的技术指导和智力投入。这项工作由NIMH赠款R01 MH113545和R00 MH 102244资助。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 孔平底板Bio Rad171025001
96 孔 PCR 板VWR82006-704
Bio Rad的Bioplex 200 系统保持部分冷藏，详见图 S1
Bio-Plex Pro 清洗站Bio Rad30034376
BSASigma
CML 微球InvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-生物素Thermo ScientificA39256
MagPlex 微球LuminexMC12xxx-01xxx 是 3 位微珠区域
Melon Gel IgG Spin 纯化试剂盒Thermo Scientific45206用于抗体纯化
MESSigmaM3671
微孔板胶片，非无菌USA Scientific2920-0000
磷酸酶抑制剂混合物 #2SigmaP5726
蛋白酶抑制剂混合物SigmaP8340
三明治制备冰箱NorlakeSMP 36 15用于 Bioplex 200
钠的定制冷藏氟化物 Sigma201154
原钒酸钠Sigma450243
链霉亲和素-PEBioLegend405204
磺基 NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152
带 HTF 171000205，

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for C....

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