定量多重免疫沉淀（QMI）利用流式细胞术，可灵敏地检测两个样本之间特定蛋白质-蛋白质相互作用丰度的差异。QMI仅需少量生物材料，无需基因工程标签，且可适用于任何已知的蛋白质相互作用网络。
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摘要
摘要
动态的蛋白质-蛋白质相互作用调控着细胞行为，从细胞运动到DNA复制再到信号转导均受其控制。然而，在蛋白质相互作用网络中监测多个蛋白质之间的动态相互作用在技术上具有挑战性。本文介绍一种定量多重免疫沉淀（QMI）实验方案，该方法基于对通过暴露表面表位检测到的共享复合物中蛋白质（PiSCES）的相对荧光测量，实现对蛋白质相互作用变化倍数的定量评估。在QMI中，来自细胞裂解液的蛋白质复合物被免疫沉淀至微球上，随后用针对另一蛋白质的标记抗体进行探测，以定量PiSCES的丰度。不同的免疫沉淀抗体被偶联至不同光谱特性的磁珠（MagBead），从而使流式细胞仪能够区分多个并行的免疫沉淀反应，并同时量化每种反应所结合的探针抗体的量。QMI无需基因标记，且相较于其他免疫沉淀方法仅需极少量生物样本。QMI可适用于任何已知的相互作用蛋白组合，目前已用于表征T细胞和神经元谷氨酸突触中的信号网络。相关研究结果已催生新的科学假说，并具有潜在的诊断与治疗应用价值。本实验方案详细说明了从初始抗体组合筛选到实验操作及数据分析的完整QMI流程。QMI实验的初步建立包括对抗体进行筛选以构建抗体组合，并通过实验确定合适的裂解缓冲液。后续试剂制备包括将免疫沉淀抗体共价偶联至磁珠，以及对探针抗体进行生物素化，以便其可通过链霉亲和素偶联的荧光染料进行标记。实验操作时，将裂解液与磁珠混合孵育过夜，随后将磁珠分装，分别与不同的生物素化探针抗体孵育，再加入荧光染料标记，最后通过流式细胞术读取信号。通过两种统计学检验方法识别在不同实验条件下存在显著差异的PiSCES，并利用热图或节点-边线图对结果进行可视化展示。
引言
动态的蛋白质-蛋白质相互作用构成了分子信号级联和运动结构，这些是大多数细胞生理功能的分子基础1。这些过程通常被描述为基于单一输入在稳态之间切换的线性信号通路，但实验和建模数据明确表明，它们是以整合网络的方式运作的2,3,4。以G蛋白为例，不同的受体通常能够激活同一种G蛋白，而单个受体也可以激活多种类型的G蛋白5,6。为了使数量相对有限的G蛋白类别能够特异性地调控大量细胞功能（如突触传递、激素调节和细胞迁移），细胞必须对这些信号进行整合与区分4,5。已有证据表明，这种信号特异性——不仅限于G蛋白，也包括其他信号分子——主要来源于精细调控的蛋白质-蛋白质相互作用及其时间动态特性1,3,4,5,
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方案
1. 实验设计
- 候选抗体的制备
- 针对每个目标蛋白，选择3至5种抗体进行筛选。在可能的情况下，使用识别不同表位的单克隆抗体。同时包括一种非特异性对照抗体。
- 为去除Tris，通过将抗体加入30 kDa离心滤管中进行缓冲液置换，离心至最小体积后，加入500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，并重复 3 次。为去除载体蛋白，按照制造商的说明书进行抗体纯化（见 材料表 有关特定纯化建议）。
注意：这是因为含有游离胺基的载体蛋白和缓冲液（如 Tris）会与羧基（COOH）发生反应，从而抑制后续的磁珠偶联和生物素标记反应。请确保所有抗体均为纯化形式（不含载体蛋白），并溶解于不含伯胺的缓冲液中（即不含 Tris）。 - 按照 Davis 和 Schrum 的方法将每种抗体偶联至羧基修饰的乳胶（CML）微球20为节约抗体，可将偶联反应体系缩小至1/5（即3.6 x 106 10个珠子 µ0.2–1 mg/mL 抗体的 L
- 使用血细胞计数板估算微球数量（通常约为 ~108/mL）并于 4 ℃ 保存 °C. 磁珠储存超过一年后仍可成功用于QMI实验，但尚未正式确定其保质期或有效期。NaN3 B/S缓冲液可防止细菌生长。
- 将每种抗体的....
