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方法文章

使用多重共免疫沉淀法量化蛋白质相互作用网络动态

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DOI：

10.3791/60029

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2019年8月21日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

本文内容

摘要

定量多重免疫沉淀（QMI）利用流式细胞术，可灵敏地检测两个样本之间特定蛋白质-蛋白质相互作用丰度的差异。QMI仅需少量生物材料，无需基因工程标签，且可适用于任何已知的蛋白质相互作用网络。

摘要

动态的蛋白质-蛋白质相互作用调控着细胞行为，从细胞运动到DNA复制再到信号转导均受其控制。然而，在蛋白质相互作用网络中监测多个蛋白质之间的动态相互作用在技术上具有挑战性。本文介绍一种定量多重免疫沉淀（QMI）实验方案，该方法基于对通过暴露表面表位检测到的共享复合物中蛋白质（PiSCES）的相对荧光测量，实现对蛋白质相互作用变化倍数的定量评估。在QMI中，来自细胞裂解液的蛋白质复合物被免疫沉淀至微球上，随后用针对另一蛋白质的标记抗体进行探测，以定量PiSCES的丰度。不同的免疫沉淀抗体被偶联至不同光谱特性的磁珠（MagBead），从而使流式细胞仪能够区分多个并行的免疫沉淀反应，并同时量化每种反应所结合的探针抗体的量。QMI无需基因标记，且相较于其他免疫沉淀方法仅需极少量生物样本。QMI可适用于任何已知的相互作用蛋白组合，目前已用于表征T细胞和神经元谷氨酸突触中的信号网络。相关研究结果已催生新的科学假说，并具有潜在的诊断与治疗应用价值。本实验方案详细说明了从初始抗体组合筛选到实验操作及数据分析的完整QMI流程。QMI实验的初步建立包括对抗体进行筛选以构建抗体组合，并通过实验确定合适的裂解缓冲液。后续试剂制备包括将免疫沉淀抗体共价偶联至磁珠，以及对探针抗体进行生物素化，以便其可通过链霉亲和素偶联的荧光染料进行标记。实验操作时，将裂解液与磁珠混合孵育过夜，随后将磁珠分装，分别与不同的生物素化探针抗体孵育，再加入荧光染料标记，最后通过流式细胞术读取信号。通过两种统计学检验方法识别在不同实验条件下存在显著差异的PiSCES，并利用热图或节点-边线图对结果进行可视化展示。

引言

动态的蛋白质-蛋白质相互作用构成了分子信号级联和运动结构，这些是大多数细胞生理功能的分子基础1。这些过程通常被描述为基于单一输入在稳态之间切换的线性信号通路，但实验和建模数据明确表明，它们是以整合网络的方式运作的2,3,4。以G蛋白为例，不同的受体通常能够激活同一种G蛋白，而单个受体也可以激活多种类型的G蛋白5,6。为了使数量相对有限的G蛋白类别能够特异性地调控大量细胞功能（如突触传递、激素调节和细胞迁移），细胞必须对这些信号进行整合与区分4,5。已有证据表明，这种信号特异性——不仅限于G蛋白，也包括其他信号分子——主要来源于精细调控的蛋白质-蛋白质相互作用及其时间动态特性1,3,4,5,6,7。由于信号网络由具有多个输入、输出和反馈回路的动态蛋白质复合物组成，单一扰动就可能改变细胞生理整体的稳态平衡4,7。目前普遍认为，应从网络视角来研究信号传导，以更深入理解多种输入信号的整合如何调控健康与疾病状态下的特定细胞功能7,8,9,10,11,12,13。基于这一认识，定量多重免疫沉淀技术（Quantitative Multiplex Immunoprecipitation, QMI）被开发出来，用于获取关于动态蛋白质相互作用网络中折叠变化的中等通量定量数据。

