在本报告中，我们描述了一种简单的方法，通过将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与目的蛋白共转染，以研究胚胎大鼠皮层神经元的神经突生长。
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方法文章
基于增强型绿色荧光蛋白的原代神经元 neurite 生长研究方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
神经突生长是神经系统发育过程中神经回路形成的基本事件。严重的神经突损伤和突触功能障碍发生在多种神经退行性疾病及与年龄相关的退行性病变中。研究调控神经突生长的机制，不仅有助于深入理解脑发育过程，也将为这些神经系统疾病提供重要线索。由于转染效率较低，目前在原代哺乳动物神经元中研究特定蛋白质对神经突生长的影响仍具挑战性。本文介绍一种简单的方法，通过将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与目的蛋白（POI）共转染至原代大鼠皮层神经元，以研究神经突生长。该方法可通过EGFP信号识别成功转染POI的神经元，从而精确评估POI对神经突生长的影响。这种基于EGFP的检测方法为研究调控神经突生长的信号通路提供了一种便捷的途径。
引言
神经突，包括轴突和树突，是神经元的突起结构，参与神经网络的建立。神经突的动态生长对神经发育至关重要。然而，其背后的调控机制仍不明确。特别是，在多种神经退行性疾病以及脑损伤后，常可观察到神经突的损伤1。因此，研究假定分子在各种神经突生长调控通路中的作用，将有助于加深我们对该过程的理解，还可能揭示多种神经系统疾病的新型治疗靶点。神经元细胞系是研究神经元过程（包括神经突生长）的有价值模型，因其易于操作和转染2,3。然而，已有报道指出，某些常用细胞系会发生遗传漂变，可能导致其生理反应出现差异4。此外，神经元细胞系与原代神经元之间的蛋白质表达存在差异。例如，PC12是一种源自大鼠肾上腺的神经元细胞系，广泛用于神经突生长的研究2,3，但其不表达NMDA受体5。此外，有研究提出，与原代神经元相比，小鼠神经母细胞瘤细胞系neuro-2a对神经毒素的反应性较低，原因在于其缺乏某些膜受体和离子通道的表达6。因此，原代神经元是研究神经突生长更为理想且具代表性的模型。然而，原代神经元的应用受限于其较低的转染效率
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方案
所有操作均遵循香港中文大学动物实验伦理委员会的伦理标准。
1. 盖玻片的准备
- 将一个无菌的18 mm圆形盖玻片放入12孔细胞培养板的每个孔中。
- 在湿润的37 °C培养箱中，用5 µg/mL的多聚-D-赖氨酸溶液覆盖盖玻片，孵育至少1小时。
- 吸除细胞培养板中的多聚-D-赖氨酸溶液，并用无菌水将已包被的盖玻片冲洗一次。
2. 大鼠胚胎神经元解剖
- 通过颈椎脱位或 CO2 窒息法处死妊娠 18 天（E18）的 SD 大鼠。
注意：请查阅当地关于妊娠大鼠处死的相关规定。 - 使用解剖剪打开妊娠大鼠的腹腔，并将子宫转移至一个 10 cm 的培养皿中。
- 用小型解剖剪小心地打开子宫和羊膜囊，用小型解剖剪去除大鼠胚胎的胎盘。用一对小型镊子将整个胚胎转移至含有预冷的葡萄糖磷酸盐缓冲液（PBS-葡萄糖，含 10 mM 磷酸钠、2.68 mM 氯化钾、140 mM 氯化钠和 3 g/L 葡萄糖）的 10 cm 培养皿中。
- 沿颅骨矢状缝剪开，并用一对小型解剖剪小心地打开颅骨。用小型平头刮匙将胚胎脑组织转移至含有冰冻 PBS-葡萄糖的 10 cm 培养皿中。
- 在解剖显微镜下，使用两把 #5 镊子将两个大脑....
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结果
为了验证该方法，我们使用了细胞松弛素D（Cyto D）和神经生长因子（NGF），二者分别被证实可抑制和促进神经突生长14,15,16。将转染了EGFP的神经元经Cyto D或NGF处理后，测量其神经突长度。EGFP转染神经元的效率为2.7%（共计数1,068个神经元）。如图1A所示，Cyto D以剂量依赖的方式抑制神经突延伸。相反，经NGF处理的神经元中神经突生长得到显著增强（图1B）。
接下来，我们通过转染神经元衔接蛋白 FE65 来评估该系统的实用性，已有研究表明 FE65 可促.......
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讨论
如前所述，PC12细胞及其亚克隆被广泛用于研究神经突延伸，因为它们具有优异的转染效率2,3。相比之下，原代神经元的转染率较低，这成为通过转染研究神经突生长调控因子的主要障碍7。在此，我们描述了一种用于定量分析原代神经元中神经突生长的简便方案。尽管总体转染效率较低，但超过80%的已转染神经元成功共转染了两种蛋白：FE65和EGFP（图2A）。因此，通过分析EGFP标记的神经元，可精确确定FE65对神经突生长的影响（图2B）。
所述基于EGFP的方法的另一个优势是可省去免疫荧光染色步骤。在研究神经突延伸时，通常采用神经元特异性III类β-微管蛋白（Tuj 1）的免疫荧光染色作为形态学标志物18
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披露
作者声明，他们对本文内容不存在利益冲突。
致谢
本工作获得了香港研究资助局、香港健康与医学研究基金、香港中文大学直接资助计划、联合书院捐赠基金以及TUYF慈善信托基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #5 镊子 | Regine | 5-COB | |
| 18 mm 圆形盖玻片 | Thermo Scientific | CB00180RA | 使用前灭菌 |
| B27 添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 细胞松弛素 D | Invitrogen | PHZ1063 | 溶于 DMSO |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 解剖剪刀，10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| 解剖剪刀，12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree 质粒大提试剂盒 | QIAGEN | 12362 | |
| 荧光封片介质 | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S 天然小鼠蛋白 | Gibco | 13257019 | |
| Nugent 通用镊，10 mm，直头 | World Precision Instruments | 504489 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | 请参见参考文献 8 和 15 | ||
| PBS 片剂 | Gibco | 18912014 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| 刮勺 | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红 | Gibco | 25300062 | |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Gibco | 15250061 |
参考文献
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R.
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重印与许可