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结果
抗体筛选
图 2B 展示了对 Connexin36 蛋白进行筛选的结果。大多数 IP 探针（IP_probe）组合在 IgG 对照组中未产生信号。使用单克隆抗体 1E5 进行免疫沉淀（IP），并用 1E5 或多克隆抗体 6200 作为探针时，与 IgG 对照组相比，微珠分布出现向右偏移。此处选择 IP 使用 1E5、探针使用 6200poly，以避免将同一抗体同时用于 IP 和探针，这既能降低非特异性蛋白被两种独立抗体识别的可能性，也能通过不同表位提高检测到共结合相互作用的概率。最佳选择是 IP 与探针组合的平均荧光强度（MFI）至少比 IgG 对照组高出 1–2 个对数级；但若无其他可用组合，也可考虑使用 MFI 较弱但仍能稳定区别于对照组的抗体对。图 2C 展示了 1E5-6200poly 组合的特异性验证实验结果。转染 Connexin36 质粒的 293 细胞裂解液导致微珠分布向右偏移约 1.5 个对数.......
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讨论
QMI 检测需要在抗体组合开发、仪器设备和试剂方面投入大量资源，但一旦建立该检测方法，即可获取高维度数据，用于观察蛋白质相互作用网络在实验可控刺激下的响应情况。从技术上讲，QMI 要求精确的移液操作以及对样本和抗体孔位的仔细追踪。仔细标记检测板非常有帮助，同时建议在纸上绘制详细的孔位模板，并在后续数据分析时保留使用。始终保持微球和裂解液处于低温状态至关重要，包括在流式细胞仪微孔板载架中也应如此（定制制冷操作说明见图 S1），这一点再怎么强调也不为过。蛋白质相互作用在室温下会迅速解离，早期尝试使用未经改造的室温流式细胞仪时，结果仅鉴定出许多对温度敏感的相互作用，而未能检测到随预期刺激发生变化的相互作用。
QMI 是一种基于抗体的检测方法，因此抗体的初始选择至关重要。应尽可能使用单克隆或重组抗体，以减少结果的变异性。多克隆抗体存在批间差异，但针对短表位的肽段来源多克隆抗体在时间上相对稳定。通过一次性购买大量抗体可最大限度减少批间漂移；这种方法还支持定制无载体蛋白的抗体，从而避免使用 Melon Gel 和离心柱进行抗体纯化，以及由此带来的抗体损失。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者希望感谢 Tessa Davis 在 QMI 检测方法开发中的重要贡献，并感谢 Smith 实验室和 Schrum 实验室现任及前任成员提供的技术指导和学术支持。本研究由美国国立精神卫生研究院（NIMH）资助，项目编号为 R01 MH113545 和 R00 MH102244。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔平底板 | Bio Rad | 171025001 | |
| 96孔PCR板 | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200系统（带HTF） | Bio Rad | 171000205 | 经改装以实现部分冷藏，详见图S1 |
| Bio-Plex Pro洗涤站 | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML磁珠 | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex微球 | Luminex | MC12xxx-01 | xxx为3位数微球区域编号 |
| Melon Gel IgG离心纯化试剂盒 | Thermo Scientific | 45206 | 用于抗体纯化 |
| MES | Sigma | M3671 | |
| 微孔板密封膜（非无菌） | USA Scientific | 2920-0000 | |
| 磷酸酶抑制剂混合液#2 | Sigma | P5726 | |
| 蛋白酶抑制剂混合液 | Sigma | P8340 | |
| 三明治制备冰箱 | Norlake | SMP 36 15 | 用于Bioplex 200系统的定制冷藏 |
| 氟化钠 | Sigma | 201154 | |
| 正钒酸钠 | Sigma | 450243 | |
| 链霉亲和素-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
参考文献
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for C....
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