QMI 是一种基于抗体的检测方法，其中细胞裂解液与一组免疫沉淀抗体共同孵育，这些抗体共价连接在含有不同比例荧光染料的磁珠上。将特异性抗体连接至不同类别的磁珠，可实现从同一样本裂解液中同时进行多个靶蛋白的共免疫沉淀。在免疫沉淀（IP）之后，磁珠与第二种带有荧光标记的探针抗体（或生物素标记的抗体联合荧光标记的链霉亲和素）进行孵育。通过流式细胞术检测每对免疫沉淀抗体与探针抗体所识别蛋白之间的共关联关系，即 PiSCES（通过暴露的表面表位检测到的共享复合物中的蛋白），并可在不同样本条件下进行定量比较14。 图1 中的示意图展示了进行 QMI 检测的各个步骤，包括磁珠上由荧光标记探针抗体标记的免疫沉淀蛋白复合物的示意图（图1C）。

定量微阵列免疫沉淀（QMI）的灵敏度取决于裂解液中的蛋白浓度与用于免疫沉淀的磁珠数量之间的比例关系，而要达到检测10%变化幅度的分辨率，相较于其他共免疫沉淀方法，QMI仅需极少量的起始材料14,15。例如，QMI所需的起始材料量与夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）相当，但单次QMI检测可同时分析多个分子相互作用。已有研究使用来自4 mm皮肤活检样本分离的1–5 × 105个原代T细胞、小鼠前额叶皮层3 mm冠状切片制备的P2突触体，或3 × 106个培养的小鼠原代皮层神经元，成功完成了包含20个免疫沉淀反应和20个探针靶标的QMI实验14,16,17。这种高灵敏度使QMI特别适用于临床样本等来源有限的细胞或组织的分析。

定量显微成像技术（QMI）可适用于任何先前定义的蛋白质相互作用网络（前提是存在相应的抗体），迄今为止已用于分析T细胞抗原受体（TCR）信号体以及神经元谷氨酸能突触中的一组特定蛋白质17,18。在T细胞受体信号传导研究中，QMI最初被用于识别刺激诱导的PiSCES变化，随后用于区分自身免疫患者与对照组，检测内源性自身免疫信号，并最终提出一个涉及疾病相关相互作用子网络失衡的假说14。最近，相同的QMI检测面板被用于确定胸腺细胞选择由TCR相关蛋白质信号的定量差异而非定性差异所决定19。在神经元中，QMI被用于描述不同输入信号类型下蛋白质相互作用网络的输入特异性重排，这一发现支持了突触可塑性领域新近提出的模型17。此外，该突触QMI检测面板还被用于识别七种自闭症小鼠模型之间的差异，根据其PiSCES生物特征将这些模型聚类为亚组，并准确推测出其中一种模型中先前未被识别的共同分子缺陷16。类似的方法可用于筛查可能对不同药物治疗产生响应的其他亚组，或为特定响应亚组分配合适的药物。除基础科学研究外，QMI在疾病诊断、患者亚型分类以及药物开发方面均具有潜在应用价值。

为了构建QMI抗体组合，初步的抗体筛选和选择方案详见下文第1部分。一旦确定了抗体组合，第2部分将描述将选定抗体与磁珠偶联用于免疫沉淀（IP），以及对选定的探针抗体进行生物素标记的方案。第3部分描述了在细胞或组织裂解液中进行QMI检测的实验流程。最后，由于单次实验可产生约5 × 105个独立数据点，第4部分提供了辅助数据处理、分析和可视化的操作说明及计算机代码。第2至第4部分所述工作流程的概览见图1。

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方案

1. 实验设计

  1. 候选抗体的制备
    1. 针对每个目标蛋白，选择3至5种抗体进行筛选。在可能的情况下，使用识别不同表位的单克隆抗体。同时包括一种非特异性对照抗体。
    2. 为去除Tris，通过将抗体加入30 kDa离心滤管中进行缓冲液置换，离心至最小体积后，加入500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，并重复 3 次。为去除载体蛋白，按照制造商的说明书进行抗体纯化（见 材料表 有关特定纯化建议）。
      注意：这是因为含有游离胺基的载体蛋白和缓冲液（如 Tris）会与羧基（COOH）发生反应，从而抑制后续的磁珠偶联和生物素标记反应。请确保所有抗体均为纯化形式（不含载体蛋白），并溶解于不含伯胺的缓冲液中（即不含 Tris）。
    3. 按照 Davis 和 Schrum 的方法将每种抗体偶联至羧基修饰的乳胶（CML）微球20为节约抗体，可将偶联反应体系缩小至1/5（即3.6 x 106 10个珠子 µ0.2–1 mg/mL 抗体的 L
    4. 使用血细胞计数板估算微球数量（通常约为 ~108/mL）并于 4 ℃ 保存 °C. 磁珠储存超过一年后仍可成功用于QMI实验，但尚未正式确定其保质期或有效期。NaN3 B/S缓冲液可防止细菌生长。
    5. 将每种抗体的一部分进行生物素标记（见下文第2.2节）。4 ℃保存 °C.
    6. 通过染色 1 x 10⁶ 个CML磁珠，验证磁珠偶联的有效性及计数的准确性5 使用与抗体宿主物种反应的PE标记抗体孵育微球，并在流式细胞仪上检测。
    7. 通过使用链霉亲和素-HRP的点印迹法验证抗体的生物素化。
    8. 一旦实验室制备出已知有效的试剂，应在步骤1.1.5和1.1.6的验证反应中将其用作阳性对照。
  2. 通过流式细胞术检测的免疫沉淀法（IP-FCM）进行抗体筛选
    1. 确定合适的筛选裂解液。在此步骤及所有其他预QMI筛选步骤（本节第1部分：实验设计中包含的所有内容）中，不要使用来源有限的生物样本。应选择可替代的对照材料，例如野生型小鼠组织、细胞系或非稀缺的正常人供体组织。
      注意：为本实验选择裂解缓冲液并非易事，相关内容详见第1.5节“去垢剂选择”以及讨论部分倒数第二段。标准裂解缓冲液的基础成分为150 mM NaCl、50 mM Tris（pH 7.4）、10 mM 氟化钠、2 mM 正钒酸钠，以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。适用于QMI的去垢剂包括1% NP-40、1% Digitonin、0.1–1% Triton X-100和0.5–1%脱氧胆酸盐。14,16,17,18,19,21.
    2. 根据每次免疫沉淀（IP）所需的量，计算裂解液的总体积，使用 10 µ每种免疫沉淀-探针组合的筛选需准备 L。若筛选 X 种探针抗体并使用一种 IgG 对照，则每种免疫沉淀所需的量为 (X+1) × (10 µL）×（移液误差系数1.1）；X+1 是为了包含所需的 IgG 探针对照。例如，在一个 3×3 抗体筛选中，每个免疫沉淀应使用 44 μl。请记得包含 IgG 免疫沉淀对照（参见示例筛选设置） 图2).
    3. 计算要使用的 CML 磁珠数量。如果您正在筛选 X 种探针抗体，则使用 [(X+1) * 5 x 104 微球]。理想情况下，每孔5,000个微球将导致 >每孔由流式细胞仪读取2,000个微球。例如，在3 × 3抗体筛选中，每次免疫沉淀应使用20,000个微球，约为0.66 µ步骤1.1.3制备的CML磁珠储备液L（应先使用血细胞计数板对磁珠进行定量，以确保准确性）。
    4. 将步骤 1.2.2 中的裂解液体积与步骤 1.2.3 中待筛选的每种 CML 微球体积混合，于 4 °C 过夜孵育 °在旋转条件下进行孵育，以防止磁珠沉降。通常在96孔PCR板的第一列中进行孵育，并使用PCR管条盖密封。
    5. 3,200 × g 离心 CML 磁珠 g 1 分钟后，通过将培养板在水槽上方快速甩动一次，去除裂解液。每次甩动前后，每个孔底部均应可见微小的白色沉淀。
    6. 将CML磁珠重悬于适量FlyP缓冲液中，使其体积为20 µ每对磁珠-探针使用 L；对于 X 种探针抗体，使用 (X+1) * (20 µL）×（1.1 以计移液误差），与步骤 1.2.2 类似。对于 3 × 3 筛选，重悬于 88 µL 的 FlyP 缓冲液。FlyP 缓冲液含 100 mM NaCl、50 mM Tris（pH 7.4）、1% BSA、0.01% NaN3.
    7. 将每个免疫沉淀物分配至96孔PCR板中的（X+1）个孔中，其中X为待筛选的探针抗体数量，每孔使用20 µL/孔 图2A 显示了一个示例筛选装置。
    8. 再用 200 洗涤 2 次 µ每孔加入 FlyP 缓冲液 L。按照步骤 1.2.5 离心平板，每次洗涤后轻弹平板以去除洗涤缓冲液。沉淀物会非常小，但每次洗涤后应可见。
    9. 针对每种待筛选的生物素化抗体，计算总体积为 (Y+1) × 1.1 × 50 µL，其中 Y 为待筛选的 IP 抗体数量。用此体积的 FlyP 缓冲液将抗体稀释至工作浓度，通常以 0.5 mg/mL 原液的 1:100 稀释度开始。
    10. 将每种稀释后的抗体分别加入96孔板的各列中，并确保CML磁珠充分重悬。
    11. 4°C 下孵育 °4℃孵育1小时，期间通过旋转或每隔15分钟吹打混匀，以确保CML磁珠保持悬浮状态。
    12. 用 200 μL 洗涤 3 次 µ每次洗涤时，加入1 L FlyP缓冲液，离心并按照步骤1.2.5的方法去除裂解液。
    13. 将所有 CML 磁珠重悬于 50 µ1:200 链霉亲和素-PE 的 FlyP 缓冲液
    14. 4°C 下孵育 °在暗处 30 分钟
    15. 用 200 μL 洗涤 3 次 µ每次洗涤时，加入1 L FlyP缓冲液，离心并按照步骤1.2.5的方法去除裂解液。
    16. 重悬于 200 µL 的 FlyP 缓冲液，然后在流式细胞仪上运行。
  3. 选择纳入检测的抗体
    1. 使用FSC-H与SSC-H对细胞大小设门，并利用FSC-H与FSC-A排除双联体。
    2. 生成PE荧光强度的直方图，并将两种IgG对照（IgG微球-测试探针、测试微球-IgG探针）与待测样本对叠加显示图2).
    3. 寻找信噪比较高的磁珠-探针组合（图2B此外，不建议对微球和探针使用同一种抗体。不同的表位识别可最大限度提高检测到相互作用的可能性，因为某些表位在特定蛋白复合物中可能被遮蔽。若无合适选项，应使用更多抗体重复筛选。
  4. 抗体特异性的验证
    1. 为确保抗体针对预期靶标的特异性，应使用靶标已被敲除的裂解液样本；例如，基因敲除小鼠或RNA干扰细胞系。或者，可使用靶标阴性细胞系的裂解液，其中靶蛋白已被人工表达。
    2. 按照步骤1.2所述进行IP-FCM实验，并根据具体实验需求进行相应调整。
  5. 去垢剂选择
    1. 由于去垢剂在共免疫沉淀实验中至关重要，需通过实验测试不同种类的去垢剂，以确保该检测方法最大程度地检出相互作用的变化。首先，选择一组数量较少（4–8个）已知在特定条件下会发生变化或与研究特别相关的相互作用。
    2. 使用为初始筛选制备的非荧光抗体偶联CML微珠，按照1.2节所述进行IP-FCM实验，同时改变裂解缓冲液中的去垢剂条件。去垢剂筛选可仅以去垢剂为变量进行，也可针对每种去垢剂设置不同的细胞条件。务必为微珠和探针均设置IgG对照，因为去垢剂有时会在某些IP-探针组合中产生意外的背景信号。
    3. 根据筛选所得的平均荧光强度（MFI）选择一种去垢剂，以优化目标PiSCES的信号。在此过程中可能需要进行一些权衡。22.

2. 多重试剂制备

  1. 磁珠偶联
    1. 根据磁珠区域图，选择磁珠区域以特定模式排列，以尽量降低交叉检测的风险。磁珠信号通常会向右上方扩散，因此应避免选择对角相邻的磁珠区域。建议采用Luminex官网所示磁珠图中每隔一列的磁珠区域（https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/）。
    2. 将无载体抗体用 PBS 配制成 0.1 mg/mL 的溶液（同 1.1.2 步骤），体积为 250 µL. 置于冰上，以备后续使用。
    3. 充分涡旋振荡磁珠，然后分装为每份250 µL 加入棕色微量离心管中（以保护磁珠免受光漂白）。
    4. 磁力分离磁珠60秒，移除上清液。
    5. 加入 250 µL MES缓冲液（50 mM MES pH 6.0，1 mM EDTA），涡旋混匀，磁力分离60秒，弃上清液。重复一次，并将磁珠重悬于200 µL 的 MES 缓冲液。
    6. 加入40 µ将 MES 加入装有 2 mg 单次使用管装 Sulfo-NHS 的离心管中，配制成 50 mg/mL 的储存液。
    7. 加入25 µ将新配制的 Sulfo-NHS 溶液加入磁珠中，涡旋混匀。
    8. 加入25 µL 的 50 mg/mL 新配制的 EDAC［1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，也称为 EDC］MES 缓冲液。涡旋混匀。
    9. 室温下，使用带管架附件的涡旋振荡器覆盖并摇动20分钟，转速为1000 rpm。
    10. 磁力分离60秒，移除上清液。
    11. 重悬于 500 µPBS 1 L，涡旋混匀，磁力分离60秒，弃上清液。重复一次。
    12. 重悬于 250 µ来自步骤 2.1.2 的 L 抗体溶液。涡旋。
    13. 室温下在涡旋振荡器上以1000 rpm振荡孵育2小时。
    14. 加入500 µ加入1 mL PBS至磁珠中，涡旋混匀，磁力分离60秒，弃上清液。
    15. 加入 750 µL 1% BSA 的封闭/储存（B/S）缓冲液（PBS，pH 7.4，含 0.01% NaN3）。盖上盖子，室温下以1000 rpm振荡孵育30分钟。
    16. 磁力分离60秒，移除上清液。用100 μL重悬。 µB/S 缓冲液的 L
    17. 4°C 保存 °C. 磁珠储存超过一年后仍可成功用于QMI实验，但尚未正式确定其保质期或有效期。NaN3 B/S缓冲液中的成分应能抑制细菌生长。
    18. 通过染色约0.25验证磁珠偶联 µL 的偶联磁珠，加入荧光标记的抗宿主物种二抗，在流式细胞仪上检测，步骤同 1.1.5。
  2. 生物素标记
    1. 确保抗体溶于不含载体蛋白的 PBS 中。
    2. 计算总量 µ待生物素标记的抗体（100-200 μg） µ建议用于多重检测，25-50 µg 推荐用于筛选。
    3. 制备新鲜的 10 mM sulfo-NHS-biotin（可通过加入 224 µ升 ddH₂O2O至1 mg无称量管）。
    4. 加入1 µ25 每 10 毫摩尔/升磺基-NHS-生物素的升数 µg 抗体，涡旋振荡或用移液器吹打混匀。
    5. 室温孵育1小时。
    6. 4°C 下孵育 °C 反应 1 小时。
    7. 使用30 kDa离心滤膜去除未结合的生物素并终止反应。加入500 µL 的 PBS 并离心柱子直至达到最小体积。加入 500 µ额外加入 L 的 PBS，共进行 3 次缓冲液置换。
    8. 通过测量1-2的吸光度来估算浓度 µ在分光光度计上测定浓度，然后将抗体浓度调整至 0.5 mg/mL。
    9. 4°C 保存 ˚C.

3. 定量多重免疫沉淀

  1. 板式布局
    注意：本实验在使用96孔板并设置2-4个样本条件时效果最佳。
    1. 务必在同一块板上运行适当的对照（即刺激细胞与未刺激细胞），以检测不同条件之间的变化。每个样本应在板上水平分布，每列使用不同的探针抗体。每种探针的技术重复应紧随第一组实验立即进行。参见 图3 以作示例。
    2. 仔细记录板布局，以便准确进行板加载和分析。
  2. 样品制备 & 免疫沉淀（第1天）
    1. 在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的适当去垢剂中裂解组织或细胞，并在冰上孵育15分钟。始终注意保持裂解液处于低温状态。
      注意：起始生物材料的确切用量和裂解液蛋白浓度必须通过实验确定，引言第三段中列出了先前使用过的样本的一些示例。通常情况下，在200 µ每份样本2 mg/mL蛋白浓度的上样量在以往针对20个免疫沉淀靶点和20个探针靶点的实验中已取得成功，但针对每种抗体组合及细胞或组织类型的最佳上样量需通过实验确定。
    2. 4℃下离心 °C，15 分钟，16,000 x g 去除膜和碎片；保留上清液作为裂解液。
    3. 使用BCA法或类似方法测定蛋白质浓度，然后对各样本间的蛋白质浓度进行归一化处理。若使用细胞，可从每种条件下相同数量的细胞开始，则归一化为可选步骤。
    4. 制备主磁珠混合液，使每孔含有约250个每类磁珠。在数据分析后调整磁珠数量，以便在后续实验中每孔每类磁珠的读数平均为110个。
      注意：示例计算：（新珠体积）= [（运行平均值）/ 110] ×（先前珠体积）。应每隔约8次运行或根据需要以这种方式调整珠体积。通常为3-4 µ每次2孔实验使用上述制备的磁珠各1 L。
    5. 用磁力分离法在 FlyP 缓冲液中洗涤磁珠混合物 2 次，然后重悬于 FlyP 缓冲液中。重悬时使用 10 µ每样品每孔 L。FlyP 缓冲液为 100 mM NaCl、50 mM Tris（pH 7.4）、1% BSA、0.01% NaN3.
    6. 充分涡旋振荡磁珠混合液后，分装10 µ将等体积的裂解液（浓度已归一化）加入预冷的微量离心管中（每份样本一管），置于冰上。
    7. 将裂解液-磁珠混合物分装至每块板对应的试管中；例如，对于两块板的实验，将裂解液分装至两个试管中。将试管置于4 °C旋转仪上。 °4°C 过夜进行免疫沉淀，避光覆盖。
  3. 运行实验（第2天）
    1. 从第1块板的裂解液-磁珠管开始。使用磁珠架将裂解液从磁珠中移除，并保留裂解液用于后续分析。用500 μL洗涤缓冲液将磁珠洗涤2次。 µ冰冻 FlyP 缓冲液。始终保持离心管置于冰上或 4℃ °C.
    2. 计算重悬体积：（探针数量）×（2个技术重复）×（25） µ每孔体积（L）× 1.1（考虑移液误差）。用计算体积的预冷 FlyP 缓冲液重悬免疫沉淀物。
    3. 在轻轻吹打使磁珠充分重悬后，分装25 μL µ每孔加入 L，置于冰上，使用平底 96 孔板。
    4. 在另一个96孔板中，用FlyP缓冲液将生物素化探针抗体稀释至2倍工作浓度（工作浓度通常为1:100或1:200，需通过实验确定），使其排列顺序与板布局的列相对应（参见 图3）。工作浓度下探针抗体的最终体积为50 µ每孔 L，因此每种 2x 抗体的制备体积应为 (25 µL) ×（生物学重复样本数量）×（2 次技术重复）×（1.1，用于移液误差）
    5. 使用多通道移液器分配 25 µ将每种探针抗体稀释液各 L 加入含磁珠的检测板中。
    6. 在水平板式振荡器上振荡以混匀并重悬磁珠，随后于4℃孵育 °4°C 条件下避光振荡孵育 1 小时，转速为 450 rpm。
    7. 在4℃下，使用磁性板洗涤仪用FlyP缓冲液洗涤3次 °C.
    8. 将磁珠重悬于 50 µ1:200 链霉亲和素-PE 的 L
    9. 振荡混匀并重悬磁珠，随后于4℃孵育 °4°C 下避光振荡孵育 30 分钟，转速为 450 rpm。
    10. 在4℃下，使用磁力板洗涤仪用FlyP缓冲液洗涤3次 °C.
    11. 重悬于 125 µL 的 FlyP 缓冲液。
    12. 以900 rpm振荡1分钟，充分重悬磁珠。
    13. 在冷藏流式细胞仪上运行（参见示意图） 图 S1）。使用 "高 RP1 靶标" 在流式细胞仪软件中设置每区域1,000个微球的终止条件（远超过任一单个孔中应有的微球数量，以防止仪器提前停止）以及80 μL的上样体积 µL.
    14. 在运行至一半时暂停，重悬磁珠以防止沉降。
    15. 以 .xml 格式导出数据文件。
    16. 对剩余的板重复上述步骤，从步骤 3.3.1 开始。

4. 数据分析

注意：ANC 代码的设计目的是基于 N = 4 次实验，对两种条件进行比较，每次实验中每种条件包含 2 个技术重复。例如，细胞被独立刺激四次，在四天不同的实验中分别对对照（未刺激）和刺激后的细胞进行 QMI 检测，每种条件均设置如上所述的技术重复，随后按照下文所述方法进行数据分析。

  1. 自适应非参数检验（含可调 alpha 截断值）
    1. 打开 MATLAB，将当前工作目录设置为包含 ANC 程序组件以及流式细胞仪导出的 .xml 文件的文件夹。
    2. 填写 "ANC输入" 文件以反映实验设计的详细信息。随附示例文件中包含的 补充文件 已预先填写以运行提供的示例数据。
    3. 运行程序后，将在当前目录中生成一个 .csv 文件。该文件报告在对照组与实验组之间显著差异的 PiSCES，差异显著性水平（假阳性率，alpha）为 0.05，且在全部 4 次实验重复中均显著，或至少在 3/4 次重复中显著。
    4. 注意“ANC命中”' 定义为在至少3个实验重复中具有显著差异的PiSCES，表示为3/4∩4/4，用于步骤 4.3.1
  2. 加权相关性网络分析23 （CNA）
    1. 将 Matlab 输出的数据文件末尾的列标题进行粘贴-转置操作 "_MFI.CSV" 到新 Excel 工作表的第一行。添加下列各列 "实验" 实验编号，以及 "处理"，用于实验处理或其他任何待分析变量。将此文件另存为 "性状.csv".
    2. 打开 R Studio 并将工作目录设置为包含相关文件的文件夹 "_MFI.CSV" 和 "TRAITS.CSV" 文件。
    3. 按照注释命令文件中的指示以及随文件提供的详细说明运行 R 命令。与各实验性状显著相关的 WCNA 模块将以图形文件形式输出，并输出每个相互作用免疫沉淀（IP）的相关性i探针J 每个模块均以 .csv 文件格式输出。
    4. 注意“CNA命中”' 即被定义为具有模块成员度（MM）的相互作用 > 0.7 和 p < 0.05，用于步骤4.3.1中判断是否属于与目标实验变量显著相关的模块。
  3. 阳性“命中”' & 可视化
    1. 对于相互作用网络中的每一个相互作用 "3/4∩4/4 阳性结果" 在ANC输出文件（来自步骤4.1.4）列出的相互作用中，确定该相互作用是否也是一个 "CNA 命中" 通过检查CNA输出文件（见步骤4.2.6），创建一个新列以指示每个ANC命中是否同时也是CNA命中。
    2. 计算平均对数2 每个ANC的倍数变化值∩通过取 ANC 输出电子表格中给出的数值的平均值来确定 CNA 峰值 "_Hits.csv" 从步骤 4.1.3 开始。将数值转换为对数2 在取平均值前计算倍数变化。对于仅在4个重复样本中的3个中显著的相互作用，删除离群值。
    3. 创建一个包含每个 ANC 的电子表格∩CNA靶点在一列中列为IP，第二列中列为探针，第三列中为倍数变化值。使用此电子表格，通过将文件作为网络导入Cytoscape来创建节点-边图。

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结果

抗体筛选
图 2B 展示了对 Connexin36 蛋白进行筛选的结果。大多数 IP 探针（IP_probe）组合在 IgG 对照组中未产生信号。使用单克隆抗体 1E5 进行免疫沉淀（IP），并用 1E5 或多克隆抗体 6200 作为探针时，与 IgG 对照组相比，微珠分布出现向右偏移。此处选择 IP 使用 1E5、探针使用 6200poly，以避免将同一抗体同时用于 IP 和探针，这既能降低非特异性蛋白被两种独立抗体识别的可能性，也能通过不同表位提高检测到共结合相互作用的概率。最佳选择是 IP 与探针组合的平均荧光强度（MFI）至少比 IgG 对照组高出 1–2 个对数级；但若无其他可用组合，也可考虑使用 MFI 较弱但仍能稳定区别于对照组的抗体对。图 2C 展示了 1E5-6200poly 组合的特异性验证实验结果。转染 Connexin36 质粒的 293 细胞裂解液导致微珠分布向右偏移约 1.5 个对数...

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讨论

QMI 检测需要在抗体组合开发、仪器设备和试剂方面投入大量资源，但一旦建立该检测方法，即可获取高维度数据，用于观察蛋白质相互作用网络在实验可控刺激下的响应情况。从技术上讲，QMI 要求精确的移液操作以及对样本和抗体孔位的仔细追踪。仔细标记检测板非常有帮助，同时建议在纸上绘制详细的孔位模板，并在后续数据分析时保留使用。始终保持微球和裂解液处于低温状态至关重要，包括在流式细胞仪微孔板载架中也应如此（定制制冷操作说明见图 S1），这一点再怎么强调也不为过。蛋白质相互作用在室温下会迅速解离，早期尝试使用未经改造的室温流式细胞仪时，结果仅鉴定出许多对温度敏感的相互作用，而未能检测到随预期刺激发生变化的相互作用。

QMI 是一种基于抗体的检测方法，因此抗体的初始选择至关重要。应尽可能使用单克隆或重组抗体，以减少结果的变异性。多克隆抗体存在批间差异，但针对短表位的肽段来源多克隆抗体在时间上相对稳定。通过一次性购买大量抗体可最大限度减少批间漂移；这种方法还支持定制无载体蛋白的抗体，从而避免使用 Melon Gel 和离心柱进行抗体纯化，以及由此带来的抗体损失。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者希望感谢 Tessa Davis 在 QMI 检测方法开发中的重要贡献，并感谢 Smith 实验室和 Schrum 实验室现任及前任成员提供的技术指导和学术支持。本研究由美国国立精神卫生研究院（NIMH）资助，项目编号为 R01 MH113545 和 R00 MH102244。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔平底板Bio Rad171025001
96孔PCR板VWR82006-704
Bioplex 200系统（带HTF）Bio Rad171000205经改装以实现部分冷藏，详见图S1
Bio-Plex Pro洗涤站Bio Rad30034376
BSASigma
CML磁珠InvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex微球LuminexMC12xxx-01xxx为3位数微球区域编号
Melon Gel IgG离心纯化试剂盒Thermo Scientific45206用于抗体纯化
MESSigmaM3671
微孔板密封膜（非无菌）USA Scientific2920-0000
磷酸酶抑制剂混合液#2SigmaP5726
蛋白酶抑制剂混合液SigmaP8340
三明治制备冰箱NorlakeSMP 36 15用于Bioplex 200系统的定制冷藏
氟化钠Sigma201154
正钒酸钠Sigma450243
链霉亲和素-PEBioLegend405204
Sulfo NHSThermo ScientificA39269
TrisFisher ScientificBP152

参考文献

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23(2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807(2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7(2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48(2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722(2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559(2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

